Termoforezna karakterizacija lastnosti molekul

Transcription

1 Fakulteta za matematiko in fiziko Seminar Ia Termoforezna karakterizacija lastnosti molekul Avtor: Mentor: dr. Natan Osterman Akademsko leto 2013/2014 Povzetek V temperaturnih gradientih se poleg neusmerjene difuzije zaradi razlik koncentracije pojavi tudi termodifuzija, ki je urejena oblika difuzije molekul vzdolž temperaturnih gradientov. Lastnosti termodifuzije oziroma termoforeze molekul se spreminjajo glede na njihovo okolico, značilnosti in vezavo, kar omogoča razvoj eksperimentalnih tehnik za njihovo določanje. Te tehnike so lahko izvedljive v realnih vzorcih, za njihovo delovanje pa poleg preprostega fluorescenčnega označevalca ni potrebno posegati v vzorec. Termoforezna karakterizacija lastnosti molekul je tako hitrejša in preprostejša od klasičnih metod, ki zahtevajo reakcijo označevalca z medijem, ter bolj zanesljiva od elektroforeznih tehnik, ki ne delujejo na nevtralnih molekulah.

2 Kazalo 1 Uvod 1 2 Termoforeza Teoretični opis termoforeze Vplivi konvekcije medija Vplivi lastnosti delcev na Soretov koeficient Eksperimentalne postavitve Mikro termoforeza Termična past s protitokom Radialna past Karakterizacija vezave molekul Vezava aptamer na proteine Vezava liposomov Zaključek 11 1 Uvod Difuzija je eden izmed osnovnih transportnih pojavov, ki jih srečamo v naravi. Prvi Fickov zakon pove, da je difuzija odvisna od gradienta koncentracije topljenca, ter tako teži k ravnovesnemu stanju z izenačeno koncentracijo povsod po prostoru. Difuzijski zakon lahko dopolnimo z dodatkom termodifuzije oziroma termoforeze, to je z gibanjem molekul v temperaturnih gradientih. V duhu difuzijskega zakona lahko Fickovemu zakonu torej dodamo člen s temperaturnim gradientom, ki ga obtežimo s termodifuzijsko konstanto. Razmerje med difuzijskim in termodifuzijskim koeficientom imenujemo Soretov koeficient [1]. Soretov koeficient je odvisen od temperature in lastnosti opazovanih gradnikov [2]. Njegov predznak določa, ali se gradniki gibljejo po temperaturnih gradientih navzgor ali navzdol, kar povzroči kopičenje ali izpraznjevaje gradnikov na zgornjetemperaturnem robu gradientnega območja. Na Soretov koeficient vplivajo tudi fizikalne lastnosti gradnikov, kar vodi do sklepa, da lahko te lastnosti povežemo s termoforezo, ter jih tako enostavno določamo [3],[4],[5],[6]. V seminarju bom najprej orisal termoforezo in predstavil teorijo, ki opisuje njen izvor. Opisal bom različne postavitve, ki omogočajo merjenje učinka termoforeze in karakterizacijo molekul oziroma opazovanih gradnikov. Med takšne postavitve sodi opazovanje flourescenčnega signala pri točkovnem gretju vzorca z laserjem in zastajanje molekul na območju temperaturnega gradienta v nasprotujočem toku medija. Osvetlil bom tudi nekatere lastnosti, kot so velikost in naboj, na podlagi katerih lahko molekule s pomočjo teh metod razločujemo. V zaključku bom predstavil rezultate dveh eksperimentov, izvedenih ob pomoči termoforeznih tehnik predstavljenih v seminarju, ki dobro ilustrirata moč termoforezne karakterizacije lastnosti molekul kot odlične analitske metode v bioloških sistemih. 1

3 2 Termoforeza Dolgo časa je znano, da poleg navadne difuzije v snovi opazimo tudi usmerjeno difuzijo molekul po temperaturnih gradientih. Takšno gibanje molekul je v svoji osnovi drugačno od urejenih usmerjenih gibanj, kot je npr. elektroforeza, pri kateri gre za gibanje molekul vzdolž električnih potencialov. Pri termodifuzijskem transportu je premikanje molekul posledica odmika povprečne smeri, medtem ko njihovo posamezno gibanje še vedno ni urejeno temveč je gnano z difuzijskim procesom [5]. Termoforezo oziroma gibanje molekul v temperaturnih gradientih opišemo z dodatnim fenomenološkim termodifuzijskim členom, ki razširi prvi Fickov difuzijski zakon, ter tako v njega vnese gornje ugotovitve [1] j D r c ` S T cp1 cq T s, (1) kjer smo vpeljali Soretov koeficient S T D{D T kot kvocient difuzijske D in termodifuzijske D T konstante. Dejansko gre za križni transportni pojav, saj razlika v temperaturi povzroči spreminjanje koncentracije delcev oziroma molekul. Pri majhnih koncentracijah opazovanih molekul c (cp1 cq c c 2 «c) in v stacionarnem stanju j Bc Bt 0 se zgornja enačba preprosto poenostavi v enačbo ravnovesne odvisnosti koncentracije [1] c c 0 e S T pt T 0q. Takšna distribucija v stacionarnem stanju pokaže osiromašenje oziroma nalaganje posameznih molekul kot posledico termodifuzije. V enačbi (1) smo vpeljali Soretov koeficient, oziroma