Univerza v Ljubljani Fakulteta za matematiko in fiziko Oddelek za fiziko. Seminar II Izračun oblike fosfolipidnih mehurčkov(vesiklov)

Transcription

1 Univerza v Ljubljani Fakulteta za matematiko in fiziko Oddelek za fiziko Seminar II Izračun oblike fosfolipidnih mehurčkov(vesiklov) Avtor: Andrej Košmrlj Mentor: dr. Saša Svetina 4. maj 2005 Povzetek Namen seminarja je predstaviti teorijo, ki je potrebna za razumevanje ravnovesnih oblik lipidnih vesiklov in na podlagi dobljenega znanja ugotoviti, kako vpliva membranski skelet na obliko rdečih krvničk. Na kratko bom opisal tudi eksperiment, s pomočjo katerega v zadnjih letih merijo elastične konstante celičnih membran.

2 Kazalo 1 Uvod 2 2 Fosfolipidni vesikli Elastična energija lipidne membrane Metode določanja oblik vesiklov Striktni model dvoslojnega para Posplošen model dvoslojnega para Numerična minimizacija elastične energije Rdeče krvničke Vpliv mehanskega skeleta na obliko eritrocita Opis eksperimenta, s katerim določajo elastične lastnosti membrane 14 6 Zaključek 14 1

3 Slika 1: Prikaz membrane lipidnega dvosloja, v katerem se nahajajo tudi proteini, kar se tipično pojavlja v membranah celic. Membrane fosfolipidnih vesiklov so sestavljene samo iz lipidnih molekul. Slika vzeta iz [1]. 1 Uvod Rdeče krvničke so bile že od nekdaj predmet zanimanja raziskovalcev. K temu jih je posebej spodbujala želja k spoznanju, kako težko se je preoblikovati rdeči krvnički, ko se mora pretakati po majhnih kapilarah (premer 4µm), in zakaj je ravnovesna oblika rdeče krvničke oblika diskocita(oblika diska, ki je na sredini zgoraj in spodaj malo vbočen). Na nivoju celic je rdeča krvnička zelo preprosta, saj je zgrajena samo iz celične tekočine (citosol) in membrane, ki jo obdaja. Ta membrana je sestavljena iz lipidnega dvosloja, raznih proteinov, ki se nahajajo v lipidnem dvosloju, in membranskega skeleta. Kot je v fiziki navadno, hočemo najprej razumeti fiziko najbolj enostavnega problema. V ta namen so najprej preučevali lastnosti fosfolipidnih vesiklov[2-9], katerih membrana je sestavljena samo iz lipidnega dvosloja, nato pa so se spravili tudi na bolj kompleksen problem lastnosti rdečih krvničk [10-15]. 2 Fosfolipidni vesikli Lipidni vesikli nastanejo, ko se lipidne molekule v vodni raztopini združijo in tvorijo membrano. Tipični lipidne membrane so fosfolipidne membrane, ki jih sestavljajo fosfolipidne molekule. Fosfolipidna molekula je sestavljena iz hidrofilne(privlači vodo) glave in hidrofobnega(odbija vodo) repa. Fosfolipidna membrana je sestavljena iz dveh slojev fosfolipidnih molekul, ki so postavljene tako, da so repi obrnjeni v notranjost membrane, glave pa so na površini membrane. V vodni raztopini vesikli lahko spontano rasejo pri različnih pogojih [2] in so zato tudi različno veliki: majhni( 10nm), veliki( 0.1µm) in orjaški( 10µm). Posebno pozornost posvečajo orjaškim vesiklom, ker so njihove dimenzije primerljive z dimenzijami celic. 2.1 Elastična energija lipidne membrane Zunanjost in notranjost vesikla predstavlja vodna raztopina, zato je v odsotnosti zunanjih sil oblika vesikla odvisna samo od mehanskih lastnosti membrane[3]. 2

