UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

Transcription

1 1 UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ MIKROBIOLOGIJA MIKROBIOLOŠKE METODE DELA IN NJIHOV POMEN ZA RAZVOJ* Jerneja BENE (študentka četrtega letnika študija mikroobiologija) prof. dr. Peter Raspor ( mentor) Ljubljana, 1999 *Seminarska naloga pri predmetih Biomasa in sekundarni metaboliti in Mikrobna biotehnologija hrane

2 POVZETEK Za razvoj mikrobiologije kot znanosti je bil potreben razvoj ustreznih metod in metodologije. Seveda mikrobiologija ni izolirano področje znanosti, temveč se prekriva z drugimi vejami le-te (kot so npr. virulogija, imunologija, molekularna biologija in biotehnologija) oz. je celo omogočila njihov razvoj. Leewenhoek je naredil mikroskop in z njim odprl pot v očem neviden svet, Pasteur je ovrgel idejo o spontanem nastanku življenja in Koch izoliral čisto kulturo. Vsi ti raziskovalci (in še mnogi drugi) so zaslužni še za marsikaj drugega s čimer so postavili temelje za razvoj mikrobiologije. Razvoj različnih metod in tehnik za proučevanje mikroorganizmov je šel seveda v korak s časom. Moderne raziskave temeljijo na proučevanju s pomočjo elektronskega mikroskopa in s tehnikami molekularne biologije. Tehnike in tehnologije (metode in metodologije) so bistvenega pomena za vsa področja znanosti. Kot sta zapisala Hall in Crease :"Brez nujno potrebnih tehnik in tehnologij ne bi mogli znanstveniki in raziskovalci svojih še tako briljantnih teorij niti ovreči niti potrditi. Toda s ključnimi tehnikami v rokah se znanost razvija z zastrašujočo hitrostjo,saj lahko ustvarja prave pogoje za preverjanje hipotez." Metode so bistvenega pomena tako za odkrivanje revolucionarnih odkritij kot tudi za preproste laboratorijske meritve. Metoda v znanosti pomeni premišljen postopek ali prijem, ki omogoča določeno natančnost in točnost, in s katerim lahko vedno znova vrednotimo neke količine oz. pripravljamo objekte za manipulacijo. Vsebina te naloge vsebuje opise nekaterih metod, ki se uporabljajo pri proučevanju morfologije in rasti mikroorganizmov, opise nekaterih metod molekularne genetike ter nekatere druge metode, ki se uporabljajo za delo z mikroorganizmi in pri njihovem proučevanju. SUMMARY Microbiology became a science after unique methods were developed, and they are responsible for the continuoing influence of microbiology on subsequently developed fields such as virology, immunology, molecular biology, and biotechnology. Leeuwenhoek's microscope opened an entirely new perspective of life. Koch's introduction of the pure-culture technique and Pasteur's uses of immunological response and chemical analysis remain as influential as now as then. Enzymatic analysis, electron microscopy, and the more recent molecular biology techniques have also powerfully influenced modern research. The ways in which techniques and technology (methods and methodology) have influenced science generally and in historical perspective are the subjects of a pair of trenchant essays by Hall and Crease which are worth quoting here. The developments of gene cloning, DNA sequencing, and scanning tunneling microscopy are among those cited to examplify the enormous transforming power of techniques." In the absence of an essential technique, a researcher or a field flounders, developing elegant theories that cannot be decisively accepted or rejected no matter how many intriguing circumpstantial observations are available. But with a key technique in hand, the induvidual and field move ahead at almost terrifying speed, finding the right conditions to test one hypothesis after another." Techniques play a key role in everything from Nobel-class discoveries to routine measurements carried out by technicians. Although technique is a word that has meaning in a wide variety of context, in science it generally refers to a practice that can be repeated to produce measurements or prepare objects for measurements or manipulation. The content includes definitions of some methods, that are used to observe and study morphology and growth of microorganisms, molecular genetics and some ather general methods. 2

3 KAZALO 1. UVOD Kaj je metoda? Mikrobiološke metode so pomembne tudi za druge veje znanosti Pomen metod za razvoj vede in stroke 4 2. KRATEK ZGODOVINSKI PREGLED MIKROBIOLOGIJE IN NJENIH METOD Spontani nastanek življenja Vzrok nalezljivih bolezni so mikrobi Čiste kulture Razvoj mikrobiologije v 20. st.7 3. METODE SPLOŠNE IN MOLEKULARNE MIKROBIOLOGIJE MIKROSKOPIJA Zgradba mikroskopa Tipi mikroskopov Tipi svetlobnih mikroskopov Tipi elektronskih mikroskopov Priprava preparata STERILNO DELO Sterilizacija Metode sterilizacije MIKROBIOLOŠKA GOJIŠČA IN KULTURE MIKROORGANIZMOV Priprava gojišč Vrste gojišč Čista kultura Bogatitvene kulture RAST MIKROORGANIZMOV IN SPREMLJANJE RASTI Rast na trdnem gojišču Rast v tekočem gojišču Merjenje rasti mikroorganizmov SHRANJEVANJE MIKROORGANIZMOV IN GOJENIH CELIC Metode shranjevanja CELIČNA FRAKCIONACIJA Načini homogenizacije Centrifugiranje REAKCIJE MED ANTIGENI IN PROTITELESI Kromatografske metode Kvalitativne tehnike Kvantitativne tehnike MOLEKULARNA GENETIKA Genska mutacija Prenos genov Transpozonska mutageneza Gensko kloniranje PCR Določanje zaporedja nukleotidov v nukleinski kislini Elektroforeza METODE V TAKSONOMIJI DNA hibridizacijske tehnike Analiza sekvenc 16S in 23S rrna Uporaba nukleotidnih prob ZBIRKE KULTUR INTERVJU ZAHVALA REFERENCE 23 3

