Oddelek za fiziko. Seminar 1. letnik, II. stopnja. Dvofotonski procesi. Avtor: Jaka Mur Mentor: izred. prof. dr. Igor Poberaj. Ljubljana, oktober 2011

Transcription

1 Oddelek za fiziko Seminar 1. letnik, II. stopnja Dvofotonski procesi Avtor: Jaka Mur Mentor: izred. prof. dr. Igor Poberaj Ljubljana, oktober 2011 Povzetek Proučevanje nelinearnih optičnih procesov se je začelo z razvojem laserjev. Dvofotonska absorpcija je proces s kvadratično odvisnostjo od intenzitete vpadne svetlobe. Močno fokusirani laserski snopi omogočajo izkoriščanje procesa za tridimenzionalno fluorescenčno mikroskopijo in fotolitografijo. Mikroskopija omogoča 3D slikanje notranjosti živih organizmov, litografija pa izdelavo drobnih topološko kompleksnih struktur s podrobnostmi na skali stotih nanometrov.

2 Kazalo 1 Uvod Fizikalne osnove Eno- in dvofotonska absorpcija Gaussovi snopi Laserji Mikroskopija Litografija Zaključek Literatura Uvod Leta 1931 je ameriška teoretična fizičarka Maria Göppert-Mayer v svoji doktorski dizertaciji predvidela koncept dvofotonske vzbuditve. To pomeni, da v dvonivojskem sistemu absorpcijo enega fotona z energijo, ustrezno energijski reži, zamenjata dva fotona s polovično energijo. Oba procesa absorpcije povzročita isti rezultat, prehod elektrona iz osnovnega v vzbujeno stanje. Kmalu po izumu laserja v letu 1960, je Wolfgang Kaiser opazil predvideni proces v kristalu CaF 2 :Eu 2+. Še naslednjih 30 let je trajalo do demonstracije prve uporabne vrednosti procesa, dvofotonske mikroskopije. Gre za neinvazivno tridimenzionalno metodo slikanja, kar je posebej uporabno za biološke vzorce, saj lahko brez poškodb gledamo izbrano plast znotraj vzorca. [1] Slika 1: Enofotonska absorpcija pri valovni dolžini svetlobe 380nm in dvofotonska absorpcija pri fotonih s polovično energijo. Objektiva sta enaka, vidi se skladnost goriščne ravnine. [2] 2

3 Dvofotonska absorpcija je optično nelinearen proces, verjetnost za absorpcijo je odvisna od kvadrata intenzitete vpadne svetlobe. To povzroči, da lahko s fokusiranjem snopa fluorescentno barvilo vzbujamo zgolj v majhnem volumskem pikslu (vokslu) v okolici gorišča, kjer je intenziteta svetlobe največja. Tridimenzionalna fotolitografija je postopek, pri katerem znotraj fotoobčutljive snovi sprožimo polimerizacijo le znotraj majhnega voksla. Na izbrani podlagi je nanešena plast fotoobčutljivega materiala, ki ga nato osvetlimo po določenem 3D vzorcu z direktnim laserskim osvetljevanjem. Aktivni del materiala tvorijo fotoiniciatorji in monomeri, ob osvetlitvi poteka polimerizacija. Obdelani material postane odpornejši ali občutljivejši na nadaljnjo obdelavo in z odstranitvijo ustreznega dela materiala ostane samo željena struktura. Klasičen postopek je dvodimenzionalna fotolitografija, namenjena izdelavi tiskanih vezij, čipov in drugih dvodimenzionalnih sistemov. Osvetljena je celotna globina materiala, polimerizacija steče s procesom enofotonske absorpcije, geometrijski vzorec se ustvari preko litografske maske ali z direktnim laserskim osvetljevanjem. Slika 2: Členi v verigi so topološko povezani, niso pa direktno pritrjeni na podlago. Strukturo bi bilo zelo nepraktično poskusiti ustvariti z dvodimenzionalno litografijo po plasteh. [3] 2 Fizikalne osnove 2.1 Eno- in dvofotonska absorpcija Klasični optični pojavi so napovedljivi z reševanjem Maxwellovih enačb. Za popoln opis odziva snovi na zunanje električno polje moramo poznati polarizacijo kot funkcijo električnega polja. Enofotonska absorpcija pomeni, da nosi en foton zadostno energijo za prehod elektrona iz osnovnega v vzbujeno stanje in je optično linearen proces. Za opis procesa zadošča vpeljava polarizacije za linearen odziv snovi:, kjer je 3