termodifuzijsko konstanto, ki lahko zavzame tako negativne kot pozitivne vrednosti, ki nam omogočajo klasifikacijo dveh oblik termoforeze, ki se odražata tudi v stacionarni porazdelitvi (2). Če je Soretov koeficient negativen (S T ă 0) bo termoforetski tok delcev podan z drugim delom enačbe (1) kazal vzdolž temperaturnega gradienta, molekule pa bodo difundirale iz hladnejšega območja v toplejše. To obliko transporta imenujemo termofilna oziroma toploljubna termoforeza. V primeru da je Soretov koeficient pozitiven, S T ą 0, bo tok očitno kazal v nasprotni smeri gradienta, molekule pa se bodo zaradi termofobne oziroma hladnoljubne termoforeze pričele premikati iz toplejšega v hladnejše območje. Primer obeh smeri termoforeze so izmerili z molekulami DNA tako, da so z laserjem segrevali majhno območje v tanki plasti suspenzije. Tanka plast je omogočila, da je bil vpliv konvekcijskih tokov in tokov zaradi svetlobnega tlaka majhen. Takšen eksperiment prikazuje slika (1). Slika 1: Termofobna in termofilna termoforeza molekul DNA pri različnih temperaturah okolice. Območje vzdolž črk DNA je pri različnih temperaturah okolice segreto za 2 K. Molekule so označene s fluorescenčnim označevalcem, zato v termofilnem primeru levo na območjih akumulacije vidimo svetlejše črke. Pri enaki postavitvi na sobni temperaturi molekule postanejo termofobne, kar se vidi v zmanjšani svetilnosti izpraznjenih območij črk. Pojav obeh oblik pri enaki postavitvi potrdi termoforetično obnašanje, napram preprosti termični konvekciji zaradi raztezanja medija [2]. (2) 2.1 Teoretični opis termoforeze Oboroženi s fenomenološkim opisom termoforeze bi radi pridobili tudi teoretično predstavo o izvoru termoforetičnega gibanja. Izhajali bomo iz ravnovesnega pristopa, ki temelji na obravnavi spremembe v večih zaporednih ravnovsenih korakih. Takšen pristop nam omogoča, da ravnovesno porazdelitev koncentracij (2) prepišemo z uporabo Gibbsove proste entalpije v obliko c GpT q GpT 0 q k e B T, (3) c 0 kjer se prosta entalpija GpT q nanaša na en sam delec v topilu. Da zgornji pristop velja, morajo biti temperaturni gradienti majhni, manjši od T ă pas T q 1. Za majhna odstopanja koncentracije δc lahko 2

4 enačbi (2) in (3) razvijemo, kar nam da zvezi δc c S T δt, ki ju lahko povežemo v termodinamsko enačbo za izračun Soretovega koeficienta δc c δg k B T, (4) S T D T D 1 BG k B T BT. (5) Z upoštevanjem totalnega diferenciala Gibbsove proste entalpije v velekanonični obliki dg SdT ` V dp`µdn, kjer lahko drugi člen ob konstantnem tlaku zanemarimo, tretji pa v primeru obravnave enega delca odpade, se Soretov koeficient zapiše v direktni zvezi z entropijo sistema kot S T S k B T. (6) Problem teoretičnega določanja Soretovega koeficienta smo torej poenostavili na izračun entropije delca oziroma molekule v sistemu topila. Sklepanje do te točke je veljalo za splošne molekule, od sedaj pa se bomo v teoretičnem delu omejili le na obnašanje sfernih delcev. V topilu ima sferno simetričen nabit delec dva glavna prispevka k entropiji, prvega porodi ionsko senčenje naboja delca (slika 2 levo), drugega pa predstavlja hidracijska entropija, torej entropija kot posledica šibke vezave vodnih molekul na površino opazovanih delcev (slika 2 desno). Pri celotni obravnavi lahko meddelčne interakcije s predpostavko njihove majhne koncentracije zanemarimo. Eksperimentalno majhne koncentracije zaradi uporabe fluorescenčnih barvil ne predstavljajo večjih problemov [2]. Slika 2: Ionsko senčenje in hidracija delcev v elektrolitski raztopini. K energiji delcev oziroma molekul v raztopini prispevata tako ionsko senčenje, ki je posledica privlaka med nabitimi delci (levo), kot tudi hidracija, to je vezava vodnih molekul na delce preko šibkih vodikovih vezi [2]. Prispevek zaradi ionskega senčenja si najlažje predstavljamo kot energijo, shranjeno v kondenzatorju, ki ga tvorijo delec in ioni v mediju. Energija kondenzatorja se zapiše kot W Q 2 eff {2C, kjer je Q eff efektivni naboj, C pa kapaciteta ionskega kondenzatorja. Kapaciteta navadnega krogelnega kondenzatorja se zapiše kot C 4πɛɛ 0 b a, kjer lahko iz ulomka izpostavimo a2, skupaj z faktorjem 4π pa nam da ab površino kroglastega delca A. V ulomku ostane člen, povezan z velikostjo kondenzatorja. Na tej točki vpeljimo Debyjevo dolžino λ D, ki podaja mero za domet elektrostatske interakcije in je torej ravno podatek o velikosti ionskega kondenzatorja. Debyjevo dolžino izpeljemo iz Poissonove enačbe za električni potencial v raztopini nabitih ionov. Energijo kondenzatorja