4 1.UVOD Mikrobiologija je veda o mikroorganizmih, kot so bakterije, virusi, kvasovke, plesni, alge in protozoji ter o njihovih medsebojnih interakcijah in interakcijah z okoljem. To področje znanosti se je začelo razvijati v 17. st. z izumom mikroskopa (Leeuwenhoek), velik pomen za razvoj pa sta imela "odkritje" sterilizacije (Pasteur), hranilnih gojišč ter tehnike za pridobivanje čistih kultur (Koch). Od teh preprostih tehnik in naprav so tehnike napredovale do tej mere, da danes mikroorganizme proučujemo na molekularni ravni. Napredek, ki ga je omogočil izum elektronskega mikroskopa ter nove tehnike kot so DNA sekveniranje in gensko kloniranje, je vodil do novih znansvenih panog, kot sta genetski inženiring in virologija. 1.1 Kaj je metoda? Tehnike in tehnologije (metode in metodologije) so bistvenega pomena za vsa področja znanosti. Kot sta zapisala Hall in Crease (citiram): " Brez nujno potrebnih tehnik ne bi mogli znanstveniki in raziskovalci svojih še tako briljantnih teorij niti ovreči niti potrditi. Toda s ključnimi tehnikami v rokah se znanost razvija z zastrašujočo hitrostjo, saj lahko ustvarja prave pogoje za preverjanje hipotez. Nove tehnologije so pogosto posledica in rezultat novih teorij. Skoraj vse nepogrešljive metode in tehnike so iznašli ljudje, ki so si želeli učinkovitejših metod ter iznajdljivi raziskovalci, katerim znane metode niso zadoščale pri iskanju odgovorov in dokazovanju teorij." (konec citata). Metoda je premišljen postopek ali prijem s katerim pridemo do željenega materiala. V znanosti je pomembno da lahko z neko metodo (metodologijo), ki omogoča določeno natančnost in točnost,vedno znova vrednotimo neke količine ali pripravljamo objekte za manipulacijo. 1.2 Mikrobiološke metode so pomembne tudi za druge veje znanosti Metode mikrobiologije imajo velik vpliv na medicino, saj omogočajo izolacijo in identifikacijo povzročiteljev bolezni ter zdravljenje. Z mikrobiološkimi tehnikami v biotehnologiji industrijsko proizvajajo antibiotike, vitamine in beljakovine. Mikrobiologija se prekriva tudi z drugimi vedami, kot so biokemija, imunologija, molekularna biologija in parazitologija, prav tako pa je pomembna za določene aspekte veterine, agrikulture prehrambene industrije ter ekologije. 1.3 Pomen metod za razvoj vede in stroke Vedno znova se razvijajo nove tehnologije za detekcijo, identifikacijo in kvantifikacijo mikroorganizmov ter za proučevanje njihove aktivnosti in fiziologije. Metode za identifikacijo in določanje števila mikroorganizmov so pomembne tako za mikrobno ekologijo (za razumevanje strukture in funkcije različnih ekosistemov), kot tudi za ostale veje mikrobiologije. Mikroskopiranje je že od nekdaj osnovni pristop k proučevanju mikroorganizmov, zato je logična posledica ta, da je v več kot sto letih mikroskop doživel neverjetne izpopolnitve in zmogljivosti. To je omogočilo opazovanje (in odkritje) tako majhnih delcev, kot so virusi. Vzporedno so se razvijale tudi različne tehnike priprave ( barvanja) mikroskopskega preparata. Razvoj fluorescentnih prob, občutljivih fotografskih aparatov in relativno cenene računalniške opreme je pomemben za pridobivanje informacij o taksonomiji in fiziološkem stanju posameznih celic v kompleksni združbi organizmov. Tehnika pridobivanja čistih kutur se že desetletja dokazuje kot nepogrešljiva metoda pri mikrobiološkem delu in raziskavah. Z njo lahko na relativno poceni način dobimo podatke o številu, vrsti in metabolni aktivnosti mikroorganizmov. Za kultivacijo prokariontov in evkariontskih miroorganizmov se dandanes uporablja veliko število različnih gojišč: obogatena, kompleksna, definirana, selektivna (obogatitvena, diferencialna, minimalna), ki služijo različnim namenom. Pri bistvenih metodah, ki omogočajo raziskovanje in delo z mikroorganizmi, ne smemo pozabiti različnih tehnik aseptičnega dela in sterilizacije, ki so se prav tako razvijale glede na potrebe.v 4

5 ta namen se uporabljajo različni fizikalni, kemični in mehanski učinki in metode, izbor pa je večinoma odvisen od priročnosti postopka in narave materiala. Razvoj celičnih kultur in metod za koncentriranje je omogočil detekcijo tudi zelo majhnih količin živalskih in človeških virusov, hkrati pa so takšne kulture do neke mere nadomestile uporabo laboratorijskih živali. Revolucionaren vpliv na tok mikrobioloških raziskav pa je imel razvoj metod, ki temeljijo na sekveniranju nukleinskih kislin. Molekularne analize, ki temeljijo na primerjanju sekvence 16S rrna, omogočajo neposredno določanje razlik in podobnosti med mikroorganizmi ter njihovo filogenijo. Seveda prihaja na tem področju do trenja med odkritji o novih taksonomskih povezavah med mikroorganizmi in uveljavljeno taksonomijo. Tehnologija poročevalnih genov omogoča neposredno opazovanje dejavnosti celice. Z njimi lahko namreč označimo skoraj vsakega od genov ter tako neposredno opazujemo njegovo ekspresijo in z lahkoto detektiramo njegov produkt. 2. KRATEK ZGODOVINSKI PREGLED MIKROBIOLOGIJE IN NJENIH METOD Že od nekdaj so sumili, da obstajajo drobna bitjeca, prostemu očesu nevidna, a je bilo njihovo odkritje vezano na iznajdbo mikroskopa. Med prvimi, ki so opisali strukturo mikroorganizmov, je bil Robert Hook (plodeča struktura gliv),a prvi, ki je zares opisal mikroorganizeme, je bil izumitelj mikroskopa (leta 1674) Antoni van Leeuwenhoek. Njegova iznajdba je bila proti sodobnim mikroskopom res smešno preprosta, a je omogočala pogled v svet celo tako majhnih organizmov, kot so bakterije. Svoja opazovanja je poročal na Royal Society of London. Potrdili so jih tudi drugi raziskovalci, toda razumevanje narave in pomembnosti teh majhnih organizmov se je razvijalo zelo počasi. Izpopolnjevanje mikroskopa je v 19.st pripomoglo k napredku mikrobiologije, saj je znanstvenikom omogočalo boljše razumevanje mikroskopsko majhnih organizmov. Zaradi tako (relativno) poznega razvoja mikroskopa in zaradi nepoznavanja osnovnih metod, potrebnih za študij mikroorganizmov, se mirobiologija kot znanost ni razvila do konca 19. st.. Na koncu prejšnjega stoletja pa sta se pojavili dve pomembni vprašanji, ki sta znanstvenike prisilili, da so oblikovali temeljne tehnike, ki so postavile temelj mikrobiološki znanosti: (1) Ali življenje nastane spontano? (2) Kakšna je narava nalezljivih bolezni? Ko so uspeli odgovoriti na ti dve vprašanji, se je začel razvoj mikrobiologije kot ločene veje znanosti. 2.1 Spontani nastanek življenja Čeprav se danes zdi ideja o spontanem nastanku življenja smešna, vendarle ni težko razumeti, zakaj se je v preteklosti porodila ta hipoteza. Vsi vemo, da se hrana pokvari, če jo pustimo nedoločen čas na zraku in zakaj pride do tega procesa (če pokvarjeno hrano pregledamo pod mikroskopom, vidimo, da je polna bakterij). Toda v prejšnjem stoletju jim ni bilo jasno, kako se pojavijo bakterije na pokvarjeni hrani, če jih na svežem živilu ni bilo videti. Nekateri so trdili, da se razvijejo iz»semen«, ki pridejo v hrano iz zraka, drugi pa so zagovarjali aktiven princip (življenje nastane iz nežive materije). Najbolj zagrizen nasprotnik ideje o spontanem nastanku življenja je bil Lois Pasteur (francoski kemik in biolog; ).Domneval je, da gnitje hrane povzročajo bakterije iz zraka, kar je dokazal v svojem znamenitem poskusu s steklenico z ukrivljenim vratom.sklepal je, da so bakterije prisotne tudi na svežem živilu ter da jih je moč ubiti z vročino. Iznašel je postopek, ki mu danes rečemo pasterizacija.s tem, ko je odvrgel teorijo o aktivnem principu, je sprožil razvoj učinkovitih načinov sterilizacije in aseptičnih tehnik, brez česar se mikrobiologija kot znanost ne bi mogla razviti. Zaslužen je tudi za nekatera druga odkritja z različnih področij: opravil je pionirsko delo v stereokemiji, dokazal je, da fermentacijo piva vršijo kvasovke, naredil je cepivo proti antraksu, piščančji koleri in steklini Čeprav je Pasteur uspešno steriliziral večino materiala s preprostim prevrevanjem, se je kmalu izkazalo, da ta metoda ni zadostna za sterilizacijo materiala, ki vsebuje na vročino odporne strukture 5