4 Število vzbujenih elektronov na časovno enoto je odvisno od številske gostote elektronov v osnovnem stanju in števila vpadnih fotonov, odvisnost od intenzitete je linearna: Slika 3: Del slike (a) prikazuje enofotonsko vzbuditev, (b) pa dvofotonsko. [4] Dvofotonska absorpcija je optično nelinearen proces. Ker morata isti elektron praktično hkrati vzbuditi dva fotona, je verjetnost za ta proces znatna šele pri visokih intenzitetah. Prvi foton vzbudi elektron na kratkoživi virtualni vmesni nivo. V razpadnem času tega vmesnega stanja,, mora elektron vzbuditi še drug foton, da lahko konča v vzbujenem stanju. Za opis polarizacije snovi, ki ustreza dvofotonski absorpciji, je potrebno zapisati še dva nelinearna člena v razvoju izraza za polarizacijo po potencah : Susceptibilnostni tenzor tretjega reda je enak nič v snoveh z inverzijsko simetrijo in tam predstavlja prvi red nelinearnosti. V takih snoveh opazimo dvofotonsko absorpcijo, zato dvofotonska absorpcija ne more biti odvisna od sodih potenc in je prvi red, ki opiše dvofotonski proces, člen. Matematično gledano ima kot tenzor četrtega reda neodvisnih komponent, vendar je v snoveh s centrom inverzije od nič različnih samo, od tega so neodvisne. [5] Za dvofotonsko absorpcijo in nadaljnje n-fotonske procese je verjetnost odvisna od ustrezne potence intenzitete svetlobe, kjer je število hkrati absorbiranih fotonov: Ta lastnost omogoča tridimenzionalni nadzor lokacije volumna, v katerem poteka proces dvofotonske absorpcije. Z laserskim žarkom svetimo skozi izbrani material s takim laserskim snopom, da je zadostna intenziteta dosežena samo v zelo majhni okolici gorišča. Dobljeni efekt je viden na sliki 1. 4

5 2.2 Gaussovi snopi Za razumevanje fokusiranja in razširjanja laserskih žarkov je potrebno povedati nekaj o Gaussovih snopih. Električno polje vzdolž osnovnega Gaussovega snopa opisuje enačba: [6] ( ) ( ) ( ) V tej enačbi sta in cilindrični koordinati, je polmer grla snopa, je velikost valovnega vektorja in Gouyev fazni premik. Funkcija ( ( ) ) opisuje ukrivljenost valovne fronte pri izbrani koordinati, razširjanje snopa v smeri vzdolž propagacije opisuje ( ( ) ), ki vsebuje podatka o širina grla snopa in Rayleighjevi dolžini. Rayleighjeva dolžina je območje počasnega razširjanja snopa pred in za grlom, na sliki 4 označeni z. S tem poda najpomembnejše podatke o snopu. Slika 4: Presek snopa z oznakami količin. [7] Funkcijska odvisnost intenzitetnega profila se ohranja, ne glede na mesto opazovanja vzdolž snopa. S fokusiranjem nam to omogoča natančnejšo določanje tridimenzionalne krajevne lokacije dvofotonskega procesa. S primerno izbiro intenzitete dosežemo, da proces poteka samo v bližini gorišča vzdolž širjenja snopa in samo na majhni okolici vrha Gaussove funkcije v prečni smeri. Slika 5: Odvisnost intenzitete Gaussovega snopa od širine v grlu in točkah, oddaljenih z R in 2z R. Na robu Rayleighevega območja (srednja krivulja) je maksimalna intenziteta samo še polovica maksimalne v grlu. 5

