DNK detektivi (seminar)

Transcription

1 DNK detektivi (seminar) Martin Gorjan mentor: dr. Aleš Omerzu somentor: doc. dr. Vita Dolžan 10. november 2005 Povzetek Skoraj vsaka celica v človeškem telesu vsebuje identično molekulo DNK, te pa se med posamezniki na nekaterih delih (približno 1% celotnega zapisa) razlikujejo. S pomočjo analize kratkih odsekov DNK (fragmentov STR), ki se med posamezniki razlikujejo po dolžini, je možna zelo natančna identifikacija posamezne osebe. Uporaba pomnoževalne reakcije PCR omogoča analizo izjemno majhne količine vzorca tkiva, ki poteka s pomočjo kapilarne gel elektroforeze. Opisane tehnologije pa niso pomembne samo za forenzično analizo, pač pa so temeljnega pomena za molekularno biologijo in vse genske tehnologije. Institut Jožef Stefan Medicinska Fakulteta

2 Kazalo 1 Uvod 3 2 Zajem in ekstrakcija DNK Zajem vzorca tkiva Ekstrakcija DNK Analiza DNK Struktura DNK Kodiranje informacij v DNK (STR) Polimerazna verižna reakcija (PCR) Biokemične reakcije Potek polimerazne verižne reakcije Kapilarna gel elektroforeza Teorija elektroforeze Teorija gel elektroforeze polielektrolitov Identifikacija 15 2

3 1 Uvod Petdeset let je odkar sta Watson in Crick razvozlala 3D strukturo dvojne vijačnice deoksiribonukleinske kisline (DNK) [1], ki je nosilec genetskega materiala vseh znanih živih bitij [2]. S tem so prej teoretični geni dobili tudi fizično obliko in sledila so leta intenzivnega raziskovanja te molekule in njene biokemije. Z odkritjem in uporabo encimov restrikcijskih nukleaz [3], ki selektivno režejo dolgo molekulo DNK na manjše dele ter kmalu nato še odkritjem polimerazne verižne reakcije (PCR) [4], se je v osemdesetih letih začel pravi razcvet genetskih tehnologij. Leta 1986 so v Angliji že obsodili prvega kriminalca na podlagi identifikacije z genetsko analizo [5], zadnjih deset let pa je postala uporaba DNK v forenzične namene dokaj rutinska in zelo uspešna. Celoten postopek sestavlja več korakov, in danes uporabljani postopki se nekoliko razlikujejo od prvih izpred dvajsetih let. V nadaljevanju je opisan celotni postopek sodobne forenzične DNK analize (strokovno imenovane PCR/STR): od zajema vzorca tkiva in ekstrakcije molekule DNK iz tkiva, prek opisa kodiranja za forenzično analizo pomembnih informacij v molekuli DNK, pomnoževanje STR fragmentov DNK, ugotavljanje velikosti teh fragmentov s pomočjo kapilarne gel elektroforeze in končno ovrednotenje rezultatov ter (morebitna) identifikacija. Kljub veliki komercializaciji in avtomatizaciji je postopek še vedno precej drag (cena ene analize je reda velikosti SIT), v veliki meri tudi na račun dragih patentiranih kemikalij, predvsem barvil in fotoaktivnih snovi, potrebnih za zaznavo DNK pri končni analizi. Ravno na tem področju je tudi za fizike še dovolj manevrskega prostora za odkritja novih postopkov zaznavanja DNK fragmentov in s tem znižanja cene ter posledično povečanja dostopnosti forenzične DNK analize. 2 Zajem in ekstrakcija DNK 2.1 Zajem vzorca tkiva Molekula DNK se nahaja v celičnem jedru večine celic, ki sestavljajo človeško telo, poleg tega so krajše krožne molekule DNK tudi v celičnem organelu mitohondriju (mtdnk) [2]. Obe sta primerni za DNK analize, vendar s pomembno razliko: le jedrna DNK omogoča identifikacijo posameznika, saj ima vsaka oseba (z izjemo enojajčnih dvojčkov) edinstveno jedrno DNK, mitohondrijska DNK pa se podeduje le od matere in je zato identična med matero in otroci. Kot taka je primerna le za ugotavljanje sorodstvenih razmerij, odlikuje pa jo tudi manjša verjetnost degradacije. mtdnk se uporablja predvsem za identifikacijo drugače nerazpoznavnih trupel naravnih in drugih nesreč. Obe vrsti DNK pa se ne spreminjata med celično delitvijo (mitozo), kar pomeni, da imajo vse telesne celice posameznika (z izjemo relativno majhnega števila mutacij, ki pa ne motijo te vrste analize) identično DNK. Za pridobitev DNK so torej primerne skoraj vse telesne celice [6]. Za sodobni postopek analize zadostuje že izredno majhna količina DNK: zadostuje že zajem nekaj deset celic z jedrom [7]. V Tabeli 1 je predstavljenih nekaj najpogostejših tipov celic, puščenih na kraju zločina in pogosta mesta njih nahajanja [8]. Površino, kjer se nahajajo te celice, drgnejo z bombažno krpico, s katere jih nato sperejo z destilirano vodo. Dobljene celice shranijo v posebne papirne vrečke, kjer se posušijo in pri sobni temperaturi zdržijo do dveh let. Če nameravajo hraniti vzorce več kot dve leti, jih je priporočljivo zamrzniti na 20 o [9]. DNK je precej stabilna molekula; k nje degradaciji (DNK razpada na krajše 3