4 Slika 2: Skica glavnih krivinskih radijev pri ukrivljanju membrane. Ker je membrana tanka ( 5nm), jo lahko obravnavamo kot tanko elastično ploščo. Deformacije tanke elastične plošče lahko razdelimo na dva neodvisna elastična deformacijska načina: ukrivljanje plošče in elastične deformacije v ravnini plošče [4, 5, 10]. Elastičnost v ravnini plošče je za fosfolipidno membrano specifična, saj se lahko fosfolipidne molekule premikajo po posameznem sloju, zato se fosfolipidna membrana obnaša kot dvodimenzionalna stisljiva tekočina, ki ne prenaša striga. Elastično energijo tega deformacijskega načina zato opišemo samo z členom, ki predstavlja razteznost površine: W A = K 2A 0 (A A 0 ) 2, (1) kjer je K = 0,24N/m [2] elastična konstanta površinskega raztezka in A 0 ravnovesna površina membrane, ki je določena kar s številom lipidnih molekul, ki sestavljajo membrano. Ta energijski člen je posebej pomemben, kadar je vesikel v oteklem stanju, to je kadar je njegov volumen večji od volumna krogle s površino A 0. V nasprotnem primeru se membrana ne stisne, ampak se raje ukrivi in zavzame nekrogelno obliko, kar se zgodi, ker je cena energije, ki jo plačamo za ukrivljanje membrane, precej manjša od cene zaradi stiskanja membrane. Kadar vesikel ni kroglaste oblike, je njegova membrana različno ukrivljena na različnih mestih. Energijo, potrebno za ukrivljanje membrane vesikla, opišemo z integralom prispevkov lokalnih ukrivljenosti, ki jih opišemo z glavnima ukrivljenostma C 1 = 1/R 1 in C 2 = 1/R 2, kjer sta R 1 in R 2 glavna krivinska radija(glej sliko 2): W b+g = W bc + W G = 1 2 k c (C 1 + C 2 C 0 ) 2 da + k G C 1 C 2 da, (2) kjer je k c ( J) elastična konstanta lokalnega ukrivljanja, k G ( J) Gaussova elastična konstanta ukrivljanja in C 0 spontana ukrivljenost, ki je odraz notranjih lastnosti membrane. 3

5 Upoštevati moramo tudi dejstvo, da so fosfolipidne membrane sestavljene iz dveh slojev fosfolipidnih molekul. Ta dva sloja sta vzporedno staknjena skupaj, vendar sta med sabo dokaj neodvisna, saj je spontan prehod lipidnih molekul iz enega sloja v drugega dokaj počasen proces, ki se odvija na časovni skali nekaj ur ali dni, medtem ko je lahko proces zaradi mehanskih obremenitev precej hitrejši in se dogaja na časovni skali nekaj minut[6]. Neodvisnost slojev pomeni tudi to, da se en sloj lahko premika na drugem, pri čemer pa je prisotno trenje med obema slojema. Ob predpostavki, da je razdalja h med nevtralnima plastema obeh slojev vzdolž celotne membrane konstantna, ugotovimo, da je površina A 2 nevtralne plasti zunanjega sloja večja od površine A 1 nevtralne plasti notranjega sloja. Razlika teh površin se izraža z integralom A = A 2 A 1 = h (C 1 + C 2 )da, (3) kjer poteka integracija po površini vesikla (A A 1 A 2 ). Razlika v površinah prispeva k dodatnemu energijskemu členu nelokalnega ukrivljanja W r = k r 2A 0 h 2 ( A A 0) 2, (4) kjer je k r elastična konstanta nelokalnega ukrivljanja in A 0 ravnovesna razlika površin, ki je podana z razliko števila lipidnih molekul v posameznem sloju. 3 Metode določanja oblik vesiklov V odsotnosti zunanjih sil je oblika vesikla določena z minimizacijo elastične energije. Preden začnemo z obravnavo elastične energije je pomembno omeniti še vlogo osmoznega tlaka Π na velikost vesikla [3]. Osmozni tlak ( n ) Π = RT V c, je posledica raztopljenih molekul(sladkor) v raztopini, ki jih lipidna membrana zelo slabo ali sploh ne prevaja. Tu so R plinska konstanta, n množina molekul ujetih v vesikel, c pa koncentracija raztopljenih molekul v okolni raztopini in tipično znaša 10 4 mol/m 3. Vpeljemo tudi ravnovesni volumen V 0 = n/c vesikla, ko osmozni tlak izgine. Zapišemo lahko tudi delo, ki ga vesikel opravi na okolici zaradi osmoznega tlaka, kjer upoštevamo, da se volumen V vesikla le malo razlikuje od ravnovesnega V 0. W V = V Π(V )dv RTcV 0 V 0 2 ( ) 2 V 1 (5) V 0 Po pričakovanju vidimo, da volumen vesikla V teži k ravnovesni vrednosti V 0. To vesikel doseže tako, da osmozni tlak povzroča prehajanje vodnih molekul skozi lipidno membrano dokler ne doseže ravnovesnega volumna. Ker v elastični energiji volumen nikjer ne nastopa, lahko vzamemo za volumen V kar ravnovesni volumen V 0, ki se vzpostavi sam od sebe, če počakamo dovolj časa. Poglejmo sedaj še kateri členi so pomembni pri elastični energiji. Člen W A (enačba 1) lahko iz obravnave spustimo, ker je elastična konstanta K izredno 4