6 V prečni smeri to omogoča ločljivosti pod uklonsko limito, ki jo je prvi izračunal nemški fizik Ernst Karl Abbe že leta Uklonska limita je posledica uklona svetlobe in definira, da svetloba z valovno dolžino, ki potuje skozi sredstvo z lomnim količnikom in se oži s kotom, ne more ustvariti pike, manjše od Vrednost imenujemo numerična apertura in v moderni optiki dosega vrednosti do, kar omeji širino fokusirane točke na približno tretjino valovne dolžine. Znotraj laserskega snopa je profil intenzitete Gaussov, zato lahko za dvofotonske procese dosežemo ločljivost, boljšo od uklonske limite. 2.3 Laserji Laserji so omogočili prvo opazovanje dvofotonskih procesov in njihovo praktično uporabo. Glavna elementa v vsakem laserju sta optični resonator in sredstvo za ojačenje. Resonator tipično tvorita eno visoko odbojno in eno rahlo prepustno zrcalo, medtem ko je sredstvo za ojačenje in izvedba ojačevanja lahko zelo različna. Plinski laserji vsebujejo ampulo s plinom, v katerem vzbujamo atome z električnim tokom in dobimo plazmo. Sredstvo je lahko tudi v trdnem ali celo tekočem agregatnem stanju, ojačenje pa poteka tudi z močnimi klasičnimi svetili (bliskavicami) ali drugimi laserji. Slika 6: Shema sestavnih delov laserja. [8] Titan-safirni laser je dobil ime po viru optičnega ojačevanja, kristalu safirja dopiranem s titanom. Valovna dolžina teh laserjev je nastavljiva v območju od rdeče svetlobe pri valovni dolžini do bližnje infrardeče pri, najbolje delujejo okoli. Generirajo lahko izredno kratke, nekaj deset femtosekundne sunke. Optično črpanje tipično poteka z neprekinjenim zelenim laserjem. Na začetku razvoja so bili to argonski plinski laserji, ki oddajajo svetlobo valovne dolžine, danes so največkrat v uporabi frekvenčno podvojeni Nd:YAG laserji. Ojačevanje v Nd:YAG laserjih poteka v kristalu itrijevo aluminijevega garneta ( ), dopiranega z neodimom. Kristali so umetno proizvedeni, dopiranje tukaj pomeni, da so nekateri atomi itrija nadomeščeni z neodimovimi. Kristal najbolje absorbira svetlobo v območjih valovnih dolžin in. Za optično črpanje v vzbujena stanja so včasih uporabljali kriptonske in ksenonske plinske svetilke za zvezno delovanje ali bliskavice (flashtubes) za sunkovno, danes so plinska svetila največkrat nadomeščena z diodami ( ). 6

7 Nd:YAG laser oddaja svetlobo valovne dolžine. Zeleno svetlobo pri generiramo tako, da podvojimo frekvenco in s tem razpolovimo valovno dolžino. Podvojevanje frekvence je še en nelinearen optični pojav. Efekt je drugega reda, torej odvisen od nelinearne susceptibilnosti, kjer polarizacijo v snovi zapišemo kot. Efekt je opazen šele pri visokih gostotah svetlobnega toka, vendar se da doseči izkoristke konverzije nad že pri moči nekaj. S primerno izbiro polarizacij in dvolomnega kristala z neničelnim dosežemo še ujemanje faz med različnimi valovnimi frontami valovanja z dvojno frekvenco, ki nastaja znotraj kristala. Zanimiva rešitev, predvsem vodenja laserske svetlobe, so vlakenski (fiber) laserji. Delujejo precej drugače kot plinski ali kristalni laserji. Celoten postopek ojačevanja in optičnega črpanja se dogaja znotraj optičnega vlakna. Radialno je tako vlakno sestavljeno iz treh koncentričnih plasti. Zunanja zaščita skrbi, da svetloba ostaja znotraj vlakna, po večinskem delu jedra potuje vzbujevalna svetloba, običajno iz laserskih diod, v sredici vlakna pa nastaja laserski žarek. Sredica vlakna je dopirana z enim od elementov iz skupine redkih zemelj, na primer itrijem, neodimom ali erbijem. Klasičen resonator ima dve zrcali, v vlakenskem laserju je vsako nadomeščeno s periodično spreminjajočim se lomnim količnikom v vlaknu. Tako je za ozko območje valovnih dolžin izpolnjen Braggov pogoj (fiber Bragg grating) in pride do odboja laserske svetlobe. Laserji tega tipa so v primerjavi z ostalimi manj občutljivi na zunanje vplive. Zaradi praktično poljubne dolžine vlakna in s tem dolgega območja ojačevanja, dosegajo celo kilovatne moči pri konstantnem delovanju. Slika 7: Črpanje z zelenim laserjem in kristal Al 2 O 3, v katerem poteka ojačevanje pri titan-safirnem laserju. [7] Kratki pulzi iz pulznih laserjev nastanejo kot posledica interference med različnimi vzdolžnimi valovnimi načini v resonančni votlini. V najpreprostejšem idealiziranem primeru so valovni načini stoječi valovi med dvema ravnima zrcaloma. Njihove frekvence so enakomerno razmaknjene za, kjer je dolžina resonatorja. Celotno električno polje v neki točki v laserju lahko zapišemo kot [6] 7