4 tip celic kožna povrhnjica slina bele krvničke sperma lasna korenina mesto nahajanja kapa, očala, orožje uporabljena cigareta, pisemska ovojnica orožje, krogle, umazano perilo odeja, uporabljen kondom, umazano perilo kapa, odeja, obleka Tabela 1: Najpogostejši tipi celic za DNK analizo in njih nahajališča. dele) najbolj pripomorejo vročina in vlaga (pospešujeta rast mikrobov, ki razgrajujejo DNK, višja temperatura pa sama po sebi povzroča večjo molekularno živahnost in s tem večjo verjetnost za degenerativne kemične reakcije na DNK, kot je npr. hidroliza - odcep vode in zlom fosfatnega ogrodja (glej 3.1)) ter sončni žarki (vidna svetloba in UV). Zelo pomembno dejstvo pa je, da degradacija DNK zgolj zmanjšuje količino dosegljive informacije o identiteti, ne povzroča pa spremembe te informacije [6]. Po zajemu (domnevnega) vzorca tkiva, najprej preverijo, če je to res biološki vzorec (in ne denimo packa kečapa ali loščila za čevlje) in ali vsebuje dovoljšnjo količino dovolj kvalitetne DNK (dovolj veliki fragmenti) za nadaljnjo analizo. Z uvedbo sodobne PCR/STR analize, ki je opisana v nadaljevanju, sta se obe zahtevi v primerjavi s predhodnimi metodami znižali za približno dva velikostna reda, tako da večina laboratorijev niti ne izvaja več testov o količini in kvaliteti DNK [6]. 2.2 Ekstrakcija DNK Telesne celice sesalcev so zelo kompleksne strukture: v največji meri jih sestavlja voda (70% celotne mase celice), sledijo proteini (20%), ostali gradniki kot so ioni, aminokisline (monomeri proteinov), sladkorji (monomeri polisaharidov), maščobne kisline in posamezni nukleotidi (monomeri DNK in RNK) prispevajo k masi celice relativno malo. Molekula DNK predstavlja le okoli 0.25% celotne celične mase [2], kar znaša okoli 6 pg [7]. Celice, ki v povprečju merijo okoli 10 µm, obdaja plazemska membrana iz fosfolipidov, v notranjosti celice (citoplazma) pa plavajo mnogi celični organeli ter celično jedro, ki ga zopet obdaja membrana. Celično jedro pri sesalcih zavzema okoli 10% prostornine celice, celotna dolžina molekule DNK pa je pri človeku okoli 2 m, kar omogoča zelo spretno pakiranje le-te. Človek in druga diploidna bitja imajo dve različni molekuli DNK, eno od matere in eno od očeta. Vsaka je razdeljena na 23 delov imenovanih kromosomi. DNK, ki je negativo nabita, je ovita okoli pozitivno nabitih proteinov histonov, le-ti pa sestavljajo terciarno strukturo - kromatinsko vlakno, ki ima premer okoli 30 nm. To vlakno je razpredeno znotraj celičnega jedra in celotno vlaknasto strukturo imenujemo kromatin. Ob celični delitvi se kromatin s pomočjo tvorbe zankic še dodatno zgosti v kromosome, ki so vidni že z optičnim mikroskopom. Poleg histonov obdaja DNK še kopica drugih proteinov, ki služijo kot prepisovalci informacij na RNK, aktivaciji ali represiji genov, in še mnogo čem. Celotno DNK v celičnem jedru imenujemo genom. [2]. Za DNK analizo bi se radi znebili vseh teh proteinov, maščob, ionov itd. in dobili čim čistejšo raztopino DNK (DNK je zelo dobro topna v vodi). Obstaja več postopkov za ekstrakcijo DNK iz celic oz. tkiva, in njih izbira je odvisna od tipa celic in količine ter stanja vzorca. Vsi pa temelijo na razgradnji celične stene (lizija), in izolaciji neželenih komponent iz raztopine, kar dosežejo s povečano temperaturo in dodatkom različnih kemikalij. Ena takih je detergent natrijev dodecil sulfat, ki razgradi celično in jedrsko membrano ter denaturira 4

