Kesan Sitokinin Terhadap Arabidopsis thaliana Transgenik 35S::ABP57

Transcription

1 Undergraduate Research Journal for Biomolecular Sciences and Biotechnology ISSN Kesan Sitokinin Terhadap Arabidopsis thaliana Transgenik 35S:: Muhammad Aiman Hafiz Jaya Karso, Tan Lay Wen & Noor Liyana Sukiran * Pusat Pengajian Biosains dan Bioteknologi, Fakulti Sains dan Teknologi, Universiti Kebangsaan Malaysia, 436 Bangi, Selangor, Malaysia Institut Biologi Sistem (INBIOSIS), Universiti Kebangsaan Malaysia, 436 Bangi, Selangor, Malaysia * mel-e pengarang rujukan: liyana@ukm.edu.my Abstrak: Protein pengikat auksin 57 () merupakan reseptor bagi auksin yang terdapat pada padi dan terlibat dalam pengaktifan plasma membran H + -ATPase. Terdapat dua tapak pengikatan bagi fitohormon auksin, asid indol-3-asetik (IAA) pada protein ini iaitu tapak pengikatan primer dan sekunder. Kajian lepas yang telah dijalankan menunjukkan Arabidopsis transgenik yang membawa konstruk 35S:: lebih rintang terhadap tekanan abiotik seperti kemarau dan saliniti. Pertumbuhan akar pada Arabidopsis transgenik yang dikenakan tekanan abiotik adalah lebih baik daripada jenis liar. Selain daripada faktor persekitaran, pertumbuhan akar turut dipengaruhi oleh fitohormon seperti auksin, sitokinin, dan etilena. Kajian ini dijalankan bagi mengkaji kesan sitokinin terhadap Arabidopsis yang mengandungi pengekspresan berlebihan. Analisis peratus percambahan menunjukkan bahawa sitokinin tidak memberikan kesan yang signifikan terhadap percambahan biji benih. Namun, sitokinin didapati telah mempengaruhi pemanjangan akar Arabidopsis secara negatif. Analisis pengekspresan gen telah menyokong fenotip pertumbuhan akar yang telah diperhatikan. Transkrip paling banyak diekspreskan pada anak benih transgenik yang ditanam pada media kawalan dan pengekspresan semakin berkurangan apabila kepekatan sitokinin yang dikenakan semakin tinggi. Hasil ini mencadangkan bahawa pengekspresan berlebihan menyebabkan pemanjangan akar pada Arabidopsis. Namun, perencatan pengekspresan oleh sitokinin menyebabkan pertumbuhan akar yang terhad. Kata kunci: Arabidopsis thaliana; Sitokinin; Protein pengikat auksin 57 (); pemanjangan akar Abstract: Auxin Binding Protein 57 () is an auxin receptor that was isolated from rice and plays a role in the activation of H + -ATPase plasma membrane. There are two binding sites for auxin, indole-3-acetic acid (IAA) on this protein which are primary and secondary binding sites. Previous research on Arabidopsis carrying the 35S:: construct showed that the transgenic Arabidopsis is resistant to abiotic stress such as drought and salinity. The root growth of the transgenic plant under abiotic stress is better than wild type (). Besides environmental factors, root growth is also affected by phytohormones such as auxin, cytokinin and ethylene. This research was conducted to investigate the effect of cytokinin to Arabidopsis that contains overexpression of. Seed germination analysis shows that cytokinin did not have a significant effect on germination. However, cytokinin negatively affects root elongation. The expression analysis of explains the phenotype of root growth that has been observed. The transcript was highly expressed in transgenic seedlings on the control media, whereas its expression was decreased with the increased concentration of cytokinin. These results suggest that overexpression caused root elongation in Arabidopsis, whereas the inhibition of expression by cytokinin limits root growth. Keywords: Arabidopsis thaliana; cytokinin; Auxin-Binding Protein 57 (); root elongation 6