8 je število vseh stoječih nihanj, in sta amplituda in faza za vsako posebej. Zaradi enostavnosti računa privzemimo, da so vse faze in amplitude enake. Vsoto lahko preprosto seštejemo in dobimo Izhodna moč je tako [6] [6] Tako ujemanje faz predstavlja periodično zaporedje sunkov s periodo. [6] Laser oddaja svetlobo v zelo kratkih sunkih s širino in ostane v tem načinu delovanja - 'mode-locked'. Frekvenca sunkov titan-safirnega laserja je običajno okoli pri čemer je vsak sunek dolg okoli Predpostavka o enakih amplitudah ni bistvena, vpliva samo na točno obliko sunkov. Pomembnejša je predpostavka o enakih fazah, saj morajo biti faze enake ali linearno povezane kot. V realni izvedbi laserja mora biti posebej poskrbljeno za tako uklepanje faz. 3 Mikroskopija Fluorescentno barvilo, v katerem poteče enofotonska absorpcija pri valovni dolžini, je možen kandidat tudi za dvofotonsko absorpcijo pri valovni dolžini. Kljub temu, da gre kvantno-mehansko za precej različna procesa, je svetloba, ki jo barvilo po prehodu odda, enake valovne dolžine v obeh primerih, saj molekula relaksira skozi vibracijske prehode do istega vzbujenega stanja pred emisijo fotona. Mikroskopiranje poteka s premikanjem fokusiranega laserskega žarka po izbrani goriščni ravnini. Uporablja se laserje, ki delujejo v bližnjem infrardečem področju, tipično titan-safirni laser. V območju valovnih dolžin med in ima optimalne lastnosti, vključno s pulznim delovanjem. Verjetnost za dvofotonske procese je majhna tudi pri visoki konstantni laserski moči. Rešitev so pulzni laserji, ki omogočijo potek dvofotonskih procesov in hkrati povprečna moč ostane majhna, primerna za uporabo v bioloških vzorcih. V primeru pulznega laserja je dvofotonski proces odvisen od povprečnega kvadrata intenzitete in ne od kvadrata povprečne intenzitete. Zveza s številom sunkov na sekundo in trajanjem sunka na polovični višini je kjer označuje integral intenzitete sunka in brezdimenzijski faktor, odvisen od oblike pulza. [1] Za primer pulza Gaussove oblike je vrednost. Primerjajmo pulzni laser s povprečno močjo in laser konstantne moči. Pri valovni dolžini in konstantni moči dobimo približno fotonov na sekundo. Razmerje predstavlja spremembo fotonskega številskega toka za pulzni laser in znaša. Verjetnost za dvofotonski proces se poveča sorazmerno s tem faktorjem, pulzni laser torej precej izboljša eksperimentalne pogoje. 8