5 Slika 1: Tipična celica sesalcev. (spremeni strukturo in vezavne lastnosti) proteine. Nato s pomočjo organskih topil ali soli (npr. NaCl) oborijo denaturirane proteine. Pri takem agresivnem postopku se DNK razlomi na več delov - fragmentov dolžin nekaj desettisoč baznih parov. Ker je proteinov (poleg vode) daleč največji delež v celici in ker se le proteini in njihovi kompleksi z RNK vežejo na samo DNK, so ti glavni krivci umazanja molekule DNK. Čistost raztopine DNK zato preverjajo s pomočjo absorpcije ultravijolične svetlobe pri 260 nm (absorbirajo baze v DNK) in 280 nm (absorbirajo proteini). Večji kot je količnik, Q = I abs(260nm) I abs (280nm) (1) večja je čistost oz. kvaliteta DNK raztopine. Za namene forenzične DNK analize je dobra čistost okoli Q = 1.4, maksimalna možna pa je Q = Analiza DNK 3.1 Struktura DNK Molekula DNK je polimer: sestavlja jo dolgo zaporedje štirih različnih nukleotidov (monomeri). Vsak od nukleotidov je sestavljen iz sladkorja (deoksiriboze), fosfata in ene od štirih baz: adenin (A), timin (T), gvanin (G) in citozin (C). Sladkorno-fosfatni del sestavlja močno ogrodje, ki je vezano s kovalentnimi vezmi, baze pa so nameščene pravokotno na ogrodje (glej sliko 2). Štiri baze po strukturi delimo v dve skupini: manjše pirimidine (timin in citozin) in večje purine (adenin in gvanin), vse pa so hidrofobne. Molekulo DNK sestavlja dvojna vijačnica sladkorno-fosfatnih ogrodij, ki tečeta v nasprotnih smereh, po dve bazi, ki sta vezani na nasprotni ogrodij, pa se povezujeta s po dvema ali tremi vodikovimi vezmi. Zaradi prostorske 5

6 Slika 2: Prostorska zgradba dvojne vijačnice DNK. strukture baz sta možna le para adenin - timin (dve vodikovi vezi) in citozin - gvanin (tri vodikove vezi) [1]. Ravno ta lastnost omogoča kodiranje informacij v DNK, zaradi komplementarnosti pa omogoča tudi kopiranje teh informacij in tako pomnoževanje molekule (pri celični delitvi, prepisovanju gena na RNK, PCR, itd.). Celotna DNK pri človeku vsebuje okoli tri miljarde baznih parov (ljudje pa imamo po dve različni DNK). Le okoli 1% celotne DNK kodira gene (pri človeku je teh okoli ), ki vsebujejo zapis za izdelavo proteinov in encimov (proteinski katalizatorji biokemičnih reakcij), preko teh pa izgradnjo in krmiljenje večjega dela celičnih struktur in funkcij. Vseh funkcij ostalega dela DNK, imenovanega tudi odvečna DNK, še ne poznamo v celoti [2, 7, 9], med drugim pomagajo pri oblikovanju sekundarne in terciarne strukture DNK (glej 2.2). Del DNK, ki kodira gene (kodirajoči del) je zelo občutljiv na mutacije, ki so večinoma destruktivne, in že sprememba enega samega baznega para lahko pripelje do neuspešnega razvoja nove celice. Posledica tega je, da je na kodirajočem delu zelo malo variacij med različnimi osebami. Celica ima posebne mehanizme (sklopi encimov), ki odpravljajo mutacije na DNK. Taka popravila so možna, ker je informacija zaradi dvojne vijačnice zapisana dvakrat. Če se spremeni ena baza (kot posledica delovanja mutagenih kemikalij, UV svetlobe, itd.), obstaja velika verjetnost, da je njena parna baza ostala nespremenjena [2]. 3.2 Kodiranje informacij v DNK (STR) V nekodirajočem delu pa so prisotni tudi odseki DNK, na katerih se ponavlja enostavna sekvenca dolžine 2-6 baznih parov, celotna dolžina takih sekvenc pa je baznih parov. Ti odseki, imenujemo jih STR (Short Tandem Repeat), nimajo pomembne funkcije, in celični mehanizmi za popravila DNK na njih ne odpravljajo mutacij, zato se na njih ohranjajo v veliko večjem številu [2]. Določeno lokacijo na DNK imenujemo lokus, dejanski zapis na lokusu pa imenujemo alel. Kadar sta v populaciji na enem lokusu prisotna vsaj dva alela in 6

7 Slika 3: Shematični prikaz: isti lokus na treh različnih DNK molekulah, ki vsebujejo tri različne STR zapise (alele). Na robu lokusa sta začetna oligonukleotida (primerja), ki določata ta lokus. je pogostost najredkejšega večja od 1%, govorimo o genetskem polimorfizmu na tem lokusu. Vsaka celica ima dve različni DNK (razdeljeni v dva seta kromosomov: 23 od matere in 23 od očeta), zato ima vsaka oseba na enem lokusu dva alela. Če sta enaka, je oseba homozigot, sicer je heterozigot na tem lokusu. Polimorfni odseki STR so primerni za forenzično DNK analizo, ker za vsak lokus obstaja veliko različnih alelov, hkrati pa so pogostosti dokaj majhne (reda velikosti par procentov za posamzen alel). Poleg tega se različni aleli med seboj razlikujejo po številu ponovitev enostavne sekvence (odtod ime STR) in torej tudi po dolžini (čemur pravimo dolžinski polimorfizem), kar je bistveno za analizo. Za vsak lokus torej obstaja določeno število različnih alelov in za vsak alel določena pogostost v populaciji oz. verjetnost, da imata različni osebi isti alel. Verjetnost za naključno ujemanje pa lahko dramatično zmanjšamo, če hkrati primerjamo več lokusov, saj so aleli na njih med seboj neodvisni in se zato verjetnosti preprosto množijo. Za N lokusov je verjetnost naključnega ujemanja N P = P i (2) i=1 kjer je P i pogostost najdenih alelov na i-tem lokusu. Ta je odvisna od tega, ali je oseba na tem lokusu homozigot ali heterozigot, in sicer velja P i (A 1 A 1 ) = p 2 1 (za homozigote), P i (A 1 A 2 ) = 2p 1 p 2 (za heterozigote) (3) 7