2 . Pengenalan Pertumbuhan dan perkembangan sesuatu tumbuhan amat dipengaruhi oleh tindakan hormon. Salah satunya adalah sitokinin yang merupakan hormon terbitan daripada adenin. Sitokinin berfungsi dalam mengawalatur pembahagian sel, mengawal proses pembentukan dan aktiviti pucuk meristem, pengguguran daun, pergerakan nutrien, percambahan biji benih dan juga gerak balas terhadap tekanan biotik dan abiotik (Werner et al. 3). Tumbuhan yang kekurangan hormon ini dijangka tidak boleh mempunyai pucuk atau batang yang banyak kerana sitokinin berperanan untuk menggalakkan proses pertumbuhan pucuk pada sesuatu tumbuhan. Protein pengikat auksin 57 () merupakan protein yang dipencilkan daripada padi dan bersaiz 57 kda (Kim et al. ). mempunyai fungsi sebagai reseptor auksin dan terlibat dalam pengaktifan plasma membran H + -ATPase (Kim et al. ). Pam H + -ATPase ini mengawal kecerunan elektrokimia dengan mengekalkan ph yang sesuai di dalam sel bagi penyerapan nutrien. Gen mempunyai jujukan cdna bersaiz 539 nt dan mempunyai persamaan fungsi biokimia dengan gen ABP yang berasal daripada Arabidopsis thaliana (Kim et al. ). Arabidopsis thaliana merupakan tumbuhan kecil yang digunakan secara meluas dan merupakan model dalam biologi tumbuhan. Arabidopsis mempunyai genom yang kecil iaitu sekitar Mb. Arabidopsis juga mempunyai kitar hidup yang singkat dan mengambil masa hanya dalam enam minggu untuk tumbuh menjadi pokok yang matang. Arabidopsis juga menghasilkan biji benih yang banyak dan mudah untuk ditanam. Selain itu, transformasi genetik amat mudah dilakukan ke dalam Arabidopsis dan ini menjadikannya satu tumbuhan yang paling banyak digunakan dalam kajian genetik dan biologi molekul (Meinke et al. 998). Kajian lepas menunjukkan bahawa Arabidopsis yang membawa konstruk pengekspresan berlebihan (35S::) mempunyai kerintangan dan pertumbuhan akar yang baik terhadap tekanan abiotik. Selain daripada faktor persekitaran, sitokinin turut mempengaruhi pertumbuhan akar. Oleh itu, Arabidopsis transgenik 35S:: digunakan untuk mendalami fungsi dalam perkembangan anak benih semasa diberikan rawatan sitokinin. Analisis percambahan dan pemanjangan akar Arabidopsis transgenik telah dilakukan di samping analisis pengekspresan gen pada anak benih yang ditumbuhkan di atas media yang mempunyai kepekatan sitokinin yang berbeza.. Bahan dan Kaedah. Bahan dan keadaan pertumbuhan Biji benih Arabidopsis thaliana ekotip Col- jenis liar () dan transgenik yang membawa konstruk pengekspresan berlebihan, 35S:: (titisan 4.4) diperoleh daripada Makmal Bioteknologi Tumbuhan, Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM). Pensterilan permukaan biji benih telah dilakukan sebelum dipiringkan ke atas media Murashige & Skoog (MS). Biji benih yang telah dipiringkan diletakkan di dalam kebuk pertumbuhan bersuhu 5 C dengan ketetapan 6 jam cahaya dan 8 jam gelap.. Analisis percambahan biji benih Biji benih Arabidopsis dan transgenik 35S:: ditumbuhkan di atas media kawalan (MSO) dan MS bercampur sitokinin (BAP) dengan kepekatan. µm sebanyak dua replikasi. Kemunculan radikel dan kotiledon hijau telah diperhatikan dan direkodkan selama 7 hari. Pengiraan peratusan percambahan adalah seperti berikut: Peratus percambahan (%) = (jumlah biji benih bercambah / jumlah biji benih ditanam). 6