6 endospore. S tem problemom so se nato ukvarjali znansveniki kot so John Tyndall iz Anglije ter Ferdinand Cohn in Robert Koch iz Nemčije. 2.2 Vzrok nalezljivosti bolezni so mikrobi V 16. st. so domnevali, da gre za prenos neznanega faktorja iz bolne na zdravo osebo, ki pri sledji povzroči enako bolezen. Takšne bolezni so imenovali nalezljive, snov, ki jih je povzročala, pa so označili kot kužno. Po odkritju mikroorganizmov so sklepali, da so le-ti vzrok nalezljivih bolezni, česar pa niso znali dokazati. Raziskovanje v tej smeri sta začela Ignaz Semmelweis in Joseph Lister, trdne dokaze pa je predložil šele Robert Koch ( ). Koch je proučeval antraks ( vranični prisad; bolezen goveda, ki se lahko pojavi tudi pri človeku). Dokazal je,da je bolezen posledica prisotnosti bakterije Bacillus anthracis v krvi obolelih živali in ne obratno (da so mikrobi v telesu posledica bolezni). Majhne količine krvi je namreč prenašal iz obolelih živali v zdrave, ki so nato obolele. Z mikroskopom je dokazal, da je umirajoča žival vsebovala velike količine bakterij. Ugotovil je tudi, da je bakterijo možno gojiti v hranljivi tekočini zunaj telesa živali.ugotovi je tudi, da je ista bakterija po večih prenosih iz starega v novo gojišče še vedno patogena in pri zdravih živalih povzroči antraks. Na osnovi teh in drugih eksperimentov je oblikoval pravila glede pogojev ( Koch-ovi postulati), ki morajo biti izpolnjeni, preden lahko bolezen pripišemo določenemu mikroorganizmu. Koch-ovi postulati pa so hkrati poudarili pomembnost laboratorijskih kultur. 2.3 Čiste kulture Če želimo uspešno proučevati lastnosti posameznih vrst mikroorganizmov, jih moramo imeti v čisti kulturi. Koch se je tega zavedal, zato je razvil metodo za pridobivanje čistih kultur, po kateri posamezno kolonijo iz mešane kulture prenesemo na novo gojišče. Za tako tehniko je potrebno seveda trdo (sterilno) gojišče in aseptično delo.koch je najprej uporabil rezino krompirja, na katerem pa mnogo mikroorganizmov ni rastlo. Zato je naredil poltrdo gojišče in ga strdil z dodatkom želatine.kasneje so odkrili agar (odkrila ga je gospa Hesse, žena enega izmed Kochovih učencev), ki se dandanes uporablja za strjevanje gojišč. Po formulaciji Koch-ovih postulatov so izolirali veliko povzročiteljev nalezljivih bolezni. To je omogočilo izdelavo različnih zdravil za mnoge bolezni in pripomoglo k razvoju moderne medicinske prakse. Sklep, do katerega je prišel Koch da imajo specifični mikroorganizmi specifične učinke (zaradi specifičnih bioloških aktivnosti) je bil pomemben pri uveljavljanju mikrobiologije kot samostojne biološke znanosti Razvoj mikrobiologije v 20. Stoletju V začetku tega stoletja se je začel hiter razvoj medicinske mikrobiologije in imunologije zaradi odkritja mnogih novih patogenov, večjega razumevanja njihovega delovanja na gostitelja ter obrambnega sistema slednjega. Razvila se je tudi mikrobiologija agrikulture. Proučevanje mikroorganizmov tal je v drugi polovici stoletja pokazalo, da so mikrobi koristni za produkcijo antibiotikov in industrijskih spojin. Razvila se je (predvsem po II.svet. vojni) industrijska mikrobiologija. S proučevanjem mikrobnih procesov v vodah se je razvila mikrobiologija voda. Sanitarna mikrobiologija se ukvarja z odpadki (predvsem odpadki gospodinjstev) in razvija procese za mikrobno obdelavo le-teh. To so vse poddiscipline, ki so jih združili pod mikrobno ekologijo. Zgoraj naštete veje mikrobiologije imajo predvsem praktičen namen, uporabljajo pa podatke in dejstva pridobljena s temeljnimi mikrobiološkimi raziskavami. Le-te se ukvarjajo s klasifikacijo (taksonomija), fiziologijo, citologijo in biokemijo mikroorganizmov. Zelo pomembno je tudi proučevanje z genetskega stališča.genetika, fiziologija in biokemija so se začele razvijati predsem med leti , kot posledica vedno boljšega razumevanja DNA in RNA ter sinteze proteinov. Razvila se je molekularna biologija. Omogočila sta jo napredek tehnologije in vedno večje znanje o

7 molekularni genetiki. Ta se je začela takrat, ko so»odkrili«dna kot nosilko genske informacije ( Avery, MacLeod in McCarty; leta 1944). Pomembna je bila tudi predstavitev genske rekombinacije v Escherichia coli (Lederberg in Tatum; leta 1946). Naravnost revolucionarno je bilo odkritje strukture DNA (Watson in Crick; leta 1953), odkritje genskega koda (leta 1966) in razvoj rekombinantnih DNA tehnologij. Nove metode za manipuliranje z genskim materialom se še danes razvijajo in izpopolnjujejo in omogočajo nenehen razvoj in napredek na področju molekularne genetike. Pomembno je bilo tudi odkritje virusov (konec 19.st.), ki so bili bolje proučeni šele na sredini 20. stoletja. Njihovo odkritje je bilo povezano z izdelavo vedno boljših mikroskopov. Do leta 1970 je naše znanje o dogajanjih, ki se vršijo v bakterijski celici, naraslo do točke, ko smo ga lahko uporabili za eksperimentalno manipuliranje z genetskim materialom bakterijskih celic. To je vodilo v razvoj biotehnologije, ki vključuje tudi principe fiziologije in industrijske mikrobiologije. Novi koncept pa je z molekularnim sekvencioniranjem doživela biološka klasifikacija. S to tehniko določanja filogenetskih odnosov med prokarionti je namreč prišlo do resničnega razumevanja evolucije mikroorganizmov. Kot vidimo, je veliko razlogov, da se zavedamo mikroorganizmov in njihove aktivnosti, saj imajo ogromen vpliv na človeka in naravo. Kot je rekel Pasteur : "Vloga neskončno majhnega je neskončno velika." 7 3.METODE SPLOŠNE IN MOLEKULARNE MIKROBIOLOGIJE Vsaka veja mikrobiologije ima seveda metode, ki so zanjo specifične in metode, ki so več ali manj splošne (se uporabljajo na vseh področjih mikrobiologije). Jaz sem se omejila predvsem na metode splošne in molekularne mikrobiologije, saj bi bilo v nasprotnem primeru zelo težko izvesti nalogo (še posebej na omejenem številu strani). Na kratko sem opisala le tipične in bolj znane metode ter predstavila njihovo uporabnost pri delu z mikroorganizmi. 3.1 MIKROSKOPIJA S prostim očesom lahko v ugodnih svetlobnih razmerah opazujemo predmete, ki so večji od nekaj desetink milimetra (spodnja meja ločljivosti človeškega očesa je 0.1 mm). Mikroskop je optična naprava iz sistema leč, ki ležijo v isti optični osi in omogočajo opazovanje predmetov pod večjim zornim kotom in z večjo ločljivostjo kot pri opazovanju s prostim očesom. Zato so zelo uporabni in potrebni pri opazovanju morfološke strukture celic, kar nam pomaga pri njeni okarakterizaciji. To je pravzaprav prvi korak pri študiju mikroorganizma in njegove morfološke klasifikacije Zgradba mikroskopa Ločimo mehanske in optične dele. Pri prvih bi omenila le makrometrski in mikrometrski vijak ter tubus (monokularni ali binokularni), optični del pa je sestavljen iz povečevalnega dela (objektiv in okular) ter sistema za osvetlitev (kondenzor z zaslonko in kolektor z zaslonko). Mehanski deli omogočajo ustrezno namestitev preparata in primerno medsebojno oddaljenost leč Tipi mikroskopov Poznamo dva osnovna tipa mikroskopa: svetlobni in elektronski. Pri prvih se za osvetljevanje preparata uporablja vidna ali ultravijolična svetloba, elektronski mikroskopi pa uporabljajo elektronske žarke in magnetne tuljave namesto leč. Pri svetlobnih mikroskopih je ločljivost omejena predvsem z λ svetlobe, pri elektronskih mikroskopih pa so z uporabo elektronskega žarka (λ = 0.004) povečali ločljivost na mm. Celica in njene sestavine večinoma slabo absorbirajo svetlobo, različne celične strukture pa se med seboj razlikujejo le v optični gostoti (oz. v lomnem količniku), zato so celice večinoma neobarvane,