8 A 1 in A 2 sta alela na opazovanem lokusu, p 1 in p 2 pa njuni pogostosti v populacij [5]. Ameriški FBI (Federal Bureau of Investigation) npr. uporablja 13 lokusov, ki so porazdeljeni po skoraj vseh kromosomih. Imenuje jih core lokusi; verjetnost za naključno ujemanje je za ta izbor lokusov manjša kot [10]. Britanska FSS (Forensic Science Service) uporablja še več lokusov in verjetnost za naključno ujemanje je okoli [7]. 3.3 Polimerazna verižna reakcija (PCR) Za uspešno forenzično analizo DNK potrebujemo le okoli 50 pg vzorca, za kar zadostuje že par celic [7], vendar je ta količina veliko premajhna za neposredno analizo fragmentov STR. Najprej moramo pomnožiti število molekul DNK, kar nam omogoča postopek imenovan polimerazna verižna reakcija (Polymerase Chain Reaction ali PCR). Ta ponavadi poteka v mikro epruvetah (volumna nekaj µg) in je v bistvu ena od mnogih biokemijskih reakcij, ki se odvijajo v živih celicah, od kjer so tudi izolirali encim polimeraze. Celotna biokemija DNK temelji na lastnostih kemijskih vezi v vodi: močne kovalentne vezi, ki so za več redov velikosti večje od termične energije kt pri sobni temperaturi, so nosilci informacije (veriga nukleotidov oz. enojna vijačnica 1 ) in posledično je informacija zelo stabilna. Ostale vezi, kot so ionske, vodikove in van der Waalsove, so reda velikosti termične energije, in omogočajo dostop do informacije (dve enojni vijačnici se povezujeta v dvojno vijačnico 2 preko vodikovih vezi med bazami DNK). Termična energija kt znaša pri sobni ali telesni temperaturi približno 2.5 kj/mol, energije ostalih vezi so v Tabeli 2 [2]. tip vezi E v vakuumu [kj/mol] E v vodi [kj/mol] kovalentna ionska vodikova van der Waalsova Tabela 2: Energije kemijskih vezi v vodi in v vakuumu; kt = 2.5 kj/mol Biokemične reakcije Encimi so biomakromolekule, ki zaradi svoje zgradbe selektivno katalizirajo določene biokemične reakcije s sklapljanjem dveh ali več reakcij, od katerih je katalizirana reakcija energijsko neugodna ( G 1 > 0), druga pa energijsko bolj ugodna, kot je prva neugodna ( G 2 < G 1 ) [2]. Snov, ki je v celici (in pri PCR) nekakšen univerzalen nosilec proste energije, je adenozin trifosfat (ATP). S hidrolizo (odcepom H 2 O) kovalentne vezi na fosforju ATP, dobi sistem okoli 54 kj/mol energije. Pri polimerizaciji DNK poteka še daljša reakcijska pot, ki vodi preko adenozin monofostata (AMP) in pirofosfata (P P i ) ter prinese okoli 108 kj/mol energije, ki se nato porabi za tvorbo kovalentne vezi med že obstoječim delom verige ter novim nukleotidom; po tej poti dobimo v splošnem iz snovi A-H in B-OH snov A-B po naslednjih 1 ang. single-stranded DNK ali ssdnk 2 ang. double-stranded DNK ali dsdnk 8

9 kemičnih reakcijah B OH + AT P B O P O 3 P O 3 + AMP A H + B O P O 3 P O 3 A B + P P i P P i + H 2 O 2P i (4) Nukleotidi v posodi PCR nosijo s seboj potrebno energijo za njihovo polimerizacijo (čemur pravimo repna polimerizacija), saj so v obliki deoksinukleotidnega trifosfata (dntp). Dejanska reakcija polimerizacije je (dnmp ) n + dnt P (dnmp ) n+1 + P P i (5) Od deoksinukleotidnega trifosfata se odcepi pirofosfat, kar da energijo za vezavo nukleotida na že obstoječo verigo deoksinukleotid monofosfatov (z drugimi besedami je to ssdnk) in s tem podaljšanje le-te. Grafični prikaz opisanega dogajanja je na sliki 5. Slika 4: Polimerizacija DNK Potek polimerazne verižne reakcije Polimeraza pa ne more začeti sinteze nove ssdnk samo iz prostih nukleotidov (v obliki dnmp) in komplementarne podlage (na začetku je to genomska ssdnk), pač pa rabi še nek kratek (nekaj baznih parov) začek nove ssdnk verige vezan na podlago. Te kratke ssdnk molekule (imenujemo jih začetni oligonukleotidi 3 ) moramo dodati v epruveto pred začetkom reakcije. 3 gr. oligo pomeni malo 9