3 .3 Analisis pemanjangan akar anak benih Biji benih Arabidopsis dan transgenik 35S:: ditumbuhkan di atas media kawalan (MSO). Selepas 5 hari diletakkan di dalam kebuk pertumbuhan, anak benih dipindahkan kepada media MS yang mempunyai kepekatan hormon BAP yang berbeza iaitu,, dan 5 µm sebanyak 3 replikasi. Pemanjangan akar dan perubahan morfologi akar diperhatikan selama 4 hari dan pemanjangan akar telah direkodkan..4 Pemencilan RNA jumlah dan analisis ketulenan RNA jumlah Sampel RNA dipencilkan daripada anak benih Arabidopsis transgenik 35S:: yang telah tumbuh pada media MS dengan kepekatan BAP yang berbeza (,, dan 5 µm) selama 4 hari. Pemencilan RNA jumlah dilakukan menggunakan reagen TRIzol (Invitrogen). Kuantiti dan ketulenan RNA yang telah dipencilkan ditentukan dengan menggunakan spektrofotometer dan analisis elektroforesis..5 Rawatan DNase dan sintesis bebenang cdna Rawatan DNase dilakukan menggunakan RQ RNase-Free DNase (Promega) untuk menyingkirkan kontaminasi genomik. Sintesis bebenang cdna dilakukan dengan menggunakan kit SuperScript IV Reverse Transcriptase (Invitrogen)..6 Tindak balas transkripsi berbalik rantai polimerase (rt-pcr) Bebenang cdna yang telah disintesis daripada Arabidopsis transgenik 35S:: digunakan dalam tindak balas rt-pcr. Tindak balas rt-pcr dilakukan dengan menggunakan GoTaq Green Master Mix (Promega). Dua jenis pasangan pencetus telah digunakan dalam tindak balas ini iaitu pencetus spesifik gen dan ACT (Jadual ) yang berperanan sebagai kawalan dalaman. Jadual. Jujukan pasangan pencetus dan ACT Gen Pencetus Suhu pelekatan ( C) Jujukan Hadapan 54 5'- ATGGCAGAGATTGTTAGTTC -3' Berbalik 5'- CTAAAATTTCAGGCGCAGTA -3' ACT Hadapan Berbalik 56 5'- GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG -3' 5'- AACGACCTTAATCTTCATGCTGC -3' 3. Hasil dan Perbincangan 3. Analisis percambahan biji benih Untuk mengetahui sama ada kesan rawatan sitokinin secara eksogenus mempengaruhi percambahan, kedua-dua biji benih dan 35S:: ditanam di atas media MSO dan MS +. µm BAP. Pada Rajah a, dapat dilihat bahawa tiada perbezaan ketara pada peratus percambahan bagi kedua-dua jenis biji benih yang ditanam di atas media MSO. Walaupun biji benih transgenik 35S:: yang ditanam pada media MS +. µm BAP mempunyai peratus percambahan yang lebih tinggi pada hari kedua berbanding biji benih, perbezaan ini adalah tidak signifikan (Rajah b). Ini menunjukkan bahawa sitokinin tidak memberi kesan ke atas percambahan biji benih keduadua Arabidopsis dan transgenik. Walaupun tiada perbezaan peratusan percambahan bagi kedua-dua biji benih dan 35S::, kedua-duanya mempunyai percambahan yang lebih tinggi pada hari pertama di atas piring MS +. µm BAP (7.5%) berbanding di atas piring kawalan MSO (%). Perbezaan ini 6