6 velika in lahko predpostavimo, da je površina vesikla neraztegnjena A = A 0. Prav tako lahko izpustimo Gaussov člen W G (enačba 2), ki je odvisen samo od topologije membrane. Obravnavali bomo samo vesikle, ki so topološko ekvivalentni krogli, za katere znaša W G = 4πk G. Ta člen bi bil pomemben v primeru, ko bi obravnavali proces fisije ali fuzije vesiklov[5]. Za opis oblike vesikla sta dovolj člena: W = W bc + W r = 1 2 k c (C 1 + C 2 C 0 ) 2 da + k r 2A 0 h 2 ( A A 0) 2 (6) Opazimo lahko, da je elastična energija neodvisna od velikostne skale, zato jo lahko predelamo v brezdimenzijsko obliko, tako da uvedemo dolžino skale R s, ki ustreza radiju krogle, katere površina je enaka A 0. Vse relevantne količine predelamo v brezdimenzijske količine, tako da jih reduciramo z vrednostmi, ki bi jih imele pri okroglem vesiklu z radijem R s : a = 1, da = da 4πRs 2, c i = C i R s, a = A, a 0 = A 0, 8πhR s 8πhR s v = 3V 4πR 3 s s pomočjo katerih zapišemo v brezdimenzijski obliki še elastično energijo in razliko površin: w = W = w bc + w r = 1 (c 1 + c 2 c 0 ) 2 da + k r ( a a 0 ) 2, (7) 8πk c 4 k c a = 1 (c 1 + c 2 )da (8) 2 Pri vseh metodah določanja oblik vzamemo volumen v vesikla kot enega od parametrov in nas zanimajo oblike v odvisnosti od v. 3.1 Striktni model dvoslojnega para V okviru tega modela predpostavimo, da je kr k c. Iz enačbe 7 sledi, da mora biti v tem modelu a = a 0 konstanten. Hitro se lahko prepričamo, da spontana ukrivljenost c 0 ne igra vloge parametra oblike vesikla, saj lahko razpišemo energijski člen lokalnega ukrivljanja: w bc = w b (v, a) c 0 a c2 0, (9) kjer uvedemo w b = 1 4 (c1 +c 2 ) 2 da. Parameter c 0 nam prinese samo konstanten prispevek k elastični energiji in zato ne vpliva na obliko vesikla. V okviru tega modela iščemo minimum elastične energije pri konstantnem a, v in a, kar zapišemo z brezdimenzijskim energijskim funkcionalom g = 1 (c 1 + c 2 ) 2 da L(a 1) 1 6 M(v v) 1 2 N( a a), (10) kjer z * označimo dejanske vrednosti parametrov za dani vesikel, L,M in N so Lagrangevi multiplikatorji. Če se omejimo na osno simetrične oblike, potem se da izpeljati sistem diferencialnih enačb[4, 10], ki nam določa obliko prereza vesikla. Ta sistem je rešljiv samo numerično. Z numeričnim reševanjem sistema 5