in Debyjevo dolžino torej zapišemo kot [2]: G ionska Q eff λ D 2Aɛɛ 0, λ D pt q c ɛɛ0 k B T 2e 2 c S, (7) kjer je dielektrična konstanta odvisna od temperature ɛ ɛpt q, c S pa predstavlja koncentracijo nabitih delcev v raztopini, ki senčijo naboj opazovanega delca. Uvedemo še efektivno površinsko gostoto naboja σ eff Q eff {A in odvajamo, kar nam da skupni ionski prispevek k Soretovemu koeficientu [2]: S ionski T Aβσ2 λ D 4ɛɛ 0 k B T 2, (8) kjer pride faktor β 1 T Bɛ ɛ BT od odvoda po temperaturi iz enačbe (5). Hidracijska entropija je pomemben parameter pri določanju lastnosti molekul, ki pa ga je težko meriti. Hidracijska entropija je povezana s hidracijsko energijo, to je energijo, ki se sprosti ob vezavi vodnih molekul na nabite delce preko vodikove vezi. Hidracijska entropija je pravtako parameter, ki določa topnost soli v vodi. Celotno hidracijsko entropijo lahko povežemo s površinsko hidracijsko entropijo s hidracijska S hidracijska {A, kar nam da po enačbi (6) hidracijski prispevek oblike [2]: S hidracijska T As hidracijskapt q. (9) k B T Ker imajo delci končno temperaturo moramo upoštevati tudi njihovo termično gibanje, ki bi moralo prispevati k energiji in posledično entropiji. Kakorkoli, entropija delcev zaradi Brownovega gibanja znaša 3

5 le S T 1{T «0.0034{K in jo zato zanemarimo, saj je mnogo manjša od ostalih prispevkov v Soretov koeficient. Skupaj sestavimo oba znatna prispevka, da dobimo končno formulo, ki povezuje Soretov koeficient z lastnostmi delca in raztopine S T A s hidracijska ` βσ2 eff kt 4ɛɛ 0 T λ D. (10) Na podlagi izvajanja ob izpeljevanju enačbe (10) hitro vidimo bistvo termoforeze. Termoforetično gibanje je povezano s fizikalnimi in kemijskimi lastnostmi na stiku med opazovanimi molekulami oziroma delci in medijem, v katerem so delci. Pri različnih temperaturah so lastnosti stika seveda drugačne, energija pa se spremeni. Ker delci težijo k najmanjši energiji se pričnejo v temperaturnem polju gibati tako, da je njihov stik z medijem kar najbolj energijsko ugoden. 2.2 Vplivi konvekcije medija Ker segrevamo majhno območje medija se zdi jasno, da moramo upoštevati tudi konvekcijo zaradi temperaturnih razlik. To storimo tako, da enačbo (1) uporabimo v kontinuitetni enačbi dc dt j, kjer moramo upoštevati še, da je časovni odvod v resnici hidrodinamski, saj se medij lahko premika dc dt Bc Bt ` vc. Oboje skupaj nam da popravljeno enačbo za spreminjanje koncentracije Bc Bt D r c ` S T cp1 cq T s vc, (11) v kateri je upoštevano vse bogastvo modela tekočine in opazovanih delcev. Hitrost tekočine v so določili z reševanjem Navier-Stokesove enačbe in upoštevanjem konvenkcije v numeričnih simulacijah [5]. Z numeričnimi simulacijami se je pokazalo, da so konvekcijski učinki na ravnovesno deplecijsko koncentracijo majhni (ă 0.57%), gibanje delcev v temperaturnem gradientu, ki ga opazimo v eksperimentih, pa je v resnici posledica termodifuzije in ne konvekcije medija [5]. Na misel pride tudi vpliv toplotnih tokov, ki tečejo pri vsakršni postavitvi s temperaturnimi gradienti. Toplotni tokovi predstavljalo eksperimentalno oviro, saj je potrebno vzorec na neki točki greti, na drugi pa je zato potrebno presežno toploto odvajati. Kar se tiče tremoforeze, v literaturi ni zaslediti, da bi toplotni tokovi kakorkoli vplivali na termoforetsko obnašanje. 2.3 Vplivi lastnosti delcev na Soretov koeficient V predhodnem razdelku smo izpeljali enačbo (10), ki nam omogoča spremljanje odvisnosti Soretovega koeficienta od nekaterih lastnosti delcev. Izkaže se, da predstavljeni model deluje dobro tudi za realne molekule, in ni omejen na sferične delce. Z natančnim spreminjanjem parametrov so preverili veljavnost omenjene enačbe preko več velikostnih redov, tako za sferne kroglice kot tudi za realnejše molekule [2]. Prvi učinek, ki ga omenimo, je odvisnost Soretovega koeficienta od koncentracije soli v raztopini. Z njenim padanjem se zmanjšuje senčenje, podaljša pa se doseg interakcij, kar se odseva v povečani Debyjevi dolžini. Ker je Soretov koeficient linearno zvezan z Debyjevo dolžino pričakujemo njegovo linearno povečevanje, ki ga potrdi tudi eksperiment, katerega rezultati so prikazani na sliki (3a). Drugi pomemben parameter je temperatura, pri kateri odvisnost na podlagi enačbe (10) zaradi netrivialnih temperaturnih odvisnosti λ D pt q, ɛpt q in hidracijske entropije s hidracijska pt q ni očitna. Zanimivo je, da pri nizkih temperaturah negativni hidracijski prispevek premaga pozitivno ionsko senčenje, kar pripelje do negativnih vrednosti Soretovega koeficienta in posledično toploljubne termoforeze. Predvidevanja ponovno potrdi eksperiment, z rezultati prikazanimi na grafu (3b). Slika 3: Vpliv temperature in senčenja naboja zaradi koncentracije snovi v okolici na Soretov koeficient. Zviševanje koncentracije soli v raztopini povzroča manjšanje dosega elektrostatskih sil, karakteriziranih z Debyjevo dolžino. Ko se takšno senčenje povečuje, Soretov koeficient pada. Podobno Soretov koeficient pada pri zmanjševanju temperature. To obnašanje je posledica spreminjanja hidracijske entropije s temperaturo. [2]. 4