10 Zaradi specifične zgradbe polimeraze lahko poteka sinteza nove ssdnk samo v eni smeri (torej poteka na dveh komplementarnih ssdnk v nasprotnih smereh). PCR poteka v več zaporednih ciklih, vsak cikel pa se deli na tri korake [11]. Prvi korak je segrevanje vzorca DNK na temperaturo 95 o (odkritje termostabilne polimeraze, ki prenese tako visoko temperaturo je igralo bistveno vlogo pri razvoju PCR); pri tej temperaturi je termična energija dovolj velika, da dvojna vijačnica DNK razpade na dve enojni vijačnici, kar imenujemo denaturacija DNK. Po približno minuti sledi drugi korak, kjer se temperatura zniža na 60 o, pri kateri poteka vezava začetnih oligonukleotidov na specifične lokuse, določene s samo sekvenco začetnih oligonukleotidov (danes lahko z ustreznimi napravami sintetizirajo poljubne sekvence oligonukleotidov do dolžin nekaj sto baznih parov). Ta korak traja med 30 s in 1 min, sledi pa zadnji korak, kjer temperatura naraste na 72 o. To je optimalna temperatura za polimerizacijo DNK, nje trajanje pa je odvisno od željene dolžine novo sintetizirane DNK. Hitrost sinteze je okoli 2000 baznih parov na minuto [11]. Slika 5: Potek PCR: 1. denaturacija; 2. nalaganje začetnih oligonukleotidov; 3. polimerizacija; 4. ponavljanje treh korakov na novih podlagah pripelje do pomnoževanja želenega lokusa. Izbira začetnih oligonukleotidov (dolžina teh je med 16 in 25 baznih parov, kar je dovolj, da se taka sekvenca v genomski DNK pojavi le enkrat) torej enolično določa lokuse, ki se bodo 10

11 pri PCR pomnožili. Po končanem prvem ciklu se količina DNK na izbranih lokusih podvoji, dejanski novo sintetizirani fragmenti (za vsak lokus po en komplementarni par) pa so daljši od samega STR dela (dolžino določa čas pomnoževanja). Pri drugem ciklu predstavljata podlago genomska DNK in novo sintetizirani fragmenti. Iz genomske podlage dobimo zopet enake fragmente kot pri prvem ciklu, iz fragmentov s prvega cikla pa dobimo, zaradi določene smeri sinteze, fragmente, ki vsebujejo samo STR in začetno sekvenco oligonukleotidov na obeh straneh. Količina predolgih STR fragmentov, ki niso dobri za končno analizo raste linearno s številom ciklov, količina pravih STR fragmentov pa raste (na začetku) eksponentno kot 2 N, če je N število končanih ciklov. PCR pa ne more potekati v nedogled. Vse te reakcije so ravnotežne reakcije in zato odvisne tako od količine reaktantov kot produktov. Z manjšanjem števila reaktantov se z vsakim ciklom zmanjšuje tudi učinkovitost PCR. K zmanjšanju učinkovitosti prispeva tudi rekombinacija produktnih fragmentov in razpadanje encima polimeraze, ki ima razpolovno dobo približno 30 min na 95 o. V praksi to pomeni zgornjo mejo nekje med 30 in 40 cikli, kar še vedno prinese večmiljonsko pomnožitev izbranih STR lokusov. [11] 3.4 Kapilarna gel elektroforeza Pri končni analizi ugotavljamo velikost s PCR pomnoženih fragmentov STR. Danes najboljša in najbolj razširjena metoda je kapilarna gel elektroforeza (gel se nahaja v kapilari), ki potrebuje relativno malo vzorca (nekaj pikolitrov) in je lahko skoraj popolnoma avtomatizirana. Osnova kapilarne gel elektroforeze je gel elektroforeza, kjer vzorec (v našem primeru fragmenti ssdnk, uporablja pa se jo še za druge polielektrolite npr. proteine) pod vplivom električne sile potujejo po gelu. Geli so porozne snovi: dolga vlakna gela so skoraj naključno razporejena po prostoru in tvorijo ti. matrico, med luknjami, ki jih tvorijo prekrižana vlakna, pa se nahaja topilo (vodna raztopina pufrov in drugih snovi) [12]. Za analizo fragmentov STR je najbolj primeren poliakrilamidni gel, uporablja pa se tudi agar (predvsem za daljše fragmente) [2, 6, 13]. Ker je molekula (v bistvu makroion) DNK negativno nabita (naboj 1e na nukleotid se nahaja na enem od kisikov na fosfatu [2]), jo električno polje vleče proti anodi, gel in topilo pa predstavljata upor, ki je odvisen od velikosti fragmenta. Posledica je različna gibljivost fragmentov DNK, ki je funkcija njihove dolžine. Če damo torej raztopino vzorca fragmentov DNK na eno stran gela in nanj priključimo elektrodi pod električno napetostjo (nekaj kv), se bodo sčasoma fragmenti DNK razporedili po velikosti Teorija elektroforeze Nabiti delci (fragmenti DNK) v mediju z ioni (pufrska vodna raztopina) zmotijo porazdelitev ionov medija. Nova porazdelitev je določena z ravnovesjem elektrostatičnih in Brownovih sil. Medij razdelimo na dve območji: bližnje (izhodišče je nabit delec), kjer so ioni medija stalno absorbirani na delec in so nemobilni, ter na ostalo območje z mobilnimi ioni. Območje z nemobilnimi ioni se imenuje Sternova plast, območje z mobilnimi difuzna plast, obe skupaj pa električna dvojna plast 4 [13]. Meja med tema plastema je nekako slabo določena in je odvisna tudi od časovne skale. Približno jo podaja Bjerrunova enačba [13] l B = e 2 4πɛ m ɛ 0 kt (6) 4 ang. electric double layer 11