7 Slika 3: Črte prikazujejo nekaj ekstremalnih relativnih volumnov v odvisnosti od a. Zraven črt so narisane še ustrezne limitne oblike [4, 10]. pa še ničesar ne izvemo o tem, kakšne oblike vesikla lahko pričakujemo. V ta namen študirajo možne limitne oblike z iskanjem oblik z ekstremalnim volumnom v pri podanih a in a: g v = v 1 4 L(a 1) 1 2Ñ( a a), (11) Z omejitvijo na osno simetrične oblike in reševanjem Euler-Lagrangevih enačb so ugotovili, da so limitne oblike vedno sestavljene iz krogel ali krogelnih odsekov in da sta za te kroglene odseke možna samo dva različna radija, ki sta odvisna od a. Na sliki 3 si lahko ogledamo primere limitnih oblik. Hitro lahko opazimo, da limitne oblike lahko razdelimo še na dva razreda simetrije: ekvatorialno simetrični in nesimetrični. Med črtami limitnih oblik se nahajajo ostale oblike vesiklov, ki z a zvezno preidejo iz ene limitne oblike v drugo. En primer za v = 0,6 si lahko ogledamo na sliki 4, ki kaže tudi primerjavo med napovedanimi oblikami in izmerjenimi oblikami [4]. 3.2 Posplošen model dvoslojnega para Posplošen model je nekoliko splošnejši od striktnega modela, saj predpostavlja končno velikost elastične konstante k r, kar je precej bližje realnosti. Teoretično so napovedali razmerje k r /k c = 3, ki velja, ko bi bile elastične lastnosti posameznega sloja lipidne membrane homogene vzdolž celotnega prereza. V realnosti to seveda ne drži, saj prihaja do razlik v lastnostih glave in repa lipidne molekule. Kljub temu teoretična ocena ni napačna, saj se eksperimentalno izmerjene vrednosti vrtijo med 2 in 4. Funkcional, ki ga želimo minimizirati, je sedaj: g = w b (v, a) + k r k c ( a a 0 ) L(a 1) 1 6 M(v v) (12) Obravnava generaliziranega modela se lahko prevede na striktni model[4, 5], ko se delamo, da ima vesikel dano ampak še ne določeno relativno razliko površin 6

8 Slika 4: Primerjava med eksperimentom in teorijo. Na desni so teoretično izračunane oblike za v = 0,6 v odvisnosti od a in ustrezne energije [4]. Na levi je prikazan eksperimentalno [7] izmerjen prehod med diskocidno in stomatocidno obliko DMPC vesikla v čisti vodi, ki je bil opažen pri večanju temperature od 41,9 do 42,4 po koraku 0,02 na sliko. 7

9 a. Kot parametre za striktni model vzamemo a = a,a = 1 in v = v. S striktnim modelom izračunamo w b (v, a) in nato minimiziramo elastično energijo w(v, a) = w b (v, a) c 0 a c2 0 + k r k c ( a a 0 ) 2 (13) V ravnovesju je elastična energija minimalna, zato je prvi odvod w(v, a) po a enak 0: dw b d a = 2k r ( a a 0 ) + c 0 (14) k c Iz te enačbe se vidi, da nimamo 4 neodvisnih parametrov(v, a 0,c 0 in k r /k c ), ki nam določajo obliko vesikla, ampak dejansko samo 3. a 0 in c 0 nastopata samo v skupni konstanti c 0 = c k r k c a 0 (15) V tej enačbi je razvidno, da če uvedemo efektivno spontano ukrivljenost c 0, se znebimo parametra a 0, včasih pa se uporablja tudi obratna izražava z efektivno razliko površin a 0 = a 0 + k c 2k r c 0 (16) Ker ne poznamo analitične odvisnosti w(v, a), enačbo 14 običajno rešujemo grafično. Na sliki 5 si lahko pogledamo del faznega diagrama z oblikami cigare in hruške[4]. Na sliki opazimo, da v določenih primerih dobimo samo eno rešitev, v določenih pa celo 3 rešitve, od katerih je ena nestabilna, ena stabilna in ena metastabilna. 3.3 Numerična minimizacija elastične energije S precej splošnima metodama, opisanima v prejšnjih dveh razdelkih, smo lahko precej dobro opisali osno simetrične oblike. V faznem diagramu na sliki 6 opazimo tudi področje, kjer ni stabilna nobena osno simetrična oblika [5]. V takih primerih se kar numerično izračuna celotno oblike membrane [9]. Na sliki 7 si lahko ogledamo fazni diagram osno nesimetričnih oblik. Zanimivo je opaziti predvsem to, da v faznem diagramu nastopajo območja določenih simetrijskih razredov, med katerimi obstajajo zvezni in tudi nezvezni prehodi. 4 Rdeče krvničke Rdeča krvnička oz. eritrocit je ena izmed najbolj preprostih celic in vsaj od daleč nekoliko podobna lipidnim vesiklom. Notranjo tekočino citosol obdaja lipidna membrana, ki pa tokrat ni tako enostavna kot pri vesiklu(glej sliko 8). Med lipidnimi molekulami so postavljeni tudi razni proteini. Za mehansko obravnavo je najbolj pomembno, da so nekateri proteini (Band 3) prek ankirina pripeti na filamente spektrina, ki nam predstavljajo mehanski skelet[11]. Skelet je heksagonalna mreža, sestavljena iz povezav med filamenti tetramera spektrina, ki merijo, ko so popolnoma raztegnjeni 200nm[12]. Zaradi entropičnega načela je dolžina med koncema neobremenjega tetramera spektrina precej manjša in tipična razdalja med vozlišči mreže v eritrocitu znaša 76nm. Čeprav je membrana eritrocita zagotovo heterogena, lahko že na skalah večjih od 100nm 8