6 Eden izmed pomembnih parametrov v enačbi (10) je velikost delcev, oziroma njihov radij. V primeru, ko je efektivna površinska gostota naboja konstantna [2] pričakujemo, da se bo Soretov koeficient spreminjal s površino delcev A torej posledično s kvadratom radija, saj je A9r 2. Situacija je pri makromolekulah bolj zapletena, saj moramo upoštevati njihovo efektivno površino, na katero smo preračunali hidracijsko entropijo in efektivno površinsko gostoto naboja. Če hočemo predvideti obnašanje termodifuzijskega koeficienta moramo dodatno upoštevati, da je Soretov koeficient, kvocient termodifuzijskega in difuzijskega koeficienta S T D T {D, slednji pa upošteva Einsteinovo relacijo, ki difuzijski koeficient zveže z obratnim radijem kroglastih delcev D91{r. Pričakovana odvisnost je torej linearna. Obe predpostavki preko 4 velikostnih razredov potrdi tudi eksperiment (slika 4a,b). Slika 4: Vpliv velikosti molekul na Soretov koeficient in termodifuzijsko konstanto. Soretov koeficient se v skladu z napovedjo spreminja s površino kroglic, medtem ko se termodifuzijski koeficient spreminja linearno, kar je posledica hkratnega spreminjanja difuzijskega koeficienta v skladu z Einsteinovo zvezo [2]. Izredno pomemben parameter, ki ga pogosto želimo meriti za posamezne vrste molekul, je njihov efektivni naboj. V mnogih primerih je ob majhnih koncentracijah soli hidracijska entropija majhna in prispeva k Soretovemu koeficientu manj kot 15% [2], zaradi česar jo lahko zanemarimo. To nam omogoča, da enačbo (10) obrnemo in iz nje izrazimo efektivni naboj v obliki [2] Q eff 2T 2 3ηD d ɛɛ 0 k 3 S T βπλ D. (12) Tovrstne meritve efektivnega naboja potrdijo predhodno izmerjene rezultate z že uveljavljeno elektroforezo [2]. Efektivni naboj kroglic se povečuje z njihovo površino, podobno pa se s podaljševanjem verige DNK povečuje tudi njen naboj, saj prinese vsak nov osnovni par v verižnici dodatni naboj. Primerjavo takšnih meritev in predvidenih vrednosti nazorno prikazuje slika (5). Ko imamo opravka z realnimi molekulami lahko efektivni naboj vseeno pomerimo, zveza med njim in katero drugo lastnostjo pa ni več nujno popolnoma očitna. Slika 5: Zveza med efektivnim nabojem molekule in njeno velikostjo, določena s termoforezo(točke) in predvidenimi vrednostmi (črta). Pri majhnih koncentracijah soli hidracijska entropija ne vpliva pomembno na Soretov koeficient, tako da lahko iz njega preprosto določimo spreminjanje efektivnega naboja s površino kroglic (a) oziroma dolžino verige DNK (b) [2]. Pokazali smo, kako se spreminja Soretov koeficient s spreminjanjem nekaterih osnovnih parametrov gradnikov, ki jih želimo opazovati. Omeniti gre, da je v bioloških opazovanjih izredno pomembna tudi vezava molekul, vendar odvisnosti Soretovega koeficienta od vezave molekul ne moremo preprosto predvideti, saj se končni vezan kompleks lahko od začetnih molekul razlikuje po mnogih od zgoraj naštetih lastnost. 3 Eksperimentalne postavitve Do tu smo ugotovili, da je termoforezno gibanje močno odvisno od lastnosti opazovanih gradnikov in da lahko z opazovanjem gibanja molekul v temperaturnih gradientih določimo nekatere njihove pomembne lastnosti. V literaturi lahko zasledimo več različnih načinov uporabe termoforeze za določanje lastnosti molekul v snovi. Vsem je skupno, da za gretje uporabljajo infrardeč laser, eksperimenti pa potekajo s suspenzijo delcev v mediju. Delce običajno označijo s fluorescenčnim barvilom, kar omogoča natančno opazovanje tudi v režimu majhnih koncentracij. Ena izmed prednosti termoforeze kot analitske metode je, da omogoča delo z izredno majhnimi vzorci, kar je še posebej prikladno pri dragocenih bioloških vzorcih. 5