4 Peratus percambahan (%) Peratus percambahan (%) Undergrad. Res. J. Biomol. Sci. Biotech., 7 mungkin disebabkan oleh kesan sitokinin yang dikatakan melawan kesan hormon asid absisik (ABA) (Kucera et al. 5). Melalui kajian lepas, telah dibuktikan bahawa sitokinin dapat meningkatkan aktiviti percambahan biji benih dengan menggalakkan biosintesis hormon pengawalaturan tumbuhan yang lain iaitu etilena (Kucera et al. 5). Hormon sitokinin menggalakkan percambahan dengan meningkatkan kapasiti biji benih untuk menghasilkan etilena daripada pelopornya iaitu asid -aminosiklopropana--karboksilik (ACC). Sitokinin didapati meningkatkan aktiviti ACC oksidase iaitu enzim yang berperanan dalam memangkinkan penukaran ACC kepada etilena (Babiker et al. 993). Hormon etilena merupakan pengawalatur negatif terhadap ABA, di mana etilena membantu dalam memecahkan kedormanan biji benih (Kucera et al. 5). a) b) Rajah. Graf peratusan percambahan biji benih Arabidopsis dan transgenik (35S::) pada a) piring kawalan MSO dan b) piring MS +. µm BAP. Paksi-y menunjukkan purata peratus percambahan dan bar merupakan sisihan piawai (n=3). 35S:: 3. Analisis pemanjangan akar anak benih Sitokinin merupakan salah satu hormon yang terlibat dalam pertumbuhan akar. Oleh itu, rawatan eksogenus sitokinin yang berbeza kepekatan telah diberikan kepada anak benih Arabidopsis dan transgenik, serta perubahan pemanjangan akar yang berlaku telah diperhatikan. Berdasarkan Rajah a, dapat dilihat bahawa akar bagi kedua-dua jenis anak benih tumbuh pada kadar yang tidak sama, yang mana pertumbuhan akar Arabidopsis transgenik lebih ketara berbanding akar. Pemanjangan akar bagi kedua-dua jenis anak benih tidak begitu berbeza bermula dari hari pertama pemerhatian tetapi mulai berbeza pada hari ke-7 dengan akar anak benih transgenik mencapai panjang 3.5 cm manakala akar hanya sepanjang.8 cm. Selepas 4 hari pemerhatian dilakukan, akar anak benih mencapai kepanjangan 4.9 cm manakala akar Arabidopsis transgenik pula mempunyai kepanjangan 4.63 cm. Berdasarkan Rajah b, akar anak benih transgenik juga tumbuh lebih panjang berbanding pada media MS +. µm BAP namun perbezaannya tidak signifikan. Pada hari ke-4 pemerhatian, panjang akar yang dicapai oleh anak benih dan transgenik masing-masing ialah.79 cm dan.9 cm. Tiada perbezaan pada kepanjangan akar bagi kedua-dua jenis anak benih yang ditanam pada media MS +. µm BAP bermula dari hari pertama hingga hari ke-7 pemerhatian dijalankan (Rajah c). Namun, pada hari ke-8 hingga hari ke-4, dapat dilihat bahawa terdapat sedikit perbezaan di mana akar transgenik 35S:: tumbuh lebih panjang berbanding. Pada 63

5 Panjang akar (cm) Panjang akar (cm) Panjang akar (cm) Panjang akar (cm) Undergrad. Res. J. Biomol. Sci. Biotech., 7 hari ke-4, panjang akar bagi kedua-dua jenis anak benih ialah.5 cm () dan.49 cm (transgenik). Tiada perbezaan yang signifikan diperhatikan pada kedua-dua jenis anak benih ini. Pada media MS + 5. µm BAP (Rajah d), pemanjangan akar kedua-dua jenis anak benih adalah sama dari hari pertama hingga hari terakhir pemerhatian dijalankan. Akar bagi kedua-dua jenis anak benih mempunyai kepanjangan yang sama iaitu.4 cm. a) b) * * c) d) Rajah. Graf pemanjangan akar biji benih Arabidopsis dan transgenik () pada piring a) MSO, b) MS +. µm BAP, c) MS +. µm BAP, dan d) MS + 5. µm BAP. Paksiy merupakan purata peratus percambahan dan bar menunjukkan ralat piawai (n=5). Asterisk (*) pada graf menunjukkan terdapat perbezaan yang signifikan (p<.5) di bawah analisis statistik T- test. Pada semua kepekatan sitokinin yang berbeza, perbezaan pemanjangan akar antara dua jenis anak benih yang signifikan hanya dapat dilihat pada media kawalan MSO. Sedikit perbezaan dapat dilihat pada media MS +. µm dan. µm BAP, namun perbezaan ini