10 Slika 5: Grafično reševanje oblike vesiklov v delu faznega diagrama(levo zgoraj [4], s c je označen naš a) z oblikami cigare (cigar) in hruške (pear). Spodaj [5] je prikazano grafično reševanje enačbe 14, za k r /k c po vrsti od leve 0,6,20. Kadar imamo 3 rešitve, je srednja rešitev nestabilna, od preostalih dveh pa je ena stabilna in druga metastabilna. Spontana ukrivljenost c 0 nam samo premika črtkano premico gor in dol. Tako lahko razumemo eksperimentalno opažanje[8](zgoraj desno), ko so opazovali obliko DMPC vesikla in počasi povečevali temperatoro, so dobili za T T c = 40,8 stabilne oblike cigare. Pri T = 40,9 pa se je pojavil spontan prehod v obliko hruške. S temperaturo so povečevali spontano ukrivljenost c 0 in pri temperaturi T c so dosegli ravnovesno stanje v obliki cigare na vrhu špice, ki pa je z majhnim povečanjem temperature postalo nestabilno stanje. 9

11 Slika 6: Na zgornjih slikah [5] lahko vidimo precej različnih opaženih oblik, spodaj v faznem diagramu pa so označena mesta, ki pripadajo posameznim slikam. Polne črte na faznem diagramu nam predstavljajo limitne oblike, črtkane pa meje stabilnosti nelimitnih oblik. 10

12 Slika 7: Fazni diagram osno nesimetričnih oblik. Razdeljen je na odseke razredov z enako simetrijo. Prehodi med razredi so lahko nezvezni (črtkane črte) ali zvezni (polne črte). Opažena je tudi kritična točka C, kjer nezvezen prehod postane zvezen. Polne črte na levi in desni predstavljata meji stabilnosti osno simetričnih oblik. [9] Slika 8: Shematska slika membrane rdeče krvničke. Membranski skelet tvorijo podolgovati filamenti spektrina [11], ki so na sliki vidni kot prepletajoče cevke pod lipidno membrano. 11