7 3.1 Mikro termoforeza Prvi pristop, ki ga bomo omenili, je tudi najpreprostejši. Gre za mikrotermoforezo, pri kateri opazujemo odziv molekul v mirujoči tekočini ob vzpostavitvi temperaturnega gradienta. Postavitev vključuje temperaturno dobro prevodne kapilare, ki omogočajo ustvarjanje velikih temperaturnih gradientov ter laser, ki segreje območje kapilare, ter tako povzroči preko nastalega temperaturnega gradienta premikanje označenih molekul. Laser je lahko pri eksperimentu usmerjen skozi isto lečje, kot ga uporabljamo za opazovanje poteka. Takšna postavitev omogoča natančno gretje, tako prostorsko (do nekaj 100 µm), kot tudi temperaturno (v velikostnem razredu 1 mk), hkrati pa zagotovi fokus laserskega snopa v vzorcu [4]. Opisano obliko eksperimenta prikazuje slika (6a). Da lahko premikanje dobro izmerimo, molekule označimo s fluorescenčnim označevalcem (barvilom), njegovo aktivnost na področju segrevanja pa merimo s CCD tipalom ali podobnim detektorjem. Signal, ki ga tako dobimo, je sorazmeren številu opazovanih molekul na segrevanem območju. Če so molekule termofobne bomo v poteku signala po vklopu laserja in končanju prehodnega pojava opazili padec svetlosti, če pa so molekule termofilne, bomo zaznali njen porast. Velikost skoka je odvisna od Soretovega koeficienta, le-ta pa se spreminja s spreminjanjem lastnosti molekul. Svetlost (fluorescenca) v ravnovesnem stanju lahko torej povežemo tudi s spremembo lastnosti in konformacije molekul v vzorcu. Mikrotermoforeza je odlično orodje za karakterizacijo vezave molekul in opazovanje odvisnosti deleža vezanih molekul od koncentracije prisotnih vezavnih partnerjev. Tipično določanje vezave se izvaja kot titracijski eksperiment, kjer koncentracija opazovanih molekul ostaja enaka, dodajamo pa njihove vezavne partnerje. Fluorescenca signala F norm, normirana na začetno vrednost, se spreminja linearno v skladu z enačbo [4]: F norm p1 xqf pnevezanoq ` xf pvezanoq, (13) kjer je x koncentracija partnerskih molekul. Poleg opisanega ravnovesnega signala, odvisnega od vezave, opazimo pri tovrstnih eksperimentih še 4 različna stanja. Na začetku, ob času do vklopa laserja, je vzorec v ravnovesnem stanju, ko je koncentracija povsod enakomerna. Takoj po vklopu laserja se v kratkem času («1s) poveča temperatura območja. Ker je večina fluorescenčnih barvil temperaturno občutljiva se zaradi tega povečanja spremeni njihov fotonski pridelek, fluorescenca pa naglo upade (temperaturni skok svetlosti). Ker je padec v pridelku odvisen tudi od kraja vezave barvila na molekule, je skok lahko uporaben za določanje vezavnih mest [4]. Po kratkem času se na toplem območju uveljavi kot primarni proces termoforeza, ki jo uporabimo, za določanje lastnosti molekul. Po izklopu laserja pride tokrat do obratnega temperaturnega skoka, ki je soroden pojav prvemu skoku ob vklopu laserja. Ko skok mine in se temperatura ponovno uravnovesi, se pričnejo molekule vračati v ravnovesno enakomerno porazdelitev. Ker ta proces poteka z običajno difuzijo, se sistem uravnovesi počasi. Celoten potek takšnega signala z označenimi območji je prikazan na sliki (6b). Slika 6: Fluorescenčno merjenje termoforeze s točkovnim gretjem (mikrotermoforeza). Pri mikrotermoforezi segrejemo z laserjem majhno območje vzorca, v katerem smo opazovane molekule označili s fluorescenčnim označevalcem. Takšno gretje povzroči termoforezno gibanje molekul, ki ga lahko opazimo kot spremembo fluorescence na preiskovanem območju. Pri opazovanju poteka signala opazimo dva prehodna pojava, ki sta posledica temperaturne odvisnosti aktivnosti fluorescenčnega barvila, na koncu pa izenačveanje koncentracije molekul proti ravnovesni preko običajne difuzije. Višina in potek termodifuzijskega signala sta sorazmerna z vezavo molekul, kar omogoča njihovo preprosto karakterizacijo [4]. 6

8 3.2 Termična past s protitokom V tekočen mediju imajo delci v povprečju hitrost, določeno z tokom snovi. Če v takšen tok postavimo temperaturni gradient, se bodo delci začeli premikati po njem, hitrostna prispevka zaradi toka medija in termoforeze pa se bosta seštela. Če v toku termofobnih delcev segrevamo majhno področje kapilare po kateri tečejo, se bodo delci zaradi termoforeznega zdrsa pričeli premikati v smer, nasprotno toku. Če je hitrost toka nadalje ravno primerna, se bodo delci pričeli na območju gradienta zaustavljati in nalagati pred segretim območjem [7]. Hitrostni profil in povečanje koncentracije pred segretim območjem zaradi zastajanja molekul razloži slika (7). Hitrostni profil je seveda paraboličen, tako da na robovih kapilare ne pride nujno do vzpostavitve ravnovesnega stanja. Tukaj nastopi pomen postavitve v mikrofluidično kapilaro, ki zagotovi popolnoma laminaren tok znotraj kapilare, zaradi česar lahko robna območja preprosto izpustimo