8 prozorne in slabo kontrastne. Kontrastnost lahko povečamo z različnimi načini barvanja (odvisno od tega, katero strukturo ali lastnost želimo opazovati: obliko, celične stene, kapsule, acidorezistentnost, endospore, bičke, ) ali z uporabo posebnih tipov svetlobnih mikroskopov. Za rutinske raziskave in pridobivanje osnovnih informacij o miroorganizmu se običajno uporablja svetlobni mikroskop, za proučevanje notranjih struktur in procesov pa elektronski mikroskop. Informacije, ki jih dobimo s temi klasičnimi tehnikami so lahko zelo koristne, a se je treba zavedati, da lahko manipulacije z mikrobiološkim preparatom vplivajo na obliko in strukturo mikroorganizmov. Zato lahko pride do napak pri npr. identifikaciji novega izolata bakterije ( predvsem zaradi napačne ocenitve oblike, barvanja po Gramu in gibljivosti). Zato je potrebno pri določenih raziskavah uporabiti dodatne metode Tipi svetlobnih miroskopov: presevni mikroskop se uporablja predvsem za opazovanje zelo prosojnih in obarvanih preparatov; preparat se od ozadja razlikuje po barvi in kontrastu; za opazovanje celic v kulturi se uporablja invertni mikroskop; mikroskopiranje v temnem polju je primerno za opazovanje majhnih prosojnih struktur in struktur, ki odbijajo svetlobo; žarki osvetljujejo preparat s strani, se na površini razpršijo in odbijejo; fluorescenčni mikroskop: pri tem mikroskopu izkoriščamo pojav fluorescence preparat osvetjujemo s svetlobo, ki pri določeni valovni dolžini vzbudi fluorescenco določenih snovi v preparatu; ultravijolični mikroskop uporablja svetlobo zelo majhnih λ za povečanje ločljivosti; slika se projicira na fluorescentni zaslon ali fotografsko ploščo; fazno-kontrastni mikroskop izkorišča uklonske pojave, do katerih pride pri prehodu svetlobe skozi dele preparata, ki imajo različno optično gostoto; uporabljajo se posebni (fazni) objektivi, ki imajo vgrajeno fazno ploščico s kolobarjasto izboklino ( negativni fazni kontrast) ali vdolbino ( pozitivni fazni kontrast); zaradi razlik v optični gostoti in zaradi uporabe posebnih ploščic in zaslonk pride do razlik v amplitudi (pri različnih delih preparata), kar opazimo kot večjo kontrastnost med posameznimi deli preparata; Tipi elektronskih mikroskopov: transmisijski elektronski mikroskop (TEM): v grobem je presevni elektronski mikroskop, podoben svetlobnemu, a ima veliko večjo ločljivost, zato ga uporabljamo za proučevanje ultrastrukture celice; slika nastane zaradi različnega sipanja elektronov na atomih z različnimi atomskimi števili, ki so na različnih mestih v preparatu; elektronski žarek prihaja iz katode (emitira elektrone), pospešujemo pa ga z anodo (pospeševalna napetost določa λ elektronov večja napetost, manjša λ); tok elektronov potuje v vakumu, elektronski žarek pa fokusirajo magnetne tuljave; potreben je fluorescentni zaslon; biološki preparat mora biti čim tanjši, njegovo kontrastnost pa povečamo s solmi teških kovin (npr. ozmijev tetroksid); vrstični elektronski mikroskop (SEM): namen opazovanja preparatov s tem mikroskopom je predvsem tridimenzionalna podoba preparata; omogoča nam neposredno opazovanje površine; zelo ozek elektronski žarek potuje po površini preparata ("scanning") in izbija sekundarne elektrone, ki jih zbira detektor, scintilator pa jih spreminja v fotone, ki se pretvorijo v električni signal, tega pa na televizijskem zaslonu zaznamo kot sliko površine preparata.; ločljivost tega mikroskopa je manjša kot pri TEM; drugi specializirani elektronski mikroskopi: vrstično-transmisijski elektronski mikroskop, visoko napetostni elektronski mikroskop, mikroskop specializiran za spektroskopijo, "scanning tunneling and atomic force" mikroskop (pri slednjem nisem našla ustreznega prevoda) Priprava preparata za mikroskopiranje: 1. s svetlobnim mikroskopom: brez posebne obdelave se lahko pod mikroskopom opazuje le celice, ki običajno živijo samostojno (praživali,krvne celice,spolne celice,celice v kulturi ) ali pa 8