13 obravnamo njene lastnosti kot približno homogene in jo lahko obravnavamo kot mehanski kontinuum. Poleg elastične energije lipidne membrane 1 igrata tokrat pomembno vlogo še dva prispevka[12, 13] W µ = µ (λ 1 λ 2 ) 2 da 0, (17) 2 W K = K (λ 1 + λ 2 2) 2 da 0 (18) 2 W µ nam predstavlja elastično energijo strižne deformacije skeleta z elastično konstanto striga µ N/m. W K nam predstavlja elastično energijo zaradi raztegovanja površine in K je elastična konstanta površinskega raztega K/µ 2 3. λ 1 in λ 2 nam opisujeta raztezanje dela skeleta. Elastična konstanta K membranskega skeleta je vsaj 4 rede manjša od podobne elastične konstante za lipidno membrano, ki smo jo do zdaj obravnavali kot neraztegljivo. Pri skeletu nam ni treba upoštevati elastične energije zaradi upogibanja, saj je elastična konstanta za upogibanje pri skeletu 2 reda manjša od podobne konstante za lipidno membrano. Za osno simetrične oblike se da analitično upoštevati tudi ta dva energijska člena. Tokrat uvedemo nov variacijski parameter, ki je lokalna gostota skeleta ρ/ρ 0 = 1/(λ 1 λ 2 ), medtem ko je celotna površina skeleta določena kar s površino lipidne membrane. 4.1 Vpliv mehanskega skeleta na obliko eritrocita Tipična oblika eritrocita je diskocit s premerom 7µm in debelino 2µm. Tipičen reducirani volumen znaša 0, 6 in podobne strukture najdemo tudi pri vesiklih okrog v = 0, 6. Ko zmanjšamo razliko površin med slojema lipidnih molekul A, se eritrocit deformira v skledasto obliko stomatocita, ki jo prav tako opazimo pri vesiklih(glej sliko 4). Ko pa povečamo A, pa opazimo neko povsem novo obliko(glej sliko 9). Namesto oblik cigare ali hruške, se pojavi oblika ehinocita[12, 13], ki ima špičaste izrastke, ki jim pravimo spikule. Te špice so dovolj blago ukrivljene, da je na teh mestih še vedno celotna membrana skupaj z proteini in skeletom, saj je tipična velikost spikule precej večja od velikosti posameznih sestavnih delov membrane. Ko je razlika A že precej velika, je osrednji del ehinocita približno sfera, na njeni površini pa se pojavi veliko število spikul (> 20). Izdelali so tudi model, ki napoveduje in ne parametrizira obliko posamezne spikule[12], ki se kar dobro ujema z opaženimi. Izdelali so tudi teorijo, da je tipična velikost spikule približno enaka elastični dolžinski skali k c Λ el = µ 0.3µm. Opazovali so tudi ehinocite oblike rdečih krvničk različnih živalskih vrst od koz, ki imajo manjše rdeče krvničke, do slonovih tjulnov(elephant Seal), katerih rdeče krvničke so večje. Opazili so, da je tipična velikost spikul precej neodvisna od velikosti rdeče krvničke, od koder so sklepali, da se tipična elastična dolžinska skala ne razlikuje dosti med različnimi živalskimi vrstami. 1 Zaradi proteinov, ki se nahajajo v lipidni membrani, se malenkost spremenita elastični konstanti lipidne mambrane k c in k r. 12

14 Slika 9: Primerjava med spremembo oblike fosfolipidnega vesikla in oblike rdeče krvnične celice, ko večamo razliko površin A od leve proti desni. Zgoraj so eksperimentalne slike, dobljene s fazno kontrastnim mikroskopom, spodaj pa so napovedi numeričnih simulacij. Slike so iz [15]. 13

15 Slika 10: Shematska slika [6] eksperimenta, kjer se formira teter. 5 Opis eksperimenta, s katerim določajo elastične lastnosti membrane V zadnjih 15 letih so izjemno popularni eksperimenti, pri katerih pričvrstijo celico in iz nje potem izvlečejo tanek cevasti izrastek imenovan teter(glej sliko 10). Celico običajno pričvrstijo tako, da jo zaradi razlike tlakov (aspiracijski tlak) prisesajo na mikropipeto, katere tipični notranji premeri so velikosti µm. Premer tetra je zelo majhen 50nm. Največji del k elastični energiji prispeva kar teter zaradi izjemnje ukrivljenosti[6], zato lahko precej bolj natančno določijo elastični konstantni upogibanja k c in k r. Teoretično so ugotovili, da je konfiguracija tetra stabilna samo za k r /k c 1. Ugotovili so, da je precej lažje formirati teter pri vesiklih F 5pN, kot pri eritrocitih F 50pN. Tako majhne sile lahko generirajo tako, da na membrano prilepijo majhno kroglico iz lateksa in jo nato bodisi vlečejo z lasersko pinceto, bodisi postavijo eksperiment tako, da kroglico vleče gravitacijska sila. Ugotovili so, da pri določenih kombinacijah aspiracijskega tlaka in sile, ki vleče teter, ne dobimo ravnovesne dolžine tetra, ampak ta s časom narašča na začetku linearno s časom ( µm/s), po dolgem času pa celo eksponentno narašča[6]. Ko teter naraste na približno 600µm, nenadoma zmanjšajo aspiracijski tlak, tako da se zelo hitro zmanjša dolžina tetra. Ko nato poskušajo držati dolžino tetra konstantno, ugotovijo, da morajo eksponentno zmanjševati aspiracijski tlak, ki se bliža neki ravnovesni vrednosti, ki je odvisna od dolžine tetra. Pri eritrocitu so ugotovili, da proteini, ki so pritrejni na membranski skelet, ne zaidejo v teter[14], medtem ko se ostali proteini lahko pojavijo v tetru. Lipidna membrana, ki je v tetru, se tako na nek način odleplja od membranskega skeleta in s takim eksperimentom so ugotovili, da je delo, ki je potrebno za separacijo teh dveh slojev približno enako W sk = 0.06mJ/m 2. 6 Zaključek V zadnjih 15 letih je bil narejen ogromen napredek na področju teoretičnega poznavanja lastnosti rdečih krvničnih celic in sposobnosti predvidevanja lastnosti. Lahko se povrnemo tudi k našemu uvodnemu razglabljanju: zakaj je ravnovesna oblika rdeče krvničke oblika diskocita? Zaradi prehoda skozi tanke kapilare je 14