9 Celoten sistem za dvofotonsko mikroskopijo lahko prikažemo shematsko, saj osnovnih sestavnih delov ni zelo veliko. Pulzni laser preko dvofotonske absorpcije povzroča fluorescenco, dve fotopomnoževalki zaznavata fluorescirane fotone. Zaželjeno je, da fotopomnoževalki zaznata svetlobo v čim večjem delu prostorskega kota. Leče in zrcala so namenjena vodenju laserske svetlobe do vzorca in fluorescirane svetlobe nazaj na fotopomnoževalki. Pomembni sestavni deli so še piezoelektrični ali galvanometrični premikalci zrcal za kontrolo pozicije žarka in en imerzijski objektiv (oil-immersion objective) s katerim dosežemo visoko numerično aperturo. Zajem slike poteka po principu vrstičnega skeniranja v posamezni ravnini vzorca. Valovna dolžina uporabljenega laserja omejuje ločljivost, s katero je določena gostota vrstičnega skeniranja. Slika 8: Shema sistema za mikroskopijo. [9] Največji interes za dvofotonsko fluorescenčno mikroskopijo je na področju raziskav bioloških vzorcev. Glavna prednost je uporaba infrardečega laserja, ki ob majhni povprečni moči lahko prodre nekaj sto mikrometrov globoko v živo tkivo. Dvofotonska vzbuditev na majhnem volumnu ne povzroča vzbujanja izven goriščne ravnine, kar zmanjša ozadje in zato olajša obdelavo slike. Resolucija v ravnini znaša pod, kar je pod uklonsko limito. Na sliki 9 so primeri posnetkov, ki prikazujejo tri najpomembnejše zmožnosti dvofotonske mikroskopije. Na posnetkih a in b vidimo hkratno vzbujanje različnih fluorescentnih barvil, od katerih vsako fluorescira s svojim značilnim spektrom. Na sliki a je v belih krvnih celicah podgane z zeleno obarvana plazemska celična membrana, modro je celično jedro, rdeče pike pa so mitohondriji. Sliki c in d sta posnetka v živem preparatu, prikazujeta dinamiko kalcija v vzorcu rakove hitinjače. Ostale slike so posnete v živi miši. Prvi trije posnetki prikazujejo pretok krvi, pri čemer lahko iz časa osvetlitve in povprečnega kota določimo hitrost krvničk, ki znese okrog. Iz smeri sipanja se v določenih primerih lahko ugotavlja tudi starost tkiva, na sliki i je z zeleno označeno prevladujoče sipanje nazaj, z rdečo naprej. Tkivo, ki sipa svetlobo naprej, je starejše. 9

10 Slika 9: Primeri posnetkov z dvofotonsko fluorescenčno mikroskopijo. [1] Zanimiva je primerjava metode s konfokalno fluorescenčno mikroskopijo, ki z uporabo zaslonke doseže tridimenzionalno ločljivost oziroma se pri slikanju določene plasti v vzorcu učinkovito znebi ozadja. V principu je izvedba podobna, saj s fluorescenčnih barvilom obarvan vzorec osvetlimo z laserskim virom, le da osvetlimo celotno dosegljivo globino. Fluorescirano svetlobo zajamemo, vendar z zaslonko pred detektorjem svetlobe izberemo, iz katere ravnine bo večina zajete svetlobe, kot je vidno na sliki 10. Globina tega območja je določena z uklonsko limito, torej ne moremo izbrati poljubno tanke plasti v vzorcu. Poleg tega v detektor pade nekaj svetlobe tudi iz vseh ostalih osvetljenih plasti vzorca. Tako ima dvofotonska mikroskopija prednost pri globinski ostrini že samo zaradi omejene aksialne eksitacije. Konfokalna mikroskopija je bila izumljena že leta 1955, danes obstajajo tudi že tehnike, ki ločljivost v ravnini izboljšajo pod mejo uklonske limite tudi za faktor 10. Slika 10: Shema delovanja konfokalnega mikroskopa. [7] Dvofotonska fluorescenčna mikroskopija ima določene omejitve. V splošnem je globina omejena predvsem zaradi sipanja nastalih fluoresciranih fotonov. To bi lahko izboljšali z večjo lasersko močjo, vendar so predvsem biološki vzorci občutljivi in je nujno poznavanje omejitev in efektov v posameznem biološkem sistemu. Pojavi se problem z doseganjem globine, saj se valovna fronta infrardečega laserja zaradi nehomogenosti v snovi hitro popači, kar onemogoči zadostno fokusiranje. Zaradi sipanja v bližini površine vzorca se zmanjša tudi kontrast, efekt pa se z večanjem valovne dolžine zmanjša. 10