tidak signifikan. Begitu juga dengan pemanjangan akar pada MS + 5. µm BAP. Pada media kawalan MSO, dapat diperhatikan bahawa pengekspresan gen yang berlebihan memainkan peranan penting dalam pemanjangan akar. Auksin merupakan salah satu hormon yang terlibat dalam perkembangan akar dan hormon ini diperlukan untuk mengaktifkan kompleks CYCLIN-DEPENDENT KINASE A (CDKA). Pengaktifan kompleks CDKA pula diperlukan oleh tumbuhan untuk melakukan proses pembahagian sel (Harashima et al. 7). Pengekspresan berlebihan pada Arabidopsis mungkin meningkatkan isyarat transduksi auksin. Jadi, pengikatan hormon auksin kepada, yang merupakan salah satu protein pengikat auksin mungkin dapat mengaktifkan kompleks CDKA seterusnya meningkatkan aktiviti proliferasi sel (Nowack et al. ). Penghasilan tisu-tisu akar secara optimum menjadikan akar yang terhasil pada Arabidopsis transgenik lebih panjang daripada. Hasil kajian ini juga mendapati bahawa semakin tinggi kepekatan sitokinin, semakin pendek akar yang tumbuh pada kedua-dua jenis anak benih. Hal ini berlaku kerana sitokinin merupakan pengawalatur negatif bagi pertumbuhan akar (Riefler et al. 6). Sitokinin akan merangsang penghasilan hormon etilena dengan meningkatkan aktiviti enzim ACC oksidase yang 64

6 memangkinkan penukaran ACC kepada etilena (Babiker et al. 993). Etilena pula akan mengaruh penghasilan auksin dengan merangsang kapasiti pergerakan auksin. Hormon auksin didapati mempunyai kesan negatif terhadap pertumbuhan akar (Ruzicka et al. 7). Proses pengawalaturan pertumbuhan akar berlaku pada bahagian meristem akar dan zon pemanjangan. Etilena akan mengaruh pengumpulan auksin pada bahagian meristem akar dan zon pemanjangan (Ruzicka et al. 7). Auksin yang dihasilkan pada bahagian pucuk akan dipindahkan ke meristem akar dan zon pemanjangan (Rashotte et al. ). Pemindahan ini berlaku secara basipetal melalui PIN- FORMED (PIN) dan AUXIN TRANSPORTER PROTEIN (AUX) serta diterima oleh TRANSPORT INHIBITOR RESPONSE (TIR) yang akan mengaktifkan gerak balas auksin setempat dan seterusnya bertindak dengan membantutkan pemanjangan akar (Ruzicka et al. 7). 3.3 Analisis ketulenan dan integriti RNA jumlah Pemanjangan akar yang terbantut semasa rawatan eksogenus sitokinin (Rajah ) mungkin berlaku akibat daripada perubahan pengekpsresan di dalam Arabidopsis. Oleh itu, RNA jumlah daripada anak benih transgenik yang tumbuh di atas kesemua media (MSO dan MS + BAP) selepas 4 hari pemerhatian telah dipencilkan. Berdasarkan Jadual, dapat dilihat bahawa nilai bacaan A 6/8 bagi kesemua RNA jumlah Arabidopsis berada dalam julat.8 hingga.. Namun, tidak kesemua bacaan A 6/3 sampel berada dalam julat.8 hingga.. Ini dapat dilihat pada sampel yang dirawat dengan. µm dan. µm BAP masing-masing mempunyai nilai.76 dan.8. Hal ini berlaku mungkin kerana terdapat bahan kontaminasi yang hadir semasa proses pengekstrakan RNA dilakukan. Kepekatan RNA yang diperolehi juga didapati agak memuaskan iaitu antara hingga ke ng/µl. Sebanyak 6 ng RNA jumlah telah diambil daripada setiap sampel bagi menjalankan analisis integriti RNA. Berdasarkan Rajah 3, jalur 8S dan 8S mempunyai intensiti yang sama. Ini menunjukkan bahawa RNA yang telah diekstrak berada dalam keadaan yang baik. Jadual. Bacaan spektrofotometer untuk kepekatan dan ketulenan RNA jumlah daripada Arabidopsis transgenik 35S:: yang tumbuh pada