iz obravnave, saj ne prihaja do mešanja med območji s premajhno hitrostjo na robu in območji s primerno hitrostjo v središču kapilare. Slika 7: Porazdelitev molekul v protitoku zaradi termoforeznega zdrsa. Če vzpostavimo temperaturni gradient v kanalu s protitokom, se pričnejo termofobne molekule premikati v nasprotni smeri temperaturnega gradienta. V primeru, ko hitrost toka prilagodimo hitrosti gibanja molekul opazimo, da takšno termoforeznega zdrsa povzroči zastajanje molekul. [7]. Ker je termoforetično pometanje odvisno od Soretovega koeficienta opazovanih molekul, lahko z izbiro primernega gradienta in hitrosti toka določimo točen tip molekul, ki jih želimo izločiti iz toka. Takšna postavitev je torej primerna za ločevanje delcev z izbranimi lastnostmi iz toka [7]. Dejansko lahko iz toka zaporedno ločimo več različnih vrst delcev tako, da pričnemo v kapilari z vzpostavljanjem najmanjših gradientov, nato pa napredujemo proti večjim. Tako v začetku kapilare izločimo molekule z največjim Soretovim koeficientom, na koncu pa tiste z najmanjšim. Tehnično je izdelava takšne pasti bolj zamotana kot uporaba mikroteroforeze, saj moramo v toku ustvariti ravno pravšnji temperaturni gradient, da izločimo želene molekule. Pravtako moramo poskrbeti za tok v kapilari, kar se lahko preprosto izvede s pomočjo tlačnih ali pa višinskih razlik dovodnih ali odvodnih rezervoarjev na koncih kapilare. Slika 8: Eksperimentalna postavitev za termično past s protitokom. Eksperimentalna izvedba termične pasti z nasprotnim tokom vključuje izdelavo mikrokanala iz polimera PDMS, ki je preprost za izdelavo, hkrati pa ima dobre optične lastnosti - je prosojen. Skozi kanal se nato s pomočjo tlačne razlike vzpostavi tok delcev. Slika prikazuje običajni profil toka in temperature pri takšni postavitvi [7]. Ker želimo past z nasprotnim tokom uporabiti predvsem za izločanje znanih, točno določenih molekul iz toka, je ključno, da lahko rezultate predvidimo in da se naša napoved ujema z dejansko izmerjenim obnašanjem. Modelske enačbe, ki upoštevajo tok tekočine, so idejno zelo podobne enačbi izpraznitve v mirujočem mediju (enačba 2), le da moramo tokrat upoštevati še nasprotujoči tok. To storimo z uvedbo efektivnega potenciala, ki združuje vpliv termodifuzije in hitrosti tekočine, ki molekule odnaša. Enačbe, ki jih tako dobimo niso preproste, zapišemo jih namreč v obliki [7]: cpxq v ż 8 D e Upxq e Upx1q dx 1, (14) x Upxq D T rt pxq T 0 s vx, (15) D kjer je cpxq koncentracija molekul, v hitrost toka tekočine, U pxq pa efektivni potencial v toku. Gornje enačbe nam v sicer odbojnem potencialu za v 0 podajo minimum, navzgor po toku. Pri eksperimentu [7] so primerjali rezultate, dobljene s simulacijo končnih elementov v skladu z zgornjimi enačbami, in rezultate meritev, ki so pokazali odlično ujemanje z napovedjo (slika 9). 7

9 Slika 9: Primerjava rezultatov meritev in 1D modela. Primerjava pokaže izredno dobro ujemanje med simuliranim modelom in dejanskim izmerjenim stanjem pri več različnih časih. Za eksperimentalno vrednost je bila vzeta koncentracija molekul DNK na sredini kapilare [7]. Ujemanje je bilo prav tako izredno dobro tudi ob primerjavi 3D modela z eksperimentalnimi rezultati na celem območju kapilare (slika 10), opazna so bila le manjša odstopanja na robu kapilare zaradi neenakomernosti toka. Slika 10: Primerjava časovne in krajevne porazdelitve DNK pri zastajanju molekul v protitoku. (b) Z uporabo IR laserja se lokalizirano segreje območje kapilare, v katerem se vzpostavi temperaturni gradient, ki povzroči zastajanje termofobnih molekul. (c) Opazovanje koncentracije označenih molekul DNK v eksperimentu in primerjava z numerično izračunanimi potrdi, da lahko termoforetično pometanje povzroči zastajanje in posledično separacijo molekul z izbranim Soretovim koeficientom. Še več, rezultati so tako časovni kot tudi koncentracijsko predvidljivi [7] 3.3 Radialna past Podoben način delovanja kot past s protitokom ima radialna past. V tej postavitvi suspenzijo molekul ujamemo med dve plošči, z laserjem pa pričnemo zarisovati obroč toplega območja, ki ga počasi ožamo (slika 11a). Predstavljamo si lahko, da termofobne molekule ob vsaki zožitvi zdrsnejo po temperaturnem gradientu segretega območja in se tako približujejo sredini kroga. Tako lahko v točko zberemo molekule, ki so sicer razpršene po mnogo večjem območju [7]. Eksperiment s takšnim zožanjem prikazuje slika (11). Fizikalno ozadje je ekvivalentno kot pri termični pasti z nasprotujočim tokom, le da se v tem primeru namesto medija premika toplo območje. Delovanje radialne pasti je prikladno za zbiranje in zgoščevanje delcev v vzorcu. Slika 11: Zgoščevanje molekul DNA s koncentričnim ožanjem laserskega obroča. Če zajamemo vzorec označenih molekul DNK s segretim območjme, ki ga nato ožamo, zdrs molekul z temperaturnim gradientom povzroči merljivo povečanje koncentracije v središču kroga. Situacija je analogna metodi s protitokom, le da se tokrat premika gradient, ne molekule v raztopini [7] 8