12 Slika 6: Shema kapilarne gel elektroforeze. kjer je ɛ m dielektrična konstanta medija. l B je reda velikosti nm, v vodi je pri sobni temperaturi 0.7nm. V teoriji povprečnega polja je ravnovesna porazdelitev mobilnih ionov podana s Poisson-Boltzmanovo enačbo ɛ m ɛ 0 2 V p = e k ( Z k C k exp ez kv p kt qz k in C k sta nabojna in volumska koncentracija ionov vrste k. Z linearizacijo enačbe (7) dobimo Debye-Hücklovo teorijo, ki velja za difuzno plast. Po tej teoriji je zunanje električno polje v elektrolitu senčeno, potencial V p pada eksponentno z razdaljo od vrednosti na meji plasti V s V p (x) = V s e κx (8) ) (7) Debyeva dolžina senčenja κ 1 je podana z κ 1 = ( ɛm ɛ 0 kt e 2 i z2 i C i ) 1 2 (9) Splošna rešitev Poisson-Boltzmanove enačbe (7) se imenuje Gouy-Chapmanov model [13]. Primerjava napovedi te z natančnimi numeričnimi izračuni in rezultati Monte-Carlo simulacij jo potrjuje kot zelo natančno, vendar za ta primer zadostuje enostavnejši Debye-Hückelov model [13]. Zunanja električna sila deluje na oba, nabit delec in oblak debeline κ 1 s presežkom nasprotno nabitih ionov, ki obdaja delec; ta oblak ionov poleg tega še hidrodinamsko interagira z molekulami medija (viskozni upor). Natančen račun je prekompliciran za to obravnavo, preproste rešitve pa obstajajo za limitna primera: za debelo Debyevo plast (κ 1 večji od dimenzije delca R) lahko ločeno izračunamo električno vlečno silo in viskozno silo. Hitrost delca je v tem primeru sorazmerena s QE, kjer je Q celotni naboj na delcu in E jakost zunanjega električnega polja. Gibljivost je odvisna tudi od oblike, za kroglo dobimo gibljivost µ = v E = Q 6πηR 12 (10)

13 Slika 7: Delec in dve območij električne dvojne plasti: (a) nabit delec dimenzije R, (b) Sternova plast debeline κ 1 z nemobilnimi ioni in (c) difuzna plast z mobilnimi ioni. η je viskoznost medija, R pa radij krogle. V nasprotnem primeru, ko je Debyeva plast majhna v primerjavi z dimenzijami delca, je strig omejen na plast κ 1 okoli delca. Treba je rešiti Navier-Stokesovo enačbo η 2 V p = ρe (11) kjer je ρ rešitev Gouy-Chapmanovega (ali pa Debye-Hückelovega) modela znotraj Debyeve plasti ter nič zunaj. Hitrost v tem primeru postane neodvisna od dimenzije in oblike delca, kar popisuje enačba Smoluchowskega [13] µ = ɛ mɛ 0 ζ η Zeta potencial ζ je potencial na površini delca, pri katerem se pojavi strig v kapljevini medija. V praksi ga je za biomolekule zelo težko izračunati, zato se ga raje dobi eksperimentalno s pomočjo enačbe Smoluchowskega (12). S pojavom elektroforeze je povezan tudi pojav elektroosmoze: na steni kvarčne kapliare se nahajajo negativno nabite silanolne skupine, zato se tudi ob steni pojavi električna dvojna plast s pozitivnimi ioni. Tudi te vleče električna sila in preko striga v kapljevini medija povzročijo gibanje le-tega. Dejanska elektroforetična mobilnost je zato vsota (12) µ = µ 0 + µ eo (13) kjer je µ 0 mobilnost delca (10, 12) in µ eo mobilnost, ki jo povzroča pojav elektroosmoze. Debyeva plast (κ 1 ) je v pufrskih raztopinah majhna, zato velja režim Smoluchowskega [13]. Ioni, ki obdajajo polielektroli, senčijo hidodinamske interakcije čez razdalje večje od κ 1, upor se pojavi le v območju d + 2κ 1, kjer je d debelina polielektrolita. Sledi znano in neugodno dejstvo: mobilnost dolgega in gibkega polielektrolia v kapljevini je neodvisna od njegove velikosti oz. dolžine [13]. Za ločevanje STR fragmentov DNK po velikosti potrebujemo dodaten dejavnik - tega prispevajo vlakna gela v kapilari Teorija gel elektroforeze polielektrolitov Dobra teorija gibanja kratkih DNK fragmentov po gelu je šele v nastajanju, imamo pa več bolj ali manj dobrih teoretičnih modelov na to temo [13]. Teoretski model, ki dobro opisuje 13