kepekatan BAP berbeza. Sampel A6/8 A6/3 Kepekatan RNA (ng/µl) MS +. µm BAP MS +. µm BAP MS +. µm BAP MS + 5. µm BAP S 8S 3 4 Rajah 3. Elektroforesis bagi RNA jumlah Arabidopsis transgenik 35S:: pada rawatan BAP yang berbeza. Setiap telaga mempunyai sampel yang berlainan: Telaga : MSO; Telaga : MS +. µm BAP; Telaga 3: MS +. µm BAP; Telaga 4: MS + 5. µm BAP. 3.4 Analisis transkripsi berbalik rantai polimerase (rt-pcr) Analisis rt-pcr digunakan dalam kajian ini bertujuan untuk membandingkan pengekspresan gen sasaran iaitu apabila dikenakan rawatan sitokinin yang berbeza kepekatan. Pengekspresan turut dibandingkan dengan pengekspresan gen kawalan iaitu Actin (ACT). Gen ACT 65

7 merupakan gen penyelenggara yang sentiasa diekspreskan di dalam Arabidopsis dan dijadikan sebagai kawalan dalaman di dalam eksperimen ini. Rajah 4 menunjukkan jalur bagi tindak balas rt-pcr menggunakan pencetus ACT dan. Dapat diperhatikan gen ACT yang bersaiz ~ nt diekspreskan dengan sekata pada semua sampel yang digunakan. Ini membolehkan perbandingan secara kualitatif dilakukan dengan lebih tepat. Sementara itu, transkrip yang bersaiz.5 kb telah dapat diperhatikan pada sampel. Jalur pada sampel tanpa rawatan BAP mempunyai keamatan yang lebih tinggi berbanding sampel yang dirawat dengan BAP. Dapat dilihat pada gel bahawa keamatan jalur semakin berkurangan apabila kepekatan BAP semakin bertambah. Hasil ini menunjukkan bahawa hormon sitokinin merencat pengekspresan berlebihan gen di dalam Arabidopsis ACT Rajah 4. Corak pengekspresan gen pada Arabidopsis transgenik 35S::. Telaga : MSO; Telaga : MS +. µm BAP; Telaga 3: MS +. µm BAP; Telaga 4: MS + 5. µm BAP dan Telaga 5: kawalan negatif. Pengekspresan yang tinggi tanpa kehadiran BAP menyebabkan pemanjangan akar pada tumbuhan transgenik (Rajah a), manakala pengurangan pengekspresan semasa rawatan BAP menyebabkan pertumbuhan akar yang pendek (Rajah b-d). Sitokinin (BAP) merencat pengekspresan gen dan pengurangan transkrip mungkin menyebabkan CDKA yang berperanan dalam proses pembahagian sel pada akar tumbuhan (Harashima et al. 7) tidak dapat diekspreskan secara optimum. Ini mungkin menjelaskan fenotip akar Arabidopsis transgenik 35S:: yang tumbuh lebih pendek akibat daripada perencatan terhadap proses pembahagian sel akar. Selain itu, sitokinin turut berupaya merencat pertumbuhan akar dengan mengaruh penghasilan etilena yang mana dapat mengaktifkan pengangkutan auksin ke zon pemanjangan akar (Babiker et al. 993; Ruzicka et al. 7). Kedua-dua auksin dan etilena bertindak secara sinergistik semasa pertumbuhan akar (Ruzicka et al. 7). Pengaktifan tapak jalan pengisyaratan auksin oleh etilena menyebabkan gerak balas auksin setempat dan menyebabkan pengumpulan hormon auksin pada bahagian akar (Ruzicka et al. 7). Kepekatan auksin yang berlebihan pula akan merencat proses pemanjangan sel pada bahagian akar (Quint et al. 9). Namun begitu, hubungkait antara dan komponen tapak jalan pengisyaratan auksin masih belum dapat dipastikan. 