10 4 Karakterizacija vezave molekul Po pregledu osnovnih analitskih metod, ki za svoje delovanje izkoriščajo termoforezno gibanje, se posvetimo še dvema primeroma uporabe mikrotermoforeze za določanje vezave molekul. Mikrotermoforeza je izredno prikladno orodje, ki omogoča določanje vezave le na podlagi optičnih eksperimentov, brez zahteve po čistih raztopinah, kjer vezave nakazujejo ponavadi zapletene interakcije z indikatorjem. Prav tako je takšen pristop izredno prikladen zaradi majhnega fizikalnega in biološkega vpliva fluorescentnega označevalca na lastnosti molekul in njihove vezave [3]. 4.1 Vezava aptamer na proteine V biologiji in medicini je izredno pomembna karakterizacija medsebojnih vezav gradnikov. Ena izmed skupin takšnih vezanih gradnikov so aptamere (kratkoverižne nukleinske kisline, večinoma so mnogo krajše od molekul DNK), ki se vežejo na specifične tarčne molekule. Mikrotermoforetična metoda (MST) omogoča natančno in relativno preprosto določanje vezave aptamer na proteine v odvisnosti od njihove koncentracije, kar je bilo do sedaj možno le preko kompleksnejših reakcij z indikatorji [3]. Pri eksperimentu so opazovali MST fluorescenčni signal (slika 12a), ki so ga oddajale označene aptamere, v odvisnosti od koncentracije tarčnega trombina v vzorcu [3]. Pri različnih koncentracijah trombina so izmerili vezavno krivuljo (slika 12b). Ko so dodajali v mešanico trombin je namreč vedno več aptamer postajalo vezanih, zato se spremenita njihova mobilnost in posledično Soretov koeficient S T, ravnovesna fluorescenca pa zato z vezavo narašča [3]. Slika 12: Vezanost molekul aptamer, določena s točkovnim segrevanjem (mikrotermoforezo). Vezava aptamer na proteine spremeni njihovo mobilnost, kar prinese spremenjeno vrednost Soretovega koeficineta. Manjši Soretov koeficient pomeni manjšo ravnovesno koncentracijo na segretem območju, kar lahko izmerimo s spremljanjem normirane fluorescence (a). Merjenje fluorescence ob času 30 s razkrije karakteristiko vezave v odvisnosti od koncentracije tarčnih proteinov. Iz vezavne krivulje lahko določimo tudi odvisnost Soretovega koeficienta (c) [3]. Zanimivo je, da je Soretov koeficient aptamer pri enakih koncentracijah v različnih medijih različen, saj je vezava v kompleksnih bioloških sistemih odvisna tudi od okolice - medija. Pravzaprav nad to ugotovitvijo ne bi smeli biti presenečeni, saj v različnih medijih opazimo tako različno senčenje naboja, ki se odraža v spremenjeni Debyjevi dolžini, kot tudi drugačen prispevek hidracijske energije. Oba učinka v enačbi (10) pripeljeta do spremembe v Soretovem koeficientu in posledično spremenita vrednost fluorescenčnega signala v ravnovesju. V kompleksnejših sistemih je tako vezava intuitivno pričakovano manjša, saj na stik med molekulo in medijem vplivajo tudi drugi elementi kompleksnih serumov, kar seveda da drugačne vezavne krivulje. Sprememba vezave je bila opažena v dejanskih eksperimentih, ko so zgoraj prikazano vezavno krivuljo aptamer na protein trombin merili v različnih, bolj življenjskih kompleksih (slika 13) [3]. Pri vseh meritvah, tudi v človškem krvnem serumu, so bili rezultati izraziti, z visokim razmerjem signala proti šumu [3], kar potrdi uporabnost in zanesljivost termoforeznih metod v realnih aplikacijah. 9

11 Slika 13: Vezava aptamer v odvisnosti od medija, določena z MST metodo. MST metoda nam omogoča določanje vezave aptamer na molekule trombina v različnih okoljih, od preproste čiste raztopine, preko SSC (solno-natrijev citrat), pa do kompleksnih bioloških sistemov, kot je na primer razredčen krvni serum. Poskus pokaže, da je vezava odvisna od uporabljenega medija [3]. 