9 celice, katerih povezave lahko enostavno prekinemo (celice različnih epitelov). Preparat pa mora biti vedno v kapljici kapljici fiziološke raztopine. Fiziološke procese v živi celici lahko opazujemo z metodo vitalnega barvanja.lahko pa pripravimo trajni histološki preparat. Pri tem uporabimo različne tehnike fiksiranja (fizikalne ali kemijske metode) in barvanja. 2. z elektronskim mikroskopom : najprej pripravimo poltanke rezine za osnovno orientacijo v preparatu s pomočjo svetlobnega mikroskopa (režemo jih z ultramikrotomom, s steklenim ali diamantnim nožem). Za elektronsko mikroskopijo pa je potrebna priprava ultratankih rezin. Za TEM vnesemo v preparat atome težkih kovin, ki se specifično vežejo na različne strukture v celici. Opazovanje notranjih in zunanjih celičnih površin omogoča metoda zamrzovalnega lomljenja in jedkanja (prav tako uporabna za TEM) preparat dobimo odtisnjen na določenem prerezu oz. lomu (replika), katerega potem opazujemo. Za opazovanje v vrstičnem mikroskopu niso potrebne ultratanke rezine, saj opazujemo le površino. Ustrezno elektroprevodnost in zadosten signal dosežemo z napraševanjem površine preparata z zlatom ali ogljem. Obstajajo tudi metode, s katerimi lahko markiramo specifične makromolekule, ter ugotavljamo njihovo prisotnost in lokalizacijo: encimska histokemija, avtohistoradiografija (molekulo markiramo z radioaktivnim izotopom), imunocitokemija (protitelesa za želen antigen konjugiramo z markerjem oz. uporabimo markirano sekundarno protitelo antigen postane viden, ) 3.2 STERILNO DELO Sterilizacija je postopek s katerim ubijemo vse žive mikroorganizme v ali na nekem materialu. To je zelo pomembna metoda za vsakega mikrobiologa, še posebej pri pripravi čiste kulture. Sterilizacijo lahko izvedemo s fizikalnimi, kemijskimi in mehanskimi učinki. Obstajajo številne metode, izbor pa je večinoma odvisen od priročnosti postopka in narave materiala, ki ga želimo sterilizirati Metode sterilizacije Sterilizacija s pomočjo temperature: tindalizacija je postopek sterilizacije materiala v treh zaporednih dneh (v Kochovem loncu); uporablja se za materiale, ki ne prenesejo avtoklaviranja; avtoklaviranje je sterilizacija z vročo paro pod tlakom (v avtoklavu); primerna je za sterilizacijo večine gojišč, steklene in plastične laboratorijske posode, pipetnih nastavkov, ipd.; suha sterilizacija v sterilizatorjih: predmete, zavite v alufolijo ali pergamentni papir, izpostavimo visoki temperaturi; primerna je za nekatere sestavine gojišč, ki bi jih para uničila; pasterizacija (po Pasteurju) je postopek za zmanjšanje števila mikroorganizmov, predvsem v hrani; uniči večino patogenih mikrobov; ožiganje ob ognju plinskega gorilnika; ožigamo kovinske eze, drugo kovinsko orodje ter vratove kultivacijski posod (erlenmajeric, epruvet, bučk, ) Filtracija: primerna je za hladno sterilizacijo tekočin, predvsem če vsebujejo temperaturno občutljive sestavine (npr. vitamine, antibiotike, serumske proteine ). Filtriramo s pomočjo nadtlaka ali podtlaka s posebnimi filtracijskimi napravami. Večino mikroorganizmov (predvsem bakterij in gliv) zadržijo filtri s porami 0.4 µm še učinkovitejši pa so filtri s porami 0.2 µm. Osnovni tipi filtrov so: - globinski filtri iz slojev celuloznih, azbestnih ali steklenih vlaken - membranski filtri iz acetatne ali nitratne celuloze; delujejo kot sita - nukleoporni filtri iz polikarbonatne folije, ki jo naredimo porozno z nuklearnim obsevanjem; Za membranske in nukleoporne filtre je značilna standardiziranost por. Sterilizacija z visokoenergetskim ionizirajočim obsevanjem: uporabljajo se predvsem gama žarki in katodni žarki. Obsevanje z UV svetlobo je zaradi nizke prodorne moči žarkov primerno le za obsevanje prostorov. 9

10 MIKROBIOLOŠKA GOJIŠČA IN KULTURE MIKROORGANIZMOV V laboratoriju gojimo mokroorganizme na gojiščih. To je tekoč ali trden pripravek, ki specifično služi rasti, shranjevanju in transportu mikroorganizmov. Gojišča za gojitev morajo biti sterilna. Če želimo v takem mediju gojiti mikroorganizme, moramo v gojišče inokulirati majhno količino materiala, ki vsebuje žive celice (= inokulum). Nato sledi inkubacija mikroorganizmi rastejo in se delijo, nastane kultura. Večina bakterij, gliv in protozojev so heterotrofi, ogljik za izgradnjo svojih celic dobijo iz organskih spojin. Nekatere bakterije in alge pa uporabljajo ogljik iz zraka (CO2) in jih imenujemo avtotrofi. Za sintezo celičnega materiala in za svoje vzdrževalne potrebe, potrebujejo izvor energije. Poti pridobivanja energije pa so različne: od fotosinteze do oksidoreduktivnih poti. Če hočemo mikroorganizme gojiti v laboratoriju, jim moramo v gojišču zagotoviti ustrezne vire energije, ogljika, dušika, kisika, fosforja, žvepla, makrominerali- K, Mg, Na, Fe; mikrominerali- Co,Zn, Mo, Mn, Ni, Se,..; vitaminov in rastnih faktorjev Priprava gojišč Najprej zatehtamo sestavine nato pa jih raztopimo z mešanjem in ogrevanjem. Posamezne komponente- dodatke moramo dodati k osnovnemu gojišču še pred vročo sterilizacijo, nekatere dodatke pa šele po njej, ker ne prenesejo visokih temperatur. Te steriliziramo s filtriranjem (glej pri filtriranju). Po sterilizaciji gojišče alikvotiramo v manjše delovne steklenice, epruvete in petrijevke Vrste gojišč Razlikujemo naravna in umetna gojišča. Pri prvih ne poznamo natančne sestave (npr.krompir, sadni sok, serum, mleko ) in niso standardizirana, zato tudi rast bakterij na njih ni vedno enaka. Umetna gojišča so običajno standardizirana in vedno enake kakovosti. Delimo jih lahko na osnovna ali specialna. Slednja pripravljamo iz osnovnih gojišč (le-ta zadostujejo za rast večine prehransko nezahtevnih heterotrofov; primer je peptonska voda, hranilni bujon in hranilni agar) z dodajanjem posameznih komponent. Med njimi ločimo: - obogatena gojišča - kompleksna gojišča: ni znana natančna sestava, saj imajo poleg definiranih mineralnih komponent dodane še naravne komponente; - definirana gojišča: znana je natančna kemična sestava; običajno se uporablja pri proučevanju prehranskih potreb bakterij; - selektivna gojišča: dodamo snovi, ki ustrezajo samo določenim vrstam bakterij, določenim pa zavirajo rast; primer je MacConkey-ev bujon, v katerem zaradi prisotnosti žolčnih soli uspevajo le enterobakterije. Med selektivna gojišča spadajo bogatitveno gojišče (s podpiranjem rasti določenih bakterij le-tem omogočimo, da prerastejo druge vrste), diferencialno gojišče (med sabo ločimo različne vrste bakterij zaradi različnih oblik kolonij ali drugih razlik) in minimalno gojišče ( ne vsebujejo določenih rastnih faktorjev in ne pospešujejo rasti določenih ali vseh avksotrofnih sevov). Od tega, kakšno gojišče bomo uporabili, je seveda odvisno, kakšni miroorganizmi bodo zrasli. Kulture oz. gojišča so lahko po fizikalni obliki trda, poltrda in tekoča, glede na prisotnost kisika anaerobna ali aerobna, glede na to, če imamo v gojišču le eno vrsto mikroorganizmov ali pa več, pa ločimo čiste in mešane kulture. Pridobivanje (izolacija) čiste kulture je možna le na trdem gojišču. Le-ta strjujemo predvsem z agarjem (ekstrakt iz določene morske rdeče makroalge), uporablja pa se tudi želatina. Trdna gojišča se uporabljajo tudi v druge namene, kot so prenos več posameznih kolonij hkrati iz ene plošče na drugo (odtis z žametom), študij fiziologije bakterijskih celic, itn Čista kultura