16 za rdečo krvničko bolj ugoden majhen reduciran volumen v, saj bi se morala drugače pri prehodu skozi tanko kapilaro lipidna membrana raztegniti, kar je energijsko zelo neugodno. Membranski skelet ima raje manjšo reducirano razliko površin a, kar bi vodilo k obliki stomatocita, vendar bi se stomatocit precej težje deformiral kot diskocit pri prehodu skozi tanke kapilare. Oblika diskocita rdeče krvničke je nekakšen naravni kompromis. 15

17 Literatura [1] yi/lipid.html [2] Majhenc J., Božič B., Svetina S., Žekš B., Phospholipid membrane bending as assessed by the shape sequence of giant oblate phospholipid vesicles, Biochim. Biophys. Acta 1664 (2004) [3] Seifert, U., Configurations of fluid membranes and vesicles. Adv. Phys. 46 (1997) [4] Svetina S., Žekš B., Elastic properties of closed bilayer membranes and the shapes of giant phospholipid vesicles. In: Lasic DD, Barenholz Y, editors. Handbook of nonmedical applications of liposomes. Vol I. Boca Raton, New York, London, Tokyo, CRC Press. p [5] Svetina S., Žekš B., Shape Behavior of Lipid Vesicles as the Basis of Some Cellular Processes, Anatom. Rec. 268(2002) [6] Svetina S., Žekš B., Waugh R.E., Raphael R.M., Theoretical analysis of the effect of the transbilayer movement of phospholipid molecules on the dynamic behaviour of a microtube pulled out of an aspirated vesicle, Eur. Biophys. J. 27 (1998): [7] Käs J. and Sackmann E., Shape transitions and shape stability of giant phospholipid vesicles in pure water induced by area-to-volume changes, Biophys. J. 60 (1991) [8] Käs J., Sackmann E., Podgornik R., Svetina S., Žekš B., Thermally induced budding of phospholipid vesicles a discontinuous process, J. Phys. II France, 3 (1993) [9] Ziherl P., Svetina S., Nonaxisymmetric phospholipid vesicles: rackets, boomerangs, and starfish, Europhys. Lett., PREPRINT [10] Svetina S., Žekš B., Membrane bending energy and shape determination of phospholipid-vesicles and red blood-cells, Eur. Biophys. J. 17 (1989) [11] Discher D.E., New insights into erythrocyte membrane organization and microelasticity, Curr. Opin. Hematol. 7 (2000) [12] Mukhopadhyay R., Gerald L.H. and Wortis M., Echinocyte Shapes: Bending, Streching, and Shear Determine Spicule Shape and Spacing, Biophys. J. 82 (2002) [13] Kuzman D., Svetina S., Waugh R.E., Žekš B., Elastic properties of the red blood cell membrane that determine echinocyte deformability, Eur. Biophys. J. 33 (2004) 1-15 [14] Hwang W.C., Waugh R.C., Energy of Dissocioation of Lipid Bilayer from the Membrane Skeleton of Red Blood Cells, Biophys. J. 72 (1997) [15] Svetina S. et al., The cooperative role of membrane skeleton and bilayer in the mechanical behaviour of red blood cells, Bioelectrochemistry 62 (2004)