14 gibanje kratkih (do 1000 baznih parov) in srednjih (do baznih parov) fragmentov DNK, se imenuje model vrata-hodnik 5 [12]. Ta zavrača obstoj stalnih lukenj med vlakni gela, pač pa predpostavlja obstoj področij majhne in velike gibljivosti. Področja velike gibljivosti (vrata) so tam, kjer je vlakno gela samostojno, področja nizke gibljivosti (hodniki) pa tam, kjer se vlakna gela stikajo in tvorijo križišča. Ko se molekula giblje skozi gel, si sama utira pot in oblikuje luknje. Gibanje poteka diskretno po plasteh, debelina plasti pa je krajša od značilne dolžine molekul vzorca, torej na gibajočo se molekulo deluje več plasti naenkrat. Če molekula naleti na vrata, zaradi velike gibljivosti, premakne vlakna gela le v trenutni plasti. Če pa naleti na hodnik, zaradi majhne gibljivosti, premik vlaken gela v trenutni plasti povzroči tudi premike v sosednjih plasteh in odpre se hodnik. Več hodnikov se lahko zlije v daljši hodnik, ki sega čez nekaj plasti. O tem, ali bo molekula odpirala več vrat ali več hodnikov odloča ravnovesje dveh sil: elektrokinetične, ki jo povzroča gibajoča se molekula in uporne sile, ki jo predstavljajo vlakna gela. Ko je razmerje uporne in elektrokinetične sile veliko, nastajajo predvsem hodniki, ko je majhno, predvem vrata. Če sta enaki, se vrata in hodniki odpirajo z enako verjetnostjo in takrat je tudi največja ločljivost. Zveza med mobilnostjo DNK in obema silama je [12] µ = µ 0 e Fr/Fe (14) µ 0 je mobilnost fragmentov DNK v mediju (brez gela), ki jo podaja enačba (12), F r je uporna sila gela, F e pa elektrokinetična sila molekule. Enačba splošne narave (14) se za primer DNK prevede na enačbo, ki direktno povezuje mobilnost in velikost fragmentov DNK µ = µ 0 Nµ 0 k s + 1 (15) kjer je N velikost fragmenta (število baznih parov) in k s naklon premice v grafu velikosti DNK proti recipročni gibljivosti, ki jo dobimo eksperimentalno. Enačbi (14) in (15) sta pomembni za določanje koncentracije gela pri optimizaciji ločljivosti za dano območje velikosti molekul v vzorcu. Večanje koncentracije povečuje ločljivost pri velikih molekulah, manjšanje koncentracije pa povečuje ločljivost pri manjših molekulah. Vsak gel je karakteriziran s k dc, ki je produkt µ 0 in k s in je neodvisna od sprememb temperature in električnega polja. Hitrost gibanja fragmenta DNK v odvisnoti od njegove velikosti je sorazmerna mobilnosti, in ker je hitrost v povprečju stalna, sledi za prepotovano dolžino l = vt µt = µ 0 t Nµ 0 k s + 1 Kapilarna gel elektroforeza je boljša od navadne gel elektroforeze zaradi več stvari: struktura gela je bolj stabilizirana (značilni premeri kapilar so µm) in daje zato boljše rezultate, zaradi večjega razmerja površina/prostornina se gel manj segreva, kar zopet poveča ločljivost. Zaradi majhne debeline kapilare pa je možna tudi avtomatska optična detekcija. Dejansko merijo čas, ki ga porabijo fragmenti z določenega lokusa DNK, da prepotujejo celotno dolžino kapilare. Vsi fragmenti v raztopini vzorca začnejo potovati po kapilari ob istem času, a imajo glede na svojo dolžino različno hitrost. Na drugem koncu kapilare s pomočjo fluorescence opazujemo njihov prihod. Določen kratek odsek na koncu kapilare osvetljujejo z lasersko svetlobo in opazujejo izsevano svetlobo iz tega odseka. Molekula DNK je le malo fluorescentna, zato že na začetne oligonukleotide vežejo fluorescentne molekule (markerje), in sicer različne (ki fluorescirajo pri različnih valovnih dolžinah) za vsak začetni oligonukleotid, 5 ang. door-corridor model (16) 14