11 Dandanes zelo uporabljeno sredstvo za strjevanje gojišč je agar. To je polisaharid, ki v ustrezni raztopini tvori gel. Odkritje želatine in kasneje agarja je bistvenega pomena za razvoj mikrobiologije. Omogoča nam namreč izolacijo čistih kultur (na trdem gojišču), kar ima velik pomen za večino biotehniških aplikacij, ki pravzaprav zahtevajo uporabo čistih in determiniranih biokultur. So seveda izjeme, ki gradijo procese na združenih (mlečni izdelki) ali mešanih kulturah. Specifična mikrobiološka tehnika omogoča mikrobiologu izolacijo mikroorganizma iz naravnega okolja. Bogastvo naravnih virov omogoča izolacijo kulture, ki lahko predstavlja izhodišče za neko biotehnološko aplikacijo. Če želimo izolirati nek mikroorganizem, moramo imeti znanje o njegovi fiziologiji, izbiri gojišča in izvajanju selekcijskih pritiskov. Hitrejša pot je seveda nakup kulture. Ne glede na izvor biokulture, pa osnovna tehnika izolacije ostaja enaka: 1. razredčitev suspenzije celic 2. inokulacija v/na trdno gojišče 3. rast ločenih kolonij mikrobnih celic (iz ene celice ena kolonija) posamezno kolonijo lahko z ezo prenesemo na novo gojišče in tako dobimo čisto kulturo. Nekateri mikroorganizmi ne rastejo na trdem gojišču, zato jih po tem postopku ne moremo izolirati. V takšnem primeru lahko posamezen mikroorganizem izoliramo pod mikroskopom. Kolonije različnih mikroorganizmov se med seboj razlikujejo po obliki, velikosti, ustroju (teksturi), profilu, površini in po obliki robb. Lastnosti kolonije so eden od ključev za identifikacijo kulture in potrditev njene čistosti. Razen omenjenih makromorfoloških preiskav se za potrditev čistosti (oz. nečistosti) kolonij oz. kultur uporabljajo tudi mikromorfološke preiskave Bogatitvene kulture Bogatitvene kulture so eno najmočnejših orodij v mikrobiologiji. Prvič jih je uspešno uporabil flamski mikrobiolog Beijerinck v začetku 20. Stoletja. Mikroorganizmom damo na razpolago takšno gojišče in fizikalne pogoje, ki dovoljujejo določeni skupini ali samo določeni vrsti mikroorganizmov, da preraste ostale mikroorganizme v inokulumu. Izvajamo torej nek selekcijski pritisk, ki ga lahko povzročimo z različnimi elektronskimi donorji in akceptorji, ki jih damo v gojišče. Učinek bogatitve lahko spreminjamo tudi z drugimi dejavniki, kot so: ph (npr. nizek ph omogoča prerast acidofilnih mikroorganizmov), temperatura (npr. visoka temperatura favorizira termofilce), dodatek penicilina ali streptomocina (inhibitorja prokariontov) favorizira evkarionte, ipd. Ena od klasičnih bogatitvenih tehnik, ki selekcionira različne tipe mikroorganizmov, ki oksidirajo in reducirajo žveplove spojine, je kolona po Winogradskem (leta 1887 jo je razvil mikrobiolog Winogradsky). Gre za miniaturen predvsem anaeroben ekosistem (le na površini in malo pod površjem so aerobni pogoji), ki je izvrsten in dolgotrajen vir različnih prokariontov (cianobakterije, žveplene škrlatne in žveplene zelene bakterije, nežveplene škrlatne bakterije, heliobakterije, ). Bogatitev nekega mikroorganizma (torej povečati njegov delež v mešani populaciji) je pogosto prvi korak pri pridobivanju čiste kulture. 3.4 RAST MIKROORGANIZMOV IN SPREMLJANJE RASTI Rast na trdnem gojišču Nasledstvo ene same celice, ki raste in se deli na trdnem gojišču, imenujemo kolonija.ta je vidna s prostim očesom. Več kolonij na enem gojišču tvori kulturo. Če gre za samo eno vrsto mikroorganizma, potem rečemo, da je to čista kultura. Pri določenih pogojih rasti ima za posamezno vrsto mikroorganizma kolonija specifične lastnosti: velikost, oblika (ploščate, izbočene, pravilne ali pa iregularne oblike, ), barva, konzistenca (suhe, vlažne, mukozne, ; gladka ali hrapava površina). Bakterije, ki sintetizirajo pigmente, običajno tvorijo obarvane kolonije. Kontinuiran sloj bakterij, ki prerastejo celotno površino trdnega gojišča, imenujemo konfluentna rast Rast v tekočem gojišču 11

12 Po rasti in delitvi celic v tekočem gojišču pride do disperzije celic, ki je posledica difuzije ali pa aktivnega gibanja mikrobov. Večja kot je koncentracija celic v gojišču, večja je motnost gojišča. Možna je tudi rast le na površini oz. na dnu. Poznamo več načinov kultivacije v tekočih gojiščih. Omenila bom le dva tipa: - šaržna kultura (batch culture): inokulum vnesemo v tekoče gojišče in ga inkubiramo pri optimalnih pogojih. Če sledimo razvoju celic (npr. s štetjem mikrobnih celic) v odvisnosti od časa ( naredimo diagram ), dobimo rastno krivuljo za določeno vrsto mikroorganizma, ki je rastel pri določenih pogojih (karakteristična rastna krivulja). Iz rastne krivulje je razvidno, da poteka rast v več fazah: lag faza - celice se adaptirajo na novo okolje, nato sledi eksponencialna ali logaritemska faza celice se delijo in rastejo z maksimalno hitrostjo, nato rast preide v stacionarno fazo zaradi porabe hranil in izločanja odpadnih snovi metabolizma v gojišče število živih celic se ne povečuje, tej fazi pa običajno sledi faza odmiranja. Sestava medija se pri takšnem načinu kultiviranja spreminja hranila se porabljajo, odpadni produkti pa akomulirajo. - Na ta način so včasih proizvajali pekovski kvas, po letu 1916 pa so pričeli uvajati dohranjevanje s substratom (= polzaprti, "fed-batch" sistem), kar omogoča boljše izkoristke izvora ogljika za proizvodnjo biomase. Mikroorganizmi, ki jih kultiviramo, lahko v določenih fazah rasti sintetizirajo t.i. sekundarne metabolite (npr. antibiotike, pigmente, herbicide, bakteriocine, ), kar ima bistven pomen za človeka, z njihovo proizvodnjo pa se ukvarja biotehnologija. - kontinuirana kultura: mikroorganizmi rastejo v tekočem mediju, ki je v kemostatu. Pogoji rasti so kontrolirani in definirani. Gre za kontinuiran dotok svežega in sterilnega gojišča ter za simultan iztok (pri isti hitrosti) kulture (= gojišče + celice). V takih pogojih so celice vedno v logaritemski fazi rasti. Hitrost rasti kontroliramo s koncentracijo nekega esencialnega hranila v gojišču, ki priteka v kemostat. Masa celic (biomasa) v kemostatu ostaja konstantna. Tak način gojenja mikroorganizmov je npr. primeren za študij bakterijskega metabolizma Merjenje rasti mikroorganizmov Merjenje rasti je pomembno tako v splošni in molekularni mikrobiologiji kot tudi za različne biotehnološke procese (fermentacija, produkcija biomase, ). Obstaja več metod za merjenje rasti oz. povečanja celične mase. Vse imajo seveda svoje prednosti in slabosti. Omenila bom le najbolj znane: - direktno štetje: celice štejemo pod svetlobnim mikroskopom; uporabljajo se posebne števne ploščice ; metoda je enostavna in hitra, a ne ločimo med živimi in mrtvimi celicami; da bi ločili žive celice od mrtvih, lahko uporabimo metodo vitalnega barvanja (barvilo gre le v mrtve celice), vendar vedno obstaja verjetnost, da se obarvajo tudi žive celice ( dobimo nenatančen rezultat) -"coulter counter" je naprava, ki s fotocelico šteje delce (celice, spore, ) v suspenziji (le-ta teče v tankem curku mimo fotocelice); uporablja se lahko le za merjenje števila enoceličnih mikroorganizmov (ni primerna za štetje filamentoznih bakterij, alg, gliv in celic, ki tvorijo agregate); - CFU metoda je gojitvena metoda, s katero na trdem gojišču določimo število celic v inokulumu iz števila kolonij, ki so zrasle na mediju. Pri tem seveda predpostavljamo, da zraste ena kolonija iz ene žive celice. Poznamo več metod: metoda štetja na razliti plošči (=razmazovanje), metoda štetja v razliti plošči (= prelivanje) in metoda nakapljane plošče (na ploščo nakapljamo kapljice znanega volumna različnih redčitev); Tukaj naj omenim tudi metodo s filtracijo, ki se uporablja predvsem za določanje števila mikroorganizmov v zelo redkih vzorcih, kot je npr. voda (vzorec sfiltriramo, filter položimo na trdno gojišče, po določenem času pa preštejemo kolonije); - MPN (most probable number): s to metodo določamo (s pomočjo tabele in iz vzorca negativnih ter pozitivnih rezultatov) najverjetnejše število živih organizmov v nekem vzorcu (različne volumne oz. redčitve vzorca nacepljamo v tekoča gojišča; po inkubaciji pomeni pojav motnosti v gojišču 12