11 4 Litografija Hiter razvoj nanotehnologije, biotehnologije in sorodnih področij v zadnjem desetletju vodi do vedno večjih zahtev po izdelavi mikro in nano objektov. Dvofotonska litografija je obetavna tehnika za izdelavo struktur, velikih nekaj mikrometrov, izdelanih z natančnostjo nekaj deset nanometrov. V splošnem je fotolitografija ali optična litografija proces, pri katerem preko maske osvetlimo željeni geometrijski vzorec v fotoobčutljivem materialu. Dvofotonska litografija se za začetek izogne uporabi mask, katerih izdelava je natančen in dokaj zapleten proces, posledično tudi drag. Podoben postopek je direktno lasersko osvetljevanje, za katerega je do nedavnega kazalo, da ga omejuje predvsem uklonska limita, vendar se da z določenimi triki zaobiti to ločljivostno mejo. Direktno lasersko osvetljevanje spada med tehnike za dvodimenzionalno fotolitografijo in je v praksi omejeno še z debelino materiala, ki ga obdelujemo. Zaradi širjenja Gaussovega snopa zato ni možno osvetliti cilindra s premerom enakim premeru grla snopa. Najpomembnejša lastnost materiala, namenjenega dvofotonskim procesom v litografiji, je optična prozornost v območju valovnih dolžin med in. S tem se izognemo pojavu linearne absorpcije med dvofotonsko polimerizacijo. Primerni materiali so sestavljeni primarno iz fotoiniciatorjev in monomerov. Fotoiniciator ob ustrezni osvetlitvi ustvari proste radikale, ki poženejo proces polimerizacije. Seveda je cilj polimerizirati samo izbrani volumen materiala, okoliškega pa pustiti čim bolj nedotaknjenega. Osnovna ponovljiva enota zapisovanja s tridimenzionalno litografijo je volumski piksel ali krajše voksel. Definiran je z volumnom, v katerem pride do dvofotonske polimerizacije, vendar lahko med osvetljevanjem tudi raste. Neželeni pojav je odvisen od moči laserja, katere naraščanje povzroča večanje voksla vzdolž smeri potovanja laserskega žarka. Voksel se sicer poveča v vseh smereh, vendar je večanje v aksialni smeri precej hitrejše kot v radialni [slika 5]. Drugi mehanizem narašča z večanjem časa osvetlitve in povzroča večanje voksla v radialni smeri, saj monomer v okoliškem materialu polimerizira ob stiku s polimerom, nastalim zaradi osvetljevanja. Zaradi kombinacije obeh efektov je potrebno delati pri najnižji možni moči in z najkrajšim časom osvetlitve. Slika 11: Levo je skulptura bika, bela črta na sliki je mera za 2μm, desno model Eifflovega stolpa. [10] 11

12 Japonski raziskovalci so leta 2001 ustvarili najmanjšo skulpturo bika na svetu, dolgo in visoko, slika 10. Uporabljena ločljivost je bila, da so lahko izdelali tudi najmanjše podrobnosti. Danes so tržno na voljo sistemi za 3D direktno lasersko strukturiranje, ki dosegajo podobne ali celo boljše rezultate, z ločljivostjo okrog. [10] Posebej bi omenil leta 2007 ustanovljeno nemško podjetje Nanoscribe. Kot prvi so razvili komercialno dostopen sistem za tridimenzionalno litografijo z direktnim laserskim pisanjem. Poleg takega namiznega sistema ponujajo tudi izbor fotoobčutljivih materialov, primernih za litografijo, vendar se izkaže, da tudi izbor materiala omejuje ločljivost postopka. Najbolj primerni imajo mejo pri okrog. Model Eifflovega stolpa je ustvarjen z njihovim sistemom. Slika 12: Slika in shema sistema podjetja Nanoscribe. [10] Tehnična izvedba je precej podobna sistemom za fluorescenčno mikroskopijo, z nekaterimi pomembnimi razlikami. Pomembno je določanje meje med substratom in fotorezistom, ki sta po fizikalnih lastnostih največkrat podobna materiala, sicer se lahko zgodi, da izdelana struktura ne bo pritrjena na podlago. CCD kamera je uporabljena kot nadzorni element. V rešitvi podjetja Nanoscribe je namesto titan-safirnega uporabljen pulzni vlakenski laser. Podobnosti z dvofotonsko fluorescenčno mikroskopijo obstajajo, saj je skupna točka pulzni laserski sistem, le valovna dolžina delovanja je pri litografiji tipično nekoliko krajša, okrog. Nadzor premikanja laserskega žarka je tako v primeru mikroskopije kot tudi litografije izveden s piezokontrolerji. Razlika je predvsem v uporabi tretje dimenzije, saj pri mikroskopiranju ločljivost vzdolž poti žarka uporabljajo za vpogled v globlje dele vzorca, medtem ko se za litografijo naredi tridimenzionalen načrt in se ga nato razreže v posamezne obdelovalne ravnine. 12