4.2 Vezava liposomov Drugi primer, ki ga bomo predstavili kot zgled uporabe termoforetskih analitičnih tehnik, je opazovanje medsebojne vezave liposomov. V vseh večini evkariontskih organizmov opazimo medsebojno vezavo liposomskih membran, recimo pri prenosu hranilnih snovi. Tovrstne medsebojne vezave liposomskih membran so mogoče zaradi kompatibilnih SNARE proteinov v membranah obeh liposomov, ki ujameta in zbližata liposome in tako pomagata identificirati kompatibilne liposome ter pospešiti njihovo vezavo. Med vezavo se receptorska in posredniška molekula SNARE vežeta v cis-snare strukturo, ki ji nato sledi spojitev membran [4]. Pri pripravi vzorcev za eksperiment so eno izmed molekul označli s fluorescenčnim markerjem, tako da se ob tvorbi kompleksa cis-snare označena molekula sprosti, pri tem pa se ji močno spremeni Soretov koeficient. Postopek takšne vezave je prikazan na sliki (14 zgoraj). Večanje števila medsebojnih vezav liposomov torej povečuje število nevezanih označenih fluorescenčnih molekul, kar ima za posledico padec svetlosti v ravnovesju [4]. Tako so direktno izmerili število medsebojnih vezav med liposomi s primernima proteinoma. Merjenje fluorescence v ravnovesju v odvisnosti od koncentracije vezavnih proteinov v liposomih je zopet hitro prevedljivo na iskano vezavno krivuljo, ki jo prikazuje slika (14 spodaj). Slika 14: Določanje vezave liposomov s kompatibilnimi receptorji v membranah. Ob vezavi dveh slabše mobilnih liposomov z nižjim Soretovim koeficientom se sprosti dobro mobilen označen peptid. Ker ima večji Soretov koeficient, in ker z naraščanjem vezav vedno več označevalcev postaja prostih, pri povečevanju koncentracije receptorskih proteinov v liposomih ravnovesna fluorescenca pada. Kontrolni vzorec liposomov brez receptorjev pokaže pričakovano konstantno odvisnost. Takšen pristop z vezavo označevalca na peptid omogoča merjenje vezave brez vplivov spremembe termodifuzijskih lastnosti liposomov [4]. 10

12 5 Zaključek Predstavili smo termoforezo oziroma termodifzijo kot pojav, soroden običajni difuziji, le da gre njen izvor iskati v temperaturnih gradientih okolice, ne v koncentracijskih. Izpostavili smo tudi, da je mikroskopsko gledano termoforeza drugačna od splošno usmerjenih gibanj, saj je izvor premika molekul posledica povprečne hitrosti, ne pa hitrosti posameznih delcev. Nadaljevali smo s predstavitvijo teoretičnega modela termoforeze, ki izhaja iz opisa ravnovesnih stanj molekule v topilu, ter povezali lastnosti stika med molekulo in medijem z njenim Soretovim koeficientom, ki določa deplecijsko koncentracijo molekul v ravnovesju. Opisali smo tudi rezultate numeričnih simulacij, ki potrdijo, da je gibanje molekul v temperaturnih gradientih dejansko posledica termodifuzije in ni odvisno od vzopostavitve konvekcijskih tokov v mediju. Oboroženi s teoretičnim opisom smo se lotili predstavitve dveh glavnih eksperimetnalnih metod, ki se dandanes uporabljata in dajeta uporabne rezultate. Najbolj razširjena metoda je zaradi svoje preprostosti mikrotermoforetza (MST), ki za svoje delovanje potrebuje le minimalno označene molekule, kamero, mikroskop in laser za segrevanje. Predstavili smo tudi postavitev s protitokom, ki omogoča ločevanje molekul z določenim Soretovim koeficientom iz toka snovi v kapilari, ter njej sorodno radialno termično past, ki omogoča zbiranje in koncentriranje molekul z večjega območja. Za konec smo si ogledali še rezultate dveh eksperimentov, kjer so z metodo MST uspešno izmerili vezavne krivulje aptamer na protein trombin tudi v človeškem krvnem serumu in medsebojne vezave liposomov v odvisnosti od količine vgrajenih proteinov v membrani. Literatura 1. Duhr, S, Arduini, S & Braun, D. Thermophoresis of DNA determined by microfluidic fluorescence. EUROPEAN PHYSICAL JOURNAL E 15. 6th International Meeting on Thermal Forces (IMT6), Varenna, ITALY, JUL, 2004, issn: (2004). 2. Duhr, S. & Braun, D. Why molecules move along a temperature gradient. PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA 103, issn: (2006). 3. Baaske, P., Wienken, C. J., Reineck, P., Duhr, S. & Braun, D. Optical Thermophoresis for Quantifying the Buffer Dependence of Aptamer Binding. ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION 49, issn: (2010). 4. Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P. & Duhr, S. Molecular Interaction Studies Using Microscale Thermophoresis. ASSAY AND DRUG DEVELOPMENT TECHNOLOGIES 9, issn: X (2011). 5. Reineck, P., Wienken, C. J. & Braun, D. Thermophoresis of single stranded DNA. ELECTROPHO- RESIS 31, issn: (2010). 6. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D. & Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. NATURE COMMUNICATIONS 1. issn: doi:{ /ncomms1093} (2010). 7. Duhr, S. & Braun, D. Optothermal molecule trapping by opposing fluid flow with thermophoretic drift. PHYSICAL REVIEW LETTERS 97. issn: doi:{ / PhysRevLett } (2006). 11