13 pozitiven rezultat so prisotni živi mikroorganizmi). Ta metoda se običajno uporablja za mikrobiološko analizo voda (sanitarna mikrobiologija). - tehtanje mokre teže: celice s filtriranjem ali pa s centrifugiranjem ločimo od gojišča ter jih stehtamo; - tehtanje suhe teže: celice sušimo do konstantne teže in jih stehtamo; - merjenje optične gostote : s to metodo merimo odbito (back scattering), sipano (reflectance), absorbirano (absorbance), ali prepuščeno svetlobo (transmitance) v medijih, ki vsebujejo mikroorganizme; - merjenje celičnih komponent: merimo lahko koncentracije različnih celičnih komponent, npr. proteine (z biuretsko reakcijo, Lowry-jevo metodo, absorbcijo peptidnih vezi, ), DNA, ATP (luciferazni test), - spremljanje porabe substrata ali sproščanja značilnega produkta 3.5. SHRANJEVANJE MIKROORGANIZMOV IN GOJENIH CELIC Glavni namen shranjevanja mikroorganizmov oz. kultur je ohranitev njihove viabilnosti, jih ohraniti nekontaminirane in brez genetskih sprememb. V procesu shranjevanja lahko začno celice odmirati, zato je potrebno paziti pri pripravi in samem shranjevanju celic, če želimo kulturo ohraniti dolgo časa (tudi desetletja). Metoda mora omogočiti preživetje veliki večini vseh celic, saj bo preživela populacija samo v tem primeru čim bolj enaka izhodni (npr. ni v redu, če preživijo samo najbolj odporni mikroorganizmi). Mikroorganizme shranjujemo, ker so lastnosti določenih sevov pomembne za industrijsko aplikacijo in za rabo v raziskovalnih laboratorijih. Zato je pomembno, da shranjeni sevi ne izgubijo svojih lastnosti ali dobijo novih. To bi se lahko zgodilo zaradi mutacij ali izgube plazmidov. Prav tako morajo ostati kulture čiste. Metoda za shranjevanje mora verjetnost kontaminacije znižati na minimum. Metoda, ki jo zberemo, je odvisna tudi od števila kultur, ki jih želimo shraniti. Prav tako je pomembno tudi to, kako pomembna je kultura.če bi bile posledice izgube kulture velike, je bolje, da uporabimo metodo, ki tveganje izgube zniža. Če so kulture namenjene distribuciji, jih moramo pripraviti v mnogih "izvodih". Če je potrebno, morajo biti primerne za pakiranje, če jih pošiljamo po pošti, pa mora način pošiljanja ustrezati internacionalni poštni zakonodaji. Kulture, ki jih pogosto rabimo (npr. testni sevi, industrijski in proizvodni sevi, sevi za kontrolo kvalitete, ipd.), se običajno shranjujejo na enostaven in nezamuden način, ki pa mora seveda ustrezno izpolnjevati zgoraj naštete pogoje. Seveda pa pri vsem tem igrajo pomembno vlogo stroški postopka, ki vključujejo ceno tako osebja, opreme in materiala kot tudi prostora in energije Metode shranjevanja Na voljo je več metod, vsaka pa ima seveda svoje prednosti in pomanjkljivosti. Izbira je odvisna od presoje. SUBKULTURA: temelji na nenehnem gojenju seva. Proces inokulacije svežega gojišče nenehno ponavljamo preden stara kultura odmre, vzgojimo iz nje novo. Uporabna je za večino mikroorganizmov. Največji problem predstavlja kontaminacija, ki lahko uniči originalen sev, zato se ta metoda vedno izvaja v paralelki. Primernejša so revnejša gojišča, dobo skladiščenja pa lahko podaljšamo z znižanjem ravni metabolizma (npr. z nižjo temperaturo). SUŠENJE: ta tehnika temelji na eliminaciji vode in onemogočanju rehidracije. Najodpornejše na izsuševanje so glive, nekatere kvasovke in izbrani sevi bakterij. Znanih je več tehnik sušenja:s peskom, prstjo, ilovico, silika gelom, sušenje s suhimi čepki, Po sušenju lahko vzorce spravimo na papirnatih trakovih ali diskih. LIOFILIZACIJA: je proces, pri katerem voda iz zamrznjenega vzorca sublimira. Po sušenju vzorce shranimo v vakumu ali inertnem plinu. Liofilizacijo uporabljamo za shranjevanje kvasovk, gliv, bakterij in nekaterih virusov. Manj primerna je za shranjevanje alg, protozojev, živalskih in rastlinskih celic. Prednosti te tehnike so: možnost priprave dosti serij iste kulture za distribucijo, dolga viabilnost sevov (tudi preko 50 let) in nezahtevni pogoji shranjevanja. 13