13 5 Zaključek Razvoj laserske tehnologije je v začetku devetdesetih let prejšnjega stoletja omogočil prvo eksperimentalno uporabo dvofotonske absorpcije v fluorescenčni mikroskopiji. Razvoj tehnik na področju mikroskopije in kasneje tudi optične tridimenzionalne litografije je že pred desetimi leti privedel do razširjene uporabe dvofotonske fluorescenčne mikroskopije predvsem v biologiji. Pred štirimi leti so razvili tudi prvi komercialno dostopni sistem za 3D fotolitografijo. Najnovejše raziskave se po eni strani usmerjajo v izboljšanje ločljivosti in razširjanja uporabnosti mikroskopije, hkrati pa kombinirajo različne pristope. Primer je enobarvna STED tehnika mikroskopije (STimulated-Emission Depletion), kjer z dvofotonsko absorpcijo vzbujajo elektrone in jih z enofotonsko stimulirano emisijo vračajo nazaj v osnovno stanje, oboje z enim samim laserskim virom. Bralec lahko najde več informacij o tehnikah fluorescenčne mikroskopije v seminarju Mete Kokalj z naslovom Izboljšanje ločljivosti pri fluorescenčni mikroskopiji. [14] Slika 13: Shema mikrofluidične črpalke z uporabo Arhimedovega vijaka in optične pincete za pogon. [11] Letošnja odkritja se navezujejo tudi na razvoj mikronaprav. Skupina raziskovalcev je predstavila Arhimedov vijak z radijem in dolžino. Ustvarjen je z dvofotonsko fotolitografijo, kar samo zase ne bi bilo posebno zanimivo, vendar so za pogon uporabili optično pinceto. Ker fotoni nosijo vrtilno količino, jo s primerno obliko laserskega žarka lahko prenašajo na snov, kar da drobnemu Arhimedovemu vijaku pogon in s tem možnost uporabe kot črpalke v mikrofluidiki. [11] Možnosti razvoja uporabe dvofotonskih procesov še zdaleč niso izčrpane, saj gre za relativno novo področje. Uporaba mikroskopije je že precej standardna v biologiji, možna je uporaba tudi večfotonskih procesov, ki so manj verjetni kot dvofotonski, a omogočijo še boljšo ločljivost. Tridimenzionalni fotolitografski obdelovalni postopki zaenkrat dobro služijo predvsem v raziskovalne namene in odpira nove razvojne možnosti v nanooptiki, izdelavi mikronaprav, mikro elektromehaničnih naprav in optičnem tridimenzionalnem zapisu podatkov. 13

14 6 Literatura [1] W. R. Zipfel, R. M. Williams, W. W. Webb, Nat. Biotechnol. 21, (2003). [2] vs two-photon excitation.html ( ). [3] ( ). [4] P.T.C. So, Two-photon Fluorescence Light Microscopy, Encyclopedia of Life Sciences (2001). [5] M. Bass, Handbook of Optics, Volume II Devices, Measurements and Properties (McGraw-Hill, 1995). [6] M. Čopič, Fotonika (skripta, Fakulteta za matematiko in fiziko, Univerza v Ljubljani, 2011). [7] ( ). [8] ( ). [9] F. Helmchen, W. Denk, Nat. Methods 2, (2005). [10] nanoscribe.de ( ). [11] C.-L. Lin et al, Optics Express 19-9, (2011). [12] K.-S. Lee et al, Recent Advances in Two-Photon Lithography, CIF'8 Proceeding, (2008). [13] W. Denk, J. H. Strickler, W. W. Webb, Science 248, (1990). [14] M. Kokalj, Izboljšanje ločljivosti pri fluorescenčni mikroskopiji (seminar, Fakulteta za matematiko in fiziko, Univerza v Ljubljani, 2011). 14