15 zato lahko hkrati opazujejo več različnih lokusov, čemur pravimo multipleksna analiza. Poleg tega dodajo v vzorec še lestvico: oligonukleotide znanih dolžin, ki segajo čez celo opazovnano območje ( baznih parov) in so označeni z dodatnim markerjem. Lestvica služi za zelo natančno umerjanje dolžin in dosegajo ločljivost do enega samega baznega para. Rezultat je elektroferogram: graf amplitude (določa količino) in barve (določa marker oz. lokus ali lestvico) svetlobnega signala v odvisnosti od časa (določa velikost). Če postavimo nek prag za amplitudo, ki pove, ali je določen alel prisoten ali ne, dobimo ti. črtno kodo posameznika. Slika 8: Elektroferogram, kjer je vidna lestvica (rdeče) in dva alela z različnih lokusov (modro in zeleno). 4 Identifikacija Identifikacija poteka na podlagi primerjave dveh ali več črtnih kod, dobljenih na različne načine, npr. primerjava DNK dobljene na kraju zločina in DNK osumljenca. Če se ne ujemata, je to 100% različna oseba, če pa se ujemata, je to z neko verjetnostjo ista oseba. Praktično uporabljane verjetnosti (ki so odvisne od števila in izbire opazovanih lokusov) so nekje od ena proti miljarde in boljše. V primerjavi z očividci, ki dosegajo okoli 50% zanesljivost in glede na to, da je na Zemlji manj kot šest milijard ljudi, je to ogromno. Še vedno pa lahko pride do napake pri zajemu in rokovanju z vzorci (torej človeški faktor) čemur je v laboratorijih posvečena posebna skrb. Razvoj poteka v smeri čimvečje avtomatizacije postopkov, ker se s tem zmanjšuje človeški faktor. Sodni sistemi v vseh razvitih državah upoštevajo dokaze DNK analize kot izjemno močne. V ZDA in Veliki Britaniji je bilo izrečenih že več oprostilnih sodb in tudi preklicov smrtne kazni zgolj na podlegi dokazov forenzične DNK analize [14]. Postavili so tudi državne računalniške baze črtnih kod obsojenih posameznikov, s katero primerjajo DNK najdene na kraju zločina. Ameriška baza CODIS vsebuje že okoli milijon članov [14]. Velja poudariti, da zapisi o posameznikih v takih bazah vsebujejo zgolj podatke o prisotnostih raznih STR alel, te pa ne vsebujejo nobene druge genetske informacije npr. rasne pripadnosti, podvrženost raznim boleznim, ipd. Tehnologija DNK detektivov je vsekakor dozorela, je pa še vedno precej draga in zato omejena. V ZDA so leta 2000 v 109 za CODIS primernih laboratorijih opravili okoli analiz, od tega je bilo nekaj sto zadetkov [14]. V naslednjih letih bo šel razoj predvsem v smeri večje avtomatizacije in pocenitve postopkov, kar bo prineslo večjo dostopnost takšnih analiz. Kriminalci, bojte se! 15

16 Literatura [1] James D. Watson and Francis H. Crick. Molecular structure of nucleic acids; a structure for deoxyrobose nucleic acid. Nature, 171: , [2] Bruce Alberts, Dennis Bray, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and James D. Watson. Molecular Biology of the Cell. Garland Publishing, 3rd edition, [3] D. Botstein, R. C. White, M. Skolnick, and R. W. Davis. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet., 32: , [4] R. K. Saiki, S. Scharf, F. Falowa, K. B. Mullis, G. T. Horn, H. A. Erlich, and N. Arnheim. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230: , [5] Thomas Curran. Forensic DNA Analysis: Technology And Application. Svetovni splet, [6] Norah Rudin and Keith Inman. An Introduction to Forensic DNA Analysis. CRC Press, 2nd edition, [7] Mark Benecke. DNA typing in forensic medicine and in criminal investigations: a current survey. Naturwissenscheften, 84: , [8] National Institute for Justice. What Every Law Enforcement Officer Should Know About DNA Evidence. Svetovni splet. [9] Mark Benecke. Collection and handling of forensic DNA samples. Svetovni splet, http: // [10] Christian M. Ruitberg, Dennis J. Reeder, and John M. Butler. STRBase: A short tandem repeat dna database for the human identity testing comunity. Nucleic Acids Research, 29: , [11] Ed Rybicki. PCR Primer Design and Reaction Optimisation. Svetovni splet, http: // [12] Branko Kozulić. Models of gel electrophoresis. Analitical Biochemistry, 231:1 12, [13] Jean-Louis Viovy. Electrophoresis of dna and other polyelectrolytes: Physical mechanisms. Review of Modern Physics, 72: , [14] US Department of Justice. The FBI s DNA and Databasing Initiatives. Svetovni splet. 16