14 ZAMRZOVANJE: pri tem postopku vodo "odstranimo" in je organizmom nedostopna, vzorce shranjujemo pri nizkih temperaturah. Ker se celice lahko poškodujejo med zamrzovanjem in kasneje med odtaljevanjem, moramo paziti na hitrost teh postopkov, lahko pa se dodajo tudi krioprotektanti. Shranjevanje pri -70 C se uporablja za bakterije, glive, mikoplazme, protozoe in viruse. Vse bolj pa se uveljavlja zamrzovanje pri -140 C (dušikova para) in -196 C (tekoči dušik), saj so rezultati zelo dobri. V tekočem dušiku lahko uspešno hranimo glive, bakteriofage, viruse, alge, protozoe, bakterije, kvasovke, živalske in rastlinske celice ter tkivne kulture. Pri vseh metodah shranjevanja pa je pomembno, da za posamezno kulturo, ki jo shranjujemo, zapišemo in shranimo čim več podatkov: identifikacija, vir, datum izolacije 3.6 CELIČNA FRAKCIONACIJA Biološki sistemi (organi, tkiva, celice, organeli) so od okolja oz. mikrookolja pogosto omejeni z različnimi strukturami, ki jih moramo razbiti, da sprostimo njihovo vsebino.le tako postane dostopna nadaljnim raziskavam. Proces s katerim razbijemo celične stene in membrane, imenujemo homogenizacija, postopek, ki ji sledi, pa je celična frakcionacija (za izolacijo posameznih celičnih komponent). Produkt homogenizacije je tkivna kaša ali homogenat, ki le redko vsebuje nepoškodovane celične organele. Ta metoda je pomembna za nadaljnje korake v izolaciji neke snovi, zato mora zadostiti nekaterim pogojem, če želimo, da je uspešna: izkoristek mora biti čim večji, kontaminacija z nezaželjenimi snovmi čim manjša (npr. z mikrobi ali encimi)- še posebej če nameravamo celično frakcijo shraniti, razmere pri homogenizaciji pa takšne, da na noben način ne spremenijo strukture iskane snovi. Priporočeno pa je, da izolacijo celičnih komponent (na vseh stopnjah) preverjamo z elektronskim mikroskopom. Pri delu z anaerobnimi mikroorganizmi je pomembno, da specifične komponente zaščitimo pred oksidativno inaktivacijo Načini homogenizacije Navadno si pomagamo s fizikalnimi tehnikami. Najpreprostejši primer je uporaba tarilnice, ki pa se v glavnem uporablja pri odpornejših materialih (običajno rastlinskih). Drugi način je homogenizacija s spremembami pritiskov ob dodanem abrazivnem sredstvu. Bakterijske celice lahko delno razbijemo s stresanjem v prisotnosti steklenih kroglic. V večini primerov pa je bolj uspešna metoda za dezintegracijo bakterij francoska preša. Učinkovita je tudi uporaba ultrazvoka, ki ga oddajajo ultrazvočni dezintegratorji ali sonifikatorji. Za homogenizacijo mehkih živalskih tkiv se uporabljajo mešalci z različnimi nastavki- noži. Na ta način dobimo grobe homogenate, ki jih navadno dodatno homogeniziramo z Elvejham-Potterjevim homogenizatorjem. Poleg fizikalnih načinov homogenizacije lahko določene stene in membrane razgradimo tudi na kemični način in z uporabo različnih encimov. Da je ponovljivost homogenizacije čim boljša, moramo kontrolirati čim več dejavnikov, kot so: temperatura, razmerje med količino medija in težo materiala, čas in hitrost, ph in ionska jakost, itd Centrifugiranje je naslednji korak pri frakcioniranju celic oz. v izolaciji želene snovi. S to metodo se znebimo večjih delcev. Centrifugiranje je preparativna ali analitska metoda, katere princip temelji na različnem usedanju delcev v polju centrifugalne sile (večji pospeški pospešijo proces usedanja). Hitrost sedimentacije posameznega delca je odvisna od delujočega radialnega pospeška, od gostote in velikosti delca ter od gostote in viskoznosti medija. Seveda obstajajo tudi posebne formule za izračun časa vsedanja delcev. V običajnem tkivnem homogenatu se najprej usedejo ostanki tkiva, nato skupki celic, tem pa sledijo posamezne celice, jedra, mitohondriji, lizosomi, mikrosomi (delci endoplazmatskega retikuluma), ribosomi. Vse skupaj tvori usedlino ali sediment. V gornji fazi (supernatantu), ki se bolj ali manj zbistri, pa ostanejo raztopljene molekule in makromolekule. Načini centrifugiranja 14

15 Kot sem že omenila- v grobem ločimo preparativno in analitsko centrifugiranje. Preparativno centrifugiranje je metoda za izolacijo večje količine materiala (običajno za nadaljnje raziskovanje). Na različnih stopnjah izolacije lahko nadomešča počasnejše in manj učinkovito filtriranje (npr. ločitev suspenzoidov od raztopin). Ločimo ga na: -diferencialno centrifugiranje: princip je zasnovan na tem, da večji in gostejši delci sedimentirajo pri manjših pospeških, manjši pa pri večjih. Začnemo sedimentirati pri manjših pospeških. Sediment nato ločimo od supernatanta in ga centrifugiramo pri večjih pospeških. Postopek večkrat ponovimo in z večanjem pospeška izoliramo delce z vedno manjšo gostoto. Da se izognemo zamudnemu ponavljanju in večanju pospeška, lahko to metodo nadomestimo z: -gradientno centrifugiranje: v centrifugirki si pripravimo medij z gradientom gostote, ki je lahko zvezen (kontinuiran) ali nezvezen (diskontinuiran). Od oblike posod pa je odvisno, ali bo gradient konkaven, konveksen ali linearen. Nezveznega lahko pripravimo ročno, zveznega pa s posebnimi mešalci. Pri centrifugiranju posamezni delci sedimentirajo tako dolgo, dokler se njihova gostota ne izenači z gostoto medija. Po končanem centrifugiranju posamezne plasti odpipetiramo ali odtočimo. Posamezne frakcije analiziramo :mikroskopsko (celične delce) ali kemijsko (prisotnost DNA za jedra, encimov, ki so značilni za določen organel npr. citokrom oksidaza za mitohondrije, kisla hidrolaza za lizosome, katalaza za peroksisome, itd.). Analitsko centrifugiranje se uporablja za določanje fizikalnih lastnosti makromolekul ali manjših organelov (npr. ribosomov). Pri tej metodi so pomembni: čistot homogenata, veliki pospeški centrifugiranja in posebne analitske centrifuge. Ta metoda se uporablja v glavnem za določanja molekulske mase proteinov, nukleinskih kislin in manjših organelov. Z njo lahko določamo čistost pripravka ali pa zasledujemo konformacijske spremembe makromolekul (hitrost vsedanja je namreč odvisna tudi od oblike). 3.7 REAKCIJE MED ANTIGENI IN PROTITELESI Vdor antigena v organizem sproži med drugim tudi tvorbo specifičnih protiteles. Protitelesa prepoznavajo in vežejo antigen tako v organizmu (in vivo) kot tudi izven njega (in vitro). Prvo dogajanje sodi v sklop imunskega sistema in pripomore k odstranjevanju antigena iz organizma. Specifična vezava protitelesa na antigen in vitro pa je osnova številnim imunskim tehnikam, ki jih uporabljamo za dokazovanje (kvalitativni testi) in količinsko vrednotenje (kvantitativni testi) antigena (= Ag) oz. protiteles (=Ab) v telesnih tekočinah (serum, plazma, urin, ascites, itd.) pri laboratorijski diagnostiki različnih bolezni kot tudi pri raziskovalnem delu. Protitelesa imajo kot»reagenti«dve pomembni lastnosti: 1.) so specifični za nek antigen; 2.) njihova bivalentna zgradba nam omogoča, da na njih vežemo sekundarna označena protitelesa in s tem naredimo reakcijo vidno. Dandanes so znane metode za produkcijo monoklonskoh protiteles MAb (razvila sta jih Kohler in Milstein) proti praktično katerikoli molekuli, kar seveda ni poceni. Produkcija poliklonskih protiteles je mnogo bolj preprosta. Potrebni so le Ag, brizgalka in laboratorijska žival (npr. zajec). Običajno je pri pripravi protiteles potrebna uporaba različnih vrst kromatografij, zato bi povedala nekaj malega tudi o teh tehnikah Kromatografske metode Kromatografske metode so vse tiste metode, ki ločujejo snovi (molekule, proteine, ) med seboj na podlagi njihove porazdelitve med stacionarno in mobilno fazo. Do tega pojava pride zaradi različnih afinitet različnih snovi do ene in do druge faze. Snov potuje čez ti dve fazi z neko hitrostjo, najpomembnejši zaviralni faktor pa je običajno adsorbcija. V osnovi je tehnična izvedba kromatografij vedno tankoplastna ali pa kolonska. Prve so običajno analitske, druge pa za preparativne namene. Nekatere osnovne kromatografske metode so: - papirna kromatografija - tankoplastna kromatografija - plinska kromatografija 15