4. Kesimpulan Dalam kajian ini, kesan sitokinin terhadap percambahan biji benih dan pemanjangan akar Arabidopsis yang membawa konstruk pengekspresan berlebihan (35S::) telah diperhatikan. Hasil ujian percambahan menunjukkan bahawa sitokinin tidak memberi kesan signifikan terhadap percambahan kedua-dua jenis biji benih Arabidopsis. Namun, sitokinin mempengaruhi pemanjangan akar Arabidopsis transgenik secara negatif. Ini dapat diperhatikan pada pertumbuhan akar Arabidopsis transgenik yang pesat pada piring kawalan tanpa BAP tetapi sebaliknya, mengalami perencatan di bawah rawatan sitokinin. Di samping itu, analisis pengekspresan gen ke atas Arabidopsis transgenik menunjukkan bahawa diekspreskan paling banyak semasa ketiadaan sitokinin dan semakin berkurangan apabila kepekatan sitokinin semakin bertambah. Hasil ini dapat menjelaskan fenotip pemanjangan akar Arabidopsis yang terbantut di bawah rawatan BAP. mungkin terlibat dalam pemanjangan sel akar, dan 66

8 perencatan pengekspresan oleh sitokinin mungkin menyebabkan pengurangan terhadap pembahagian sel akar dan seterusnya mengehadkan pemanjangan akar. Penghargaan Kajian ini telah dibiayai oleh Pusat Pengajian Biosains & Bioteknologi, FST, UKM. Kami ingin berterima kasih kepada Prof. Dr. Zamri Zainal atas sumbangan biji benih transgenik, serta pelajar siswazah dan kakitangan Makmal Bioteknologi Tumbuhan (MBT), UKM atas bantuan teknikal yang diberikan. Rujukan Babiker, A.G.T., Butler, L.G., Ejeta, G. & Woodson, W.R Enhancement of Ethylene Biosynthesis and Germination by Cytokinins and -aminocyclopropane--carboxylic acid in Striga asiatica Seeds. Physiologia Plantarum, 89: -6. Harashima, H., Kato, K., Shinmyo, A. & Sekine, M. 7. Auxin is required for the assembly of A-type cyclin-dependent kinase complexes in tobacco cell suspension culture. Journal of Plant Physiology, 64: 3-. Kim, Y.S., Min, J.K., Kim, D. & Jung, J.. A Soluble Auxin-binding Protein, ABP 57 Purification with Anti-Bovine Serum Albumin Antibody and Characterizaton of Its Mechanistic Role in the Auxin Effect on Plant Plasma Membrane H+-ATPase. Journal of Biological Chemistry, 4: Kucera, B., Cohn, M.A., & Metzger, G.L. 5. Plant Hormone Interactions During Seed Dormancy Release and Germination. Seed Science Research, 5: Meinke, D.W., Cherry, J. M., Dean, C., Rounsley, S.D. & Koorneef, M Arabidopsis thaliana: A Model Plant for Genome Analysis. Science, 8, 66. Nowack, M.K., Harashima, H., Dissmeyer, N., Zhao, X.A., Bouyer, D., Weimer, A.K., Winter, F.D., Yang, F. & Schnittger, A.. Genetic Framework of Cyclin-Dependent Kinase Function in Arabidopsis. Developmental Cell, : 3 4. Quint, M., Barkawi, L.S., Fan, K.T., Cohen, J.D. & Gray, W.M. 9. Arabidopsis IAR4 Modulates Auxin Response by Regulating Auxin Homeostasis. Plant Physiology, 5: Rashotte, A.M., Brady, S.R., Reed, R.C., Ante, S.J. & Muday, G.K.. Basipetal Auxin Transport Is Required for Gravitropism in Roots of Arabidopsis. Plant Physiology, : Riefler, M., Novak, O., Stmad, M. & Schmulling, T. 6. Arabidopsis Cytokinin Receptor Mutants Reveal Functions in Shoot Growth, Leaf Senescence, Seed Size, Germination, Root Development, and Cytokinin Metabolism. The Plant Cell, 8: Ruzicka, K., Ljung, K., Vanneste, S., Podhorska, R., Beeckman, T., Friml, J. & Benkova, E. 7. Ethylene Regulates Root Growth through Effects on Auxin Biosynthesis and Transport-Dependent Auxin Distribution. The Plant Cell, 9: 97. Werner, T., Motyka, V., Laucou, V., Smets, R., Onckelen, H.V., & Schmülling, T. 3. Cytokinin-Deficient Transgenic Arabidopsis thaliana Plants Show Multiple Developmental Alterations Indicating Opposite Functions of Cytokinins in the Regulation of Shoot and Root Meristem Activity. The Plant Cell, 5: