1. TEDEN (sreda )

Transcription

1 1. TEDEN (sreda ) - Kompletnost okolja in razgradnja organskega materiala (variante A, B, C, D, E, F, G, H, I) v treh ponovitvah. Tedensko ali 14-dnevno merjenje količine proizvedenega CO 2 - Izkoristek porabe organskega substrata v odvisnosti od faktorjev okolja (eksperimetalne variante A,B, C in D v dveh ponovitvah). Določanje mikrobne biomase. * - Velikost združbe amilolitičnih mikroorganizmov v vzorcih vode in tal (MPN v mikrotiterskih ploščah; obdelovana tla, travniška tla, rečna voda, ustekleničena voda, rečni sediment, morski sediment). - Delež amilolitičnih mikrobov v mikrobni združbi (nacepljanje na plošče). - Velikost združbe metan oksidirajočih bakterij v vzorcih vode in tal (MPN v mikrotiterskih ploščah; obdelovana tla, travniška tla, rečna voda, ustekleničena voda, rečni sediment, morski sediment). 2. TEDEN (sreda ) - Velikost mikrobne združbe anaerobnih mineralizatorjev organskega žvepla v vzorcih vode in tal (MPN v mikrotiterskih ploščah; obdelovana tla, travniška tla, rečna voda, ustekleničena voda, rečni sediment, morski sediment). - Velikost mikrobne združbe sulfatnih respiratorjev v vzorcih vode in tal (MPN v mikrotiterskih ploščah; obdelovana tla, travniška tla, rečna voda, ustekleničena voda, rečni sediment, morski sediment). - Vpliv kisika na sulfatno respiracijo (varianti A in B v dveh ponovitvah) - Sulfatna respiracija v sedimentu (variante A, B, C, D, E v rečnem in morskem sedimentu) 3. TEDEN (sreda, ) - * Določanje mikrobne biomase (biuret) in kvalitativno določanje škroba oz. glukoze, izračun - Odčitavanje MPN (velikost mikrobne združbe amilolitičnih mikroorganizmov) - Pregled in kvantifikacija deleža amilolitov v mikrobni združbi (pregled nacepljenih plošč) - Mirobna biomasa; s substratom inducirana respiracija (SIR), meritve, določanje volumna plinske faze in izračun. 1

2 4. TEDEN (sreda, ) - Kapaciteta za mineralizacijo (varianta A in B v dveh ponovitvah), analiziranje vzorcev. - Vpliv organske snovi s širokim razmerjem C : N na mineralizacijo dušika (Variante A, B, C, D, E, F), analiziranje vzorcev. - Velikost mikrobne združbe nitrifikatorjev v vzorcih vode in tal (MPN v mikrotiterskih ploščah; obdelovana tla, travniška tla, rečna voda, ustekleničena voda, rečni sediment, morski sediment). - Vpliv ph na nitrifikacijo - Vpliv aeriranja na nitrifikacijo - Vpliv dodajanja obogatene kulture na proces nitrifikacije v tleh (Variante A, B, C, D), analiziranje vzorcev. - Velikost mikrobne združbe denitrifikatorjev v vzorcih vode in tal (MPN v mikrotiterskih ploščah; obdelovana tla, travniška tla, rečna voda, ustekleničena voda, rečni sediment, morski sediment). - Vpliv aeriranja in organske snovi pri denitrifikaciji (Varianta A in B v dveh ponovitvah) - Ugotavljanje kapacitete vzorca za denitrifikacijo z merjenjem N 2 O (variante A, B, C, D, E v treh ponovitvah) - Odčitavanje MPN (velikost mikrobne združbe metan-oksidirajočih bakterij) 5. TEDEN (sreda, ) - Molekularne tehnike - Plinska kromatografija 6. TEDEN (sreda, ) - Merjenje N 2 O pri vaji ugotavljanje kapacitete vzorca za denitrifikacijo (tri ponovitve), določanje volumna plinske faze - Izračun pri vaji SIR in N 2 O - Velikost mikrobne združbe amonifikatorjev v vzorcih vode in tal (MPN v mikrotiterskih ploščah; obdelovana tla, travniška tla, rečna voda, ustekleničena voda, rečni sediment, morski sediment). 7. TEDEN (sreda ) NI VAJ 8. TEDEN (SREDA, ) - Teorija MPN - Meritve v mikrobni ekologiji 2

3 9.TEDEN (sreda, ) - Odčitavanje MPN (velikost mikrobne združbe anaerobnih mineralizatorjev organskega žvepla) - Odčitavanje MPN (metan oksidirajočih bakterij) - Odčitavanje MPN (velikost mikrobne združbe sulfatnih respiratorjev) - Odčitavanje MPN (velikost mikrobne združbe nitrifikatorjev) - Odčitavanje MPN (velikost mikrobne združbe denitrifikatorjev) - Pregled rezultatov sulfatne respiracije v sedimentu - Pregled rezultatov vpliva kisika na sulfatno respiracijo - Pregled izmerjenih vrednosti pri kapaciteti za mineralizacijo N - Pregled izmerjenih vrednosti za vpliv organske snovi s širokim razmerjem C:N na mineralizacijo dušika - Pregled rezultatov vpliva aeriranja na nitrifikacijo - Pregled rezultatov vpliva ph na nitrifikacijo - Pregled izmerjenih vrednosti pri vplivu dodajanja obogatene kulture na proces nitrifikacije v tleh - Pregled rezultatov vpliva aeriranja in organske snovi na denitrifikacijo - Pregled izmerjenih rezultatov za kompletnost okolja in razgradnjo organskega materiala (količina nastalega CO 2, teža razgrajene celuloze) - Odkop v zemljo zakopanih listov celuloze 10.TEDEN (sreda, ) - Pregled rezultatov in diskusija - Navodila za pripravo poročila 3

4 UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA ŽIVILSTVO PRAKTIKUM IZ MIKROBNE EKOLOGIJE za študente MIKROBIOLOGIJE David Stopar, Blaž Stres in Ivan Mahne Ljubljana, 2006

5 Kazalo I. UVOD 1 1.Povzetek pojmov 1 Ekologija- osnovna terminologija 1 Nepisana pravila v ekologiji 1 Kaj različni ljudje pojmujejo pod ekologijo 1 Komponente ekosistema 2 Kroženje energije snovi 3 Biogeokemijski procesi pomembni pri kroženju snovi 3 Prehranjevalni spleti 4 Mikrobna prehranjevalna zanka 4 2. Meritve v mikrobni ekologiji 5 Napake zaradi merilnih naprav 6 Napake zaradi neprimerne analitične metode 6 Napake pri vzorčenju 6 Splošna pravila pri vzorčenju mikrobioloških vzorcev 7 Primeri izračunavanja eksperimentalnih napak 7 3. Plinska kromatografija 11 Aparatura 11 Nosilni plin 11 Kolone 11 Detektorji 13 Meritev CO 2 in N 2 O 14 II. OGLJIK 15 1.Kompletnost okolja in razgradnja organskega materiala 15 Vaja 1: Eksperimentalni model za proučevanje razgradnje celuloze Izkoristek porabe organskega substrata v odvisnosti od faktorjev okolja 19 Vaja 1: Eksperimentalni model porabe škroba in glukoze v okolju Velikost združbe in delež amilolitičnih mikrobov v vzorcih tal in vode 22

6 Vaja 1: Velikost združbe amilolitičnih mikroorganizmov v vzorcih vode in tal 22 Vaja 2: Delež amilolitičnih mikrobov v mikrobni združbi Mikrobna biomasa 26 Vaja 1: S substratom inducirana respiracija (SIR ) Metan oksidirajoče bakterije 29 Vaja 1: Velikost združbe metan-oksidirajočih bakterij 29 III. ŽVEPLO Mineralizacija žvepla 32 Vaja 1: Anaerobna mineralizacija organskega žvepla Redukcija sulfatov 34 Vaja 1: Velikost združbe sulfatnih respiratorjev 34 Vaja 2: Vpliv kisika na sulfatno respiracijo 35 Vaja 3: Sulfatna respiracija v sedimentu 36 IV. DUŠIK Mineralizacija dušika 38 Vaja 1: Velikost združbe amonifikatorjev 38 Vaja 2: Vpliv kisika in razmerja C:N organske snovi na kapaciteto za mineralizacijo dušika 40 Vaja 3: Določanje NH + 4 -N in (NO - 3 +NO - 2 )-N Nitrifikacija 47 Vaja 1: Velikost mikrobne združbe nitrifikatorjev 47 Vaja 2: Vpliv ph na nitrifikacijo 49 Vaja 3: Vpliv aeriranja na nitrifikacijo 49 Vaja 4: Vpliv dodajanja obogatene kulture nitrifikatorjev na proces nitrifikacije v tleh Disimilativna redukcija nitrata in denitrifikacija 53 Vaja 1: Velikost mikrobne združbe anaerobnih bakterij in denitrifikatorjev 53 Vaja 2: Vpliv aeriranja in organske snovi pri denitrifikaciji 55 Vaja 3: Ugotavljanje kapacitete vzorca za denitrifikacijo z merjenjem N 2 O 56

7 V. IZBRANA POGLAVJA V MIKROBNI EKOLOGIJI Pomnoževanje okoljskih vzorcev DNA z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) 58 Vaja 1:Raztapljanje in priprava začetnih oligonukleotidov 58 Vaja 2:Temperatura taljenja začetnih oligonukleotidov 59 Vaja 3: Izračun sestave PCR 60 Vaja 4: Ločevanje DNA na agaroznih gelih Adsorpcija mikroorganizmov na trdno podlago 62 Vaja 1: Adsorpcija mikrobov na minerale glin 63 Vaja 2: Opazovanje adsorpcije mikroorganizmov na steklo Matematični modeli v mikrobni ekologiji 64 Matematični opis homogenih sistemov 64 Matematični opis heterogenih sistemov 65 Matematični opis mikrobne rastne kinetike 65 Najbolj pogosti matematični modeli v mikrobni ekologiji 66 Matematična analiza modelov 66 Vaja 1: Primer simuliranja eksperimentalnih podatkov z ustreznim matematičnim modelom v programu Microsof Excel 67 Dodatek: Mc Crady-jeva tabela 70 Literatura 71

8 I. UVOD 1. PREGLED POJMOV Ekologija osnovna terminologija oikos hiša, prostor za življenje logos- študij Ekologija odgovarja na vprašanje kako deluje narava. Ekologija je veda, ki preučuje interakcije med organizmi in okoljem v katerme živijo. Interakcije opišemo s silami. Nepisana pravila v ekologiji: - ničesar ne moreš vreči stran brez posledice za okolje - vse je povezano z vsem - v naravi ni zastonj kosila - narava zna najbolje kako in kaj Kaj različni ljudje pojmujejo pod ekologijo (nekateri zadetki na internetu): - microbial ecology - animal ecology - plant ecology - landscape ecology - conservation ecology - socio-ecology - deep ecology - ecofeminism - Cheesmans ecology safari in anctarctica - urban ecology - body ecology attunement - cultural ecology - behavioural ecology ecology porsche parts - restoration ecology - molecular ecology - chemical ecology - dental ecology 1

9 Komponente ekosistema: abiotske in biotske Najvažnejši fizikalni abiotski faktorji: - temperatura - elektromagnetno valovanje - pritisk - struktura in tekstura okolja - difuzija - tokovi (vodni sistemi) Najpomembnejši kemijski abiotski faktorji: - dostopnost vode - dostopnost hranil - redoks potencial - ph - prisotnost toksičnih spojin Najpomembnejši biotski faktorji v ekosistemu: - kompeticija - predatorstvo - parazitizem - mutualizem - komenzalizem - amenzalizem - nevtralizem Znotraj biotske komponente ločujemo: - primarne producente (autotrofi) - sekundarne producente (heterotrofi) - terciarne producente (heterotrofi) - kvartarne producente (heterotrofi) V izbranem ekosistemu najdemo: - avtohtone vrste - alohtone vrste 2

10 Kroženje energije in snovi Ločimo: - geološko kroženje (npr. hidrološki cikel, kroženje CO 2 ) - biogeokemijska kroženja C, N, S, P in ostalih biogenih elementov Rezervoarji. Za razumevanje krožanje je zelo koristen koncepet velikost rezervoraja in pretok snovi in energije med različnimi rezervoarji. Rezervoar pri kroženju elementov lahko predstavljajo različne kemijske oblike elementa. Globalne rezervoarji za izbrano hranilo so običajno v stacionarnem stanju. Lokalno lahko v posameznih habitatih prihaja do neravnotežja (npr. kopičenje ali odstranjevanje snovi). Pomembna je velikost rezervoarja. Pri majhnih rezervoarjih se zelo hitro pozna vsaka motnja in s tem porušenje ravnotežja. Biogeokemijski procesi pomembni pri kroženju snovi: 1. Mineralizacija Mineralizacija je proces, ki prevede organsko obliko katerega koli elementa v mineralno obliko. Večinsko poteka zaradi delovanja mikroorganizmov. 2. Imobilizacija Imobilizacija je eden od procesov, ki deluje v nasprotni smeri mineralizacije. Slednja je proces, pri katerem prihaja do vnosa anorganske oblike hranila v celico, čemur lahko sledi prevezava v organsko obliko. Procesa mineralizacije in imobilizacije največkrat ne moremo ločiti, saj potekata sočasno. Delež neto mineralizirane snovi je odvisen od količine snovi, ki jo mikrob imobilizira. V kolikor je v mineralizirani snovi ravno dovolj snovi za prehranske potrebe udeleženega mikroba ne pride do neto mineralizacije. 3. Oksidacije in redukcije Pri večini kemijskih reakcij, ki potekajo v okolju gre za transport elektronov. V procesih kroženja, kjer so udeleženi mikroorganizmi gre predvsem za redoks reakcije. V tem primeru kroženje elementa definiramo kot spremembo redoks stanja spojine iz reducirane v oksidirano in ponovno v reducirano obliko. Za samo delovanje organizma pa je dodatno pomembno vzdrževanje ustreznega redoks stanja v celici. Npr. razmerje NAD + : NADH ~ 1000 : 1 vzdrževanje oksidacijske moči v celici, oziroma NADP + : NADPH ~ 1 : 100 vzdrževanje redukcijske moči v celici 4. Biološka fiksacija spojin Biološka fiksacija spojin je proces, pri katerem mikroorganizmi vgradijo atmosferske pline v svojo biomaso.poznanih je več načinov fiksacij: fiksacija kisika, dušika, CO 2 in vodika. 5. Volatilizacija Volatilizacija ali uplinjanje je proces, ki je nasproten fiksaciji spojine. Zaradi metabolizma mikroorganizmov se tvori veliko različnih plinov npr. CO 2, CH 4, N 2, N 2 O, H 2 S, NH 3, H 2, O 2. V nekaterih primerih mikrobno producirani plini determinirajo lokalno atmosfero. Zaradi delovanja mikroorganizmov pride v atmosfero veliko toplogrednih plinov (N 2 O, CH 4 ). Po drugi strani pa 3

11 zaradi delovanja mikroorganizmov v atmosfero pridejo tudi plini, ki zmanjšujejo učinek tople grede npr. DMS. 6. Formiranje depozitov Geološki depoziti nastajajo zaradi oksidacij, redukcij, abiotskih reakcij mikrobnih produktov ali akumulacije celičnih ostankov (npr. žveplovi depoziti, nafta, premog). 7. Produkcija organskih kelatov, biodostopnost Tvorba organskih kislin, nitratne kisline, žveplove kisline, ogljikove kisline iz sproščenega CO 2, lahko dramatično poveča dostopnost nekaterih elementov (npr. fosforja), pretvorba netopnega feri železa v fero železo, ali Mn 4 + do Mn 2 +. Seveda pa lahko zaradi delovanja mikroorganizmov pride do zmanjšane dostopnosti za določene elemente (npr. nastanek amonija dvigne ph, kar omogoča spontano precipitacijo železa in Mn). 8. Izotopna frakcionacija V naravi obstaja običajno več izotopov. Če mikroorganizem preferenčno uporablja en izotop potem bo izotopna sestava v biološkem materialu drugačna od izotopne sestave v naravnem materialu. To dejstvo lahko izkoriščamo za določanje izvora materiala (npr. organski vs. anorganski). Prehranjevalni spleti Mikroroganizmi skupaj s makroorganizmi skrbijo za pretok snovi skozi ekosistem. Običajno pretok snovi skozi ekosistem ni linearen, ne poteka v obliki pregranjevalnih verig. Osnovo prehranjevalnega spleta v vsakem ekosistemu predstavljajo mikroorganizmi. Velik del primarno sintetizirane snovi gre skozi mikrobno prehranjevalno zanko (~ 50 %). Mikrobna prehranjevalna zanka Mikrobna prehranjevalna zanka predstavlja skupek vseh mikrobnih procesov v nekem okolju. Organska snov, ki je asimilirana v mikrobni celici je lahko plen bakteriovorov in tako preide v višje trofične nivoje. V kolikor mikrobna celica propade je remineralizirana in tako energija ostaja v mikrobni prehranjevalni zanki. Remineralizacija je omejena z učinkovitostjo izrabe organskega materiala. Noben organski material ne more biti 100 % izkoriščen. Zaradi tega del energije kot toplota zapušča ekosistem in je potrebno mikrobno zanko stalno napajati z novim organskim materialom. Večina tega materiala pride iz primarnih producentov (partikulatni in raztopljeni material), del pa z razgradnjo sekundarnih producentov in njihovih ekskrementov. Neto efekt mikrobne zanke je poraba organskega materiala in recikliranje nutrientov. Zaradi recikliranja mikrobna zanka omogoča učinkovito izrabo energije v ekosistemu. Mikrobna zanka je preko protozojev sklopljena z višjimi trofičnimi nivoji. V kolikor se poveča remineralizacija mikrobnih celic (npr. virusi) lahko prihaja do razklopa mikrobne zanke z višjimi trofičnimi nivoji, kar se pozna pri delovanju celotnega ekosistema. 4

12 2. MERITVE V MIKROBNI EKOLOGIJI Metrologija je veda, ki se ukvarja s kvaliteto meritev. Meritve v mikrobni ekologiji, še zlasti tiste o ogroženosti antropogenega okolja, igrajo pomembno vlogo v hitro razvijajoči se družbi in so osnova za številne pomembne družbene odločitve. Na podlagi teh odločitev se sestavlja nacionalna in mednarodna zakonodaja, ki posledično vpliva na trgovino, pravo, medicino in okolje. Zaradi tega je potrebno zagotoviti takšno tehnologijo raziskovanja v mikrobni ekologiji, ki omogoča visko kvaliteto dobljenih rezultatov. Glavni problemi pri meritvah bioloških vzorcev so: ocena napake meritve, ponovljivost meritve in stabilnost vzorca. Ocena napake meritve je pri bioloških vzorcih vsaj tako pomembna kot izmerjena vrednost, saj je poznano, da so biološki vzorci zelo variabilni. Oceno napake meritev največkrat podajamo s: standardno deviacijo, standardno deviacijo sredine, intervalom zaupanja, χ 2 statistiko (ujemanje meritve s teoretičnim modelom). Obnovi znanje o oceni eksperimentalnih napak iz statistike. Opozorilo! Zelo priporočljivo je na vse opombe z znakom odgovoriti. Neodgovarjanje se po izkušnjah pozna pri oceni za kolokvij. Drugi problem, ki se pojavlja pri meritvah bioloških sistemov je stabilnost vzorca. Za razliko od ocene za napako meritve, ki jo lahko izračunamo, moramo stabilnost vzorca dokazati (rezultata izmerjena v času t o in in času t n se morata poljubno malo razlikovati). Zaradi tega je potrebno voditi dobro urejen dnevnik raziskav, kjer je vsaka sprememba na vzorcu zabeležena. Zahteva po stabilnem vzorcu nedvomno predstavlja glavni problem meritev v bioloških sistemih, saj se vzorec največkrat spreminja že v času meritev. Poleg tega pri meritvah v mikrobni ekologiji ni pomembno samo kako in kaj merimo ampak tudi kje in kdaj merimo (v naravi, laboratoriju, znotraj celice, v raztopini, v začetku replikacijskega cikla, na koncu replikacijskega cikla). Tretji problem pri meritvah v bioloških sistemih je ponovljivost meritev. Pogoji, ki se lahko spreminjajo in vplivajo na ponovljivost meritev so: metoda in princip meritve, izvajalec meritve, merilni instrument, referenčni standardi, lokacija, razvojni stadij biološkega materiala, staranje biološkega materiala, nebiološke spremembe na vzorcih. V mikrobni ekologiji se srečujemo s fizikalnimi, kemijskimi, biološkimi in mikrobiološkimi meritvami. Skupno vsem merilnim tehnikam je to, da prihaja pri meritvah do napak. Napake meritev lahko razdelimo v dve skupini: naključne in sistematične napake. V skupino naključnih napak sodijo napake, kjer so vrednosti bolj ali manj simetrično razporejene okrog povprečja. Pri sistematičnih napakah pa gre za sistematičen odmik od merilne vrednosti. Sistematične napake meritev so v glavnem posledica: - instrumentalnih in tehničnih faktorjev (merilne naprave, analitične metode, vzorčenje) - človeških faktorjev (izobrazba, praktične izkušnje, malomarnost, nepazljivost) - okoljskih faktorjev (temperatura, pritisk, vlažnost, kontaminacija) Razmisli, kje uporabljamo statistiko (pri naključnih ali pri sistematičnih napakah meritev). 5

13 Napake zaradi merilnih naprav: Napake zaradi merilnih instrumentov lahko odpravimo tako, da izboljšamo analitično opremo ali pa uporabljamo alternativne bolj natančne analitične metode. Merilna oprema zahteva vzdrževanje in umerjanje. Umerjanje merilne naprave pomeni zagotavljanje optimalnih pogojev za merjenje. Pri umerjanju so upoštevani postopki za čimbolj optimalno nastavitev aparata. Npr. uporaba standarda za 1 kg pri umerjanju tehtnice. Pri standardizaciji merilne naprave uporabljamo ustrezne standarde za izbrano meritev (interni, zunanji standardi) in izberemo ustreznen matematičen opis umeritvene krivulje. Ali znaš opisati postopek za interno standardizacijo? Napake zaradi neprimerne rabe analitične metode: Izbira ustrezne analitične metode je ena izmed najpomembnejših odločitev v vsakem laboratoriju. Analitično metodo je potrebno ovrednotiti - validirati. Proces validacije vključuje več postopkov. Pri validaciji je potrebno pregledati ali je izbrana analitična metoda poleg detekcije čistih vzorcev ustrezna tudi za detekcijo naravnih vzorcev. Preveriti je potrebno: meje za občutljivost in območje v katerem lahko opravljamo meritve; selektivnost izbrane analitične metode in robustnost analitične metode. Eksperimentalno je potrebno dokazati, da se rezultati meritev časovno invariantni (nespremenljivi). Potrebno je dokazati kvantitativno odkrivljivost referenčnih standardov. Rezultate je potrebno primerjati z neodvisno validirano metodo ter jih primerjati z rezultati, ki so dobljeni neodvisno v drugem laboratoriju. Napake pri vzorčenju: Informacija o številu in vrstni sestavi mikroorganizmov v mikrobni združbi je osnova za razumevanje strukturnih sprememb in posledično funkcioniranja ekosistema. Žal je z obstoječo tehnologijo raziskovanja naravni sistem v veliki večini primerov preveč kompleksen za in situ raziskave. Zaradi tega za proučevanje sestave mikrobne združbe in njene aktivnosti v naravnih okoljih največkrat uporabljamo čim bolj reprezentativne vzorce. Reprezentativni vzorec pomeni takšen vzorec, ki pokaže gostoto mikroorganizmov in njihovo različnost v vzorčenem okolju. Ker pa je razporeditev mikroorganizmov v naravnih okoljih največkrat nehomogena to zelo omeji interpretacijo dobljenih rezultatov (rezultati veljajo samo za izbrani vzorec). Vzorčenje predstavlja prvo imed štirih stopenj v raziskovalnem procesu: vzorčenje, obdelava vzorca, analiza vzorca, interpretacija rezultatov. Razmisli, ali je naslednja trditev smiselna. Vzorčenje je običajno ena izmed bolj zanemarjenih faz v raziskovalnem procesu. Glede na čas, ki ga vložimo v obdelavo vzorca, analizo vzorca in interpretacijo dobljenih rezultatov je investicija v slabo izbran vzorec zelo draga! V splošnem ni dobrih pravil glede števila, frekvence in velikosti vzorcev. Zlasti pri obsežnejših in dolgotrajnih raziskavah se velikokrat zgodi, da vzorci niso vedno odvzeti na enak način (isto število, frekvenca in velikost). Zaradi tega je zelo pomembno da vodimo dober dnevnik vzorčenja v katerega vpisujemo podrobne podatke o pogojih, opremi in postopkih pri vzorčenju. Zelo 6

14 smiselno je, da pri tako zahtevnem opravilu kot je vzorčenje izdelamo jasne in dobro dokumentirane protokole, kar zmanjšuje možnost za improviziranje. Izbira vzorčnih mest in način vzorčenja je v prvi vrsti odvisna od hipoteze, ki jo poizkušamo dokazati. V tej fazi raziskovanja je primerno posvetovanje s statistikom glede načina in frekvence vzorčenja. Za izbrano vzorčno mesto, velikost vzorca in frekvenco vzorčenja je potrebno podati razloge, ki so statistične ali raziskovalne narave. Potrebno je določiti vpliv vzorčnega mesta na dobljene podatke (npr. vpliv nadmorske višine, salinitete, ph, virov kontaminacije). V nekaterih primerih je potrebno opraviti določene meritve na mestu vzorčenja (npr. meritve ph in temperature). Ker so mikroorganizmi dobro prilagojeni na posebnosti v okolju prihaja do številnih tehničnih težave pri vzorčenju in transportu v laboratorij. Npr. obligatni barofilni mikroorganizmi ne prenesejo atmosferskega pritiska. Če hočemo proučevati takšne mikroorganizme je potrebno med vzorčenjem, transportom, shranjevanjem in obdelavo vzorcev ohranjati visok pritisk. V kolikor tega ne izvajamo, so dobljeni rezultati neuporabni, ne glede na količino vloženega dela. Na podobne težave naletimo pri študiju striktnih anaerobov, psihrofilov, acidofilov in ekstremnih termofilov. Razmisli kakšne tehnične postopke bi uporabil pri vzorčenju, študiju in shranjevanju omenjenih skupin mikroorganizmov. Splošna pravila pri vzorčenju mikrobioloških vzorcev: - pred vzorčenjem je potrebno dobro organizirati način zbiranja, transportiranja, shranjevanja in označevanja vzorcev - potrebno je redno umerjanje in validiranje merilnih naprav, ki jih uporabljamo na terenu (ph meter, termometer, oksimeter) - vzorce hranimo v čistih in sterilnih posodah - med vzorčenjem in transportom preprečujemo mikrobiološke spremembe in kontaminacijo na vzorcih (npr., uporaba azida ali formalina) Razmisli, kako bi izmeril mikrobno aktivnost izbrane vrste mikroorganizmov v naravnih sistemih. Primeri izračunavanja eksperimentalnih napak 1. V standardnem vzorcu z 20 ppm amonijskega dušika smo z avtoanalizatorjem izmerili naslednje vrednosti za amonijski ion (ppm): 19.4, 19.5, 19.6, 19.8, 20.1 in Izračunaj srednjo vrednost za meritev, mediano, standardno deviacijo, varianco, razpršenost meritve, povprečni odklon od sredine, relativno standardno deviacijo, koeficient variacije, absolutno napako in relativno napako meritve. 7

15 Tabela 1: Vrednosti za amonij, odmik eksperimentalnih vrednosti od srednje vrednosti in kvadrati odmika od sredine. NH + 4 (ppm) odmik od sredine x i - x kvadrat razlike (x i - x ) xi = x i - x = 1.70 (x i - x ) 2 = Sredina = x = 118.7/6 = ppm NH Mediana = 2 = 19.7 ppm NH 4 + ( xi x) Standardna deviacija = s = N = = ppm NH 4 ( xi x) Varianca = s 2 = N = = ppm NH 4 Razpršenost meritev = w = = 0.9 ppm NH 4 + Povprečen odklon od sredine = xi x N 1.70 = 6 = ppm NH 4 + s Relativna standardna deviacija = x x 1000 = x 1000 = ppm NH 4 + s Koeficient variacije = CV = x x 100% = x 100% = 1.8 % Absolutna napaka = = ppm NH Relativna napaka = x 100% = -1.1% 2. Primerjali smo podatke o koncentraciji amonijskega dušika (µg/g zračno suhih tal) za dve časovni točki v inkubaciji. Ali naslednji podatki potrjujejo domnevo, da je koncentracija 8

16 amonijskega dušika v omenjenem časovnem intervalu različna? koncentracija amonija v času t 1 : 4.0, 4.6 koncentracija amonija v času t 2 : 4.5, 5.3, 5.5, 5.0, x 1= 2 x 10 8 = x 2= 5 x 10 8 = 5.0 x 1 x 2 = -0.7 ( x x + x s = N 1 + N j) ( ) i i 2 2 x 2 x1 x 2=± t s N1+ N 2 N1N2 kjer je t statistična vrednost parametra za izbrani nivo zaupanja, s je standardna deviacija in N 1,2 je število meritev v času t 1 in t 2. Tabela 2: Vrednosti statističnega parametra t pri različnih stopnjah zaupanja. stopnje prostosti nivo zaupanja 90 % 95% 99 %

17 2+ 5 Pri 90 % zaupanju velja x 2 - x 1 = ±2.02 x 0.39 x 2x pri 95 % zaupanju velja x 2 - x 1 = ± 2.57 x 0.39 x 2x pri 99 % zaupanju velja x 2 - x 1 = ± 4.03 x 0.39 x 2x5 = ±0.66 = ± 0.84 = ± 1.32 Glede na to, da je eksperimentalna razlika sredine med vzorčenjem v času t 1 in času t 2 enaka 0.7, lahko s 90 % verjetnostjo trdimo da je število v času t 2 različno od števila v času t 1, medtem ko tega ne moremo trditi s 95 in 99 % verjetnostjo. Ker je tudi pri 90 % intervalu zaupanja razlika med 0.7 in 0.66 zelo majhna je zelo verjetno, da se povprečji za vzorčenji v času t 1 in t 2 statistično ne razlikujeta. Alternativno lahko izračunamo vrednost za t statistiko iz zgornjih formul in jo primerjamo s t vrednostjo iz tabele. V kolikor je t izračunani manjši od tabelaričnega med vzorcema ni statističnih razlik. Če je izračunani t večji od vrednosti t v tabeli pa obstajajo statistično signifikantne razlike med srednjima vrednostima vzorca. Ko podajamo analitske podatke je potrebno poudariti, da je numerični rezultat zelo malo vreden, če ne podamo tudi podatka o napaki meritve oziroma o točnosti dobljenega podatka. Obstajajo trije načini kako podajamo podatke: 1. podamo srednjo vrednost ± mejo zaupnja (npr. pri 95 ali 99 % intervalu zaupanja) 2. podamo srednjo vrednost ± standardno deviacijo 3. podamo srednjo vrednost ± koeficient variacije 4. podamo srednjo vrednost z ustreznim številom signifikantnih števil Najbolj zaželjeni sta prvi dve metodi prikazovanja podatkov. V kolikor prikazujemo podatke za standardno deviacijo ali s koeficientom variacije je potrebno podati tudi število podatkov na osnovi katerih je bila standardna deviacija dobljena. 10

18 3. PLINSKA KROMATOGRAFIJA Plinska kromatografija je ena izmed najbolj pomembnih tehnik v mikrobni ekologiji in jo bomo na vajah večkrat uporabljali. Kromatografija je analitska tehnika, kjer se komponente iz vzorca ločujejo na osnovi prerazporejanja vzorca med dve fazi, ki se ne mešata. Ena od faz je stacionarna (tekoča ali trdna), medtem ko je druga mobilna (plinasta ali tekoča). Plinska kromatografija je v mikrobni ekologiji zelo uporabna tehnika, saj omogoča ločevanje, identifikacijo in kvantifikacijo snovi, ki so hlapne ali jih lahko uplinimo pri temperaturah do 450 o C. Ločevanje komponent iz vzorca temelji na razlikah v njihovi hitrosti adsorbcije oziroma porazdelitvi komponent med mobilno in stacionarno fazo. Hitrost potovanja po koloni je odvisna od časa, ki ga molekula prebije v mobilni fazi. Na osnovi fizikalnega stanja mobilne in stacionarne faze v kromatografskih kolonah je možnih devet različnih kombinacij. Katere od teh kombinacij lahko z današnjo tehnologijo uporabimo v kromatografiji? Aparatura Na voljo so številni različni plinski kromatografi, vsi pa so grajeni iz naslednjih ključnih komponent: injektor, kolona, peč za vzdrževanje in programiranje temperature kolone, detektor, oprema za procesiranje signala (rekorder, integrator, PC) ter nosilni plin. Aparaturi lahko dodamo zbiralno posodo za plin, ki je vgrajena v kopel iz suhega ledu in acetona. Plin se v tej kopeli kondenzira, kar omogoča analizo s pomočjo infra rdeče spektroskopije, ali pa masne spektrometrije. Nosilni plin Uporabljamo tiste pline, ki se ne vežejo na stacionarno fazo. Pogosto rabimo: He, H 2, N 2, Ar in tudi mešanice (Ar-CH 4 ). Izbira plina je odvisna od vrste vzorca in detektorja. Pretok plina je običajno v mejah od 10 do 400 ml/min, odvisen pa je od uporabljene kolone, vrste vzorca, željene ločljivosti. Kolone Ločimo polnjene in kapilarne kolone. Polnjene kolone so običajno spiralno zvite cevi iz bakra, jekla ali stekla napolnjene s stacionarno fazo ali inertnim nosilcem, ki je prevlečen s tekočo stacionarno fazo. Najpogosteje so v rabi polnjene kolone dožine od 0,5 m do 5 m, premera 1/8 inče. Za preparativne namene uporabimo kolone z večjim premerom. Kapilarne kolone ne vsebujejo polnila, stacionarna faza je nanešena na notranjo steno kapilare. Premer kapilare je 0,2 do 0,4 mm, dolžina pa od 10 do 100 m. Prednost teh kolon je izredno velika ločljivost in kratek čas analize. Pomankljivost kapilarnih kolon pa je analiza majhnih količin vzorca. Tržišče ponuja širok izbor nosilcev, stacionarnih in tekočih faz kot tudi že pripravljenih polnjenih in kapilarnih kolon. Pogosto rabljeni trdni nosilci so: kromosorbi (diatomejska zemlja), porapaki (polimeri stirena z divinilbenzenom) in molekularna sita (sintetični polimeri). Izbiramo lahko med različnimi velikostmi delcev (npr. od 60 do 120 mesh (št. lukenj / inčo 2 (1 cm = 0,3937 inče))). Pogosto uporabljene tekoče faze so: etilenglikol in derivati skvalena ter silikonov. Kolone lahko napolnimo tudi sami. Pri tem postopku izrabljeni material odstranimo. Kolono operemo z etilnim alkoholom in po potrebi kolono silaniziramo. Kolono napolnimo z novim materialom, 11

19 tako da material nanašamo v kolono ob rahlem tresenju kolone. Na ta način omogočimo enakomerno pakiranje stacionarne faze. Učinkovitost kromatografske kolone je določena s številom teoretskih podov 2 2 α 1 + k N = 16R α 1 k 2 kjer je N število teoretskih podov kolone, R je ločljivost, α je selektivnostni faktor, k je faktor zmogljivosti kolone. Večje število teoretskih podov pomeni bolj učinkovito delovanje kolone. V kromatografiji se vedno odločamo med čim krajšim časom elucije in čim večjo ločljivostjo. Elucijski čas t R pri katerem dobimo željeno ločljivost R je podan s R tr= 2 H α (1+ k) u α 1 k kjer je H višina teoretskega poda, u pa je linearna hitrost mobilne faze. Iz formule je razvidno, da povečevanje pretoka nosilnega plina skozi kolono pri ostalih nespremenjenih pogojih skrajšuje retencijski čas. Tabela 3: Pomembnejše formule pri kromatografiji. t M je čas potovanja nezadržanih spojin, (t R ) A in (t R ) B sta retencijska časa spojine A in B, W A in W B je širina vrha spojine A in spojine B, L je dolžina kolone, F je hitrost pretoka nosilne faze, V S je volumen stacionarne faze, C M in C S sta koncentraciji spojine v mobilni in stacionarni fazi, R je ločljivost vrhov, N je število teoretskih podov, H je višina teoretskega poda. linearna hitrost mobilne faze volumen mobilne faze zmogljivostni faktor kolone porazdelitveni koeficient selektivnostni faktor kolone ločljivost definicija L u= tm V M = t M F tr tm k = tm kvm K = VS ( tr) B tm α = ( tr ) A tm 2( tr) B ( tr) R= WA+ WB število teoretskih podov 2 tr N = W Višina teoretskega poda H = L/N retencijski čas 2 16R H α tr= u α 1 A 2 (1+ k) 2 k 3 alternativni zapis KV k = VM CS K = CM A S k B α = = R= k K K B A N α 1 k 4 α 1+ k 2 2 α 1 + k N = 16R α 1 k 2 12

20 Detektorji Detektor zazna spremembe v sestavi iztekajočega plina, ne identificira pa komponent. V uporabi so: plamensko ionizacijski detektor (FID), detektor za termalno prevodnost (TCD) in electron capture detektor (ECD). Pri FID detektorju vzorec vodimo iz kolone v plamen, ki ga vzdržujemo s kontroliranim izgorevanjem vodika v zraku. V tem plamenu snovi iz vzorca zgorijo, pri čemer nastajajo ionske oblike spojine, ki se zbirajo na kolektorski elektrodi. Signal, ki ga daje tok ionov ojačamo in vodimo do rekorderja. FID se odziva na praktično vse organske snovi. Meja detekcije ogljikovodikov je v območju ng. TCD detektor meri toplotno prevodnost plinov. Iz kolone teče vzorec preko električnih elementov - uporov v obliki filamentov ali termistorjev, ki so termostatirani in napajani s šibkim tokom. Komponente iz vzorca povzročijo spremembo toplotne prevodnosti nosilnega plina, kar spremeni temperaturo filamentov in s tem spremembo njihove upornosti. Ker je absolutno merjenje toplotne prevodnosti težavno, je problem merjenja rešen z diferencialno metodo. Pari filamentov so povezani v Wheatstonov most. En krak mostu je stalno v stiku z nosilnim plinom - referenčni kanal, drugi krak mostu pa je v stiku znosilnim plinom in komponentami vzorca. Sprememba sestave plina, ki izstopa iz kolone (prisotnost komponent iz vzorca) poruši uporovno ravnotežje Wheatstonovega mostu, kar zaznamo kot spremembo napetosti. Načeloma je TCD uporaben za analizo vseh snovi, ki imajo toplotno prevodnost različno od nosilnega plina. TCD detektor je manj občutljiv kot FID. Uporablja se za analizo H 2, N 2, CO 2, O 2, N 2 O in H 2 S. ECD detektor zaznava spremembe stalnega toka elektronov med elektrodama, ki ga vzdržuje vir β-sevanja (npr. 63 Ni), ki je nameščen v ionizacijski komori. β + N 2 N e - Komponente iz vzorca vežejo elektrone in tvorijo stabilne ione in nekateri ioni lahko dalje reagirajo z nabitim nosilnim plinom. Komponenta (X) + e - X - X - + N 2 + nenabiti produkti Te reakcije povzročijo spremembo stalnega toka elektronov, kar detektiramo kot spremembo signala. Danes so dosegljivi tudi nekateri ECD detektorji, ki ne vsebujejo radionuklidov. Mnoge za mikrobiologa pomembne substance ne vežejo elektronov in jih tako ni mogoče zaznati z ECD (ogljikovodiki, alkoholi, aldehidi), visoko afiniteto do elektronov pa imajo organske snovi, ki vsebujejo halogene elemente ali kisik. 13

21 Meritev CO 2 in N 2 O Meritev količine proizvedenega CO 2 na vzorcih iz vaje 1 bomo opravili na plinskem kromatografu Hewlett Packard 5890A. Aparat pripravimo za delo, kot je opisano v kratkih navodilih za uporabo kromatografa, ki jih najdeš ob kromatografu. Ko je plinski kromatograf stabiliziran ga umerimo s pomočjo zunanjega standarda z znano koncentracijo CO 2. Plin vzorči kot je opisano v navodilih, ki so priložena kromatografu. Nastavitev kromatografa: - Porapak QS kolona 180 cm, - temperatura kolone 50 C, - temperatura injektorja in detektorja 100 C, - nosilni plin He, - pretok nosilnega plina 20ml/min, - TCD detektor - integrator Hewlett Packard 3392A Iz meritev CO 2 v plinski fazi izračunamo celotno količino nastalega CO 2 v posodi z upoštevanjem raztopljenega CO 2 v tekoči fazi: M = C g (V g + V l α) M - celotna količina CO 2 v posodi (ml) C g - izmerjena koncentracija CO 2 v plinski fazi (npr: 2% kot 2/100 ali 5 ppm kot 5/ ) V g - volumen plinske faze (ml) V l - volumen tekoče faze (ml) α - Bunsenov koeficient topnosti plinov v vodi predstavlja volumen (ml) plina pri 0 C in 760 mm Hg, ki ga adsorbira 1 ml vode. Vaja 1: Topnost plinov v vodi Grafično prikaži temperaturno odvisnost topnosti plinov in razmisli, kakšen vpliv ima to na mikrobne procese in procese, ki potekajo znotraj višjih organizmov. Tabela 4: Bunsenovi koeficienti (α) za pline C H 2 NO N 2 O N 2 O 2 CH 4 CO 2 C 2 H 4 0 0, ,0238 0,0491 0,0573 1, ,0206 0,0646 1,06 0,0211 0,043 0,0495 1, ,0196 0,0575 0,882 0,0189 0,0382 0,0433 1,194 0, ,0188 0,0517 0,743 0,0172 0,0343 0,0384 1,015 0, ,0181 0,047 0,632 0,0157 0,0311 0,0342 0,873 0, ,0175 0,0431 0,544 0,0146 0,0285 0,031 0,758 0, ,017 0,0399 0,472 0,0136 0,0263 0,0285 0,666 0, ,0167 0,0372 0,414 0,0128 0,0245 0,0262 0,59 0,

22 II. OGLJIK 1. KOMPLETNOST OKOLJA IN RAZGRADNJA ORGANSKEGA MATERIALA Vaja 1: Eksperimentalni model za proučevanje razgradnje celuloze Heterotrofni mikrobi z razgradnjo organskih monomerov in polimerov pridobivajo potrebno energijo za rast in izgradnjo osnovnih celičnih gradbenih elementov, ostala hranila pa lahko vstopajo v biosintetske poti v obliki vodotopnih anorganskih snovi. Od vrste energetskega metabolizma (fermentacija, dihanje) je odvisno prerazporejanje ogljika iz razgrajevane snovi v novo sintetizirano biomaso in ostale končne produkte. Tabela 5: Delež ogljika iz organskega materiala, ki je prerazporejen v novonastalo mikrobno biomaso (MB-C), CO 2 (CO 2 -C) in ogljik vgrajen v topne organske produkte, ki zapuščajo mikrobno celico, pri različnih vrstah energetskega metabolizma. Prerazporejanje ogljika (%) Energetska pot Končni prevzemnik MB-C CO 2 -C topni organski elektronov produkti Dihanje s kisikom O / Nitratno dihanje - NO / Sulfatno dihanje 2- SO / Metanogeneza CO / Fermentacija / Suha masa živih celic je sestavljena iz elementov v naslednjih povprečnih vrednostih: vodik (60.1 %), kisik (25.1 %), ogljik (10.0 %), dušik (2.3 %), kalcij (2.2 %), fosfor (0.1 %), žveplo (0.1 %), klor (0.03 %), kalij (0.04 %), natrij (0.07 %), magnezij (0.01 %), silicij ( %), železo (18 µm), baker (16 µm), cink (15 µm), selen (1.6 µm), jod (40 nm), nikelj (20 nm), molibden (7 nm), krom (4 nm), mangan (1 nm) in kobalt (0.1 nm). Povprečne statistične vrednosti glavnih hranil v bakterijski celici so v razmerju: C : N : P : S = 100 : 20 : 1,2 : 1 Razgradnja mikrobom dostopne organske snovi, ki je vezana na rast celic je možna samo v primeru, ko so vsi potrebni elementi v prisotni v okolju v biološko dostopnih oblikah. Znižana koncentracija nujno potrebnega elementa omejuje rast in razgradnjo organskega substrata (omejujoč dejavnik). Odsotnost elementa onemogoči rast in razgradnjo organskega substrata. Razmisli, kako je rast mikroorganizma korelirana z omejujočim dejavnikom in kako z neomejujočim dejavnikom okolja. 15

23 Vlogo različnih dejavnikov okolja pri razgradnji organske snovi bomo testirali v poenostavljenih laboratorijskih modelnih sistemih. Modelna snov bo celulozni material v obliki filter papirja. Ta material je naravnega izvora, vendar dodatno čiščen, tako da razen ogljika ne vsebuje drugih biogenih elementov. Testni material bomo inkubirali v prisotnosti in odsotnosti hranil ter v prisotnosti oz. odsotnosti kompleksne mikrobne združbe. Vzorci bodo inkubirani več tednov aerobno, pri 28 o C, v temi. Meritve produkcije CO 2 med inkubacijo in izguba teže bodo pokazatelji razgradnje testnega materiala. Izvedba in variante Znano količino zračno suhega filter papirja (10 cm x 10 cm, ~1 g suhe snovi) inkubiramo v 500 ml serumskih steklenicah, tako da je papir delno potopljen v vodi oz. različno popolni raztopini nutrientov. Vsako varianto izvedemo v treh ponovitvah. Variante: A: celuloza + 50 ml deionizirane vode + 1 ml inokuluma B: celuloza + 45 ml vode + 5 ml raztopine soli (Winogradsky) + 1 ml inokuluma C: celuloza + 40 ml vode + 5 ml raztopine soli + 5 ml raztopine (NH 4 ) 2 SO ml inokuluma D: celuloza + 35 ml vode + 5 ml raztopine soli + 5 ml raztopine (NH 4 ) 2 SO ml raztopine glukoze + 1 ml inokuluma E: enako gojišče kot D vendar brez dodane celuloze F: enako gojišče kot C, vendar z 1 ml celulolitične kulture (Cellulomonas uda DSM 20108) G: enako gojišče kot C, ki ga avtoklaviramo H : enako gojišče kot C, zamenjana atmosfera z N 2 I: celuloza + sveža zemlja + inkubacija v laboratorijskih razmerah J: celuloza + inkubacija in-situ - zakoplješ jo v zemljo približno 5-10 cm pod površje (pripravi natančen načrt mesta zakopa celuloze, da jo boš po inkubaciji našel). inokulum: suspenzija tal (10g tal v 90 ml 0,9 % raztopine NaCl, stresaj 1 uro, za inokulum uporabi supernatant). raztopina (NH 4 ) 2 SO 4 : 9,43 mg (NH 4 ) 2 SO 4 /ml raztopina glukoze: 10 mg glukoze/ml Osnovna raztopina soli po Winogradskem K 2 HPO 4 5,0 g MgSO 4 7H 2 O 5,0 g NaCl 2,5 g Fe 2 SO 4 7H 2 O 50,0 mg MnSO 4 4H 2 O 50,0 mg deionizirana voda 1000,0 ml 16

24 Serumske steklenice zapri z gumijastimi zamaški in inkubiraj v temi pri 28 o C. Da zagotoviš aerobne razmere med inkubacijo tedensko izmenjaj plinsko fazo, po predhodni meritvi CO 2 s plinsko kromatografijo. Odčitavanje rezultatov: Po nekaj tedenski inkubaciji ugotovi skupno količino nastalega CO 2 v posamezni varianti. Po končanem eksperimentu stehtaj zračno posušen ostanek celuloznega materiala in odštej maso dodanih soli v posameznih variantah. Iz dobljenih količin izračunaj razliko med začetno maso dodane celuloze in maso ostanka celuloznega materiala. Na osnovi izmerjene količine proizvedenega CO 2 in spremembe teže celuloznega materiala izračunaj delež mineraliziranega in delež presnovljenega celuloznega materiala (organsko vezanega ogljika). V prvem približku privzamemo, da je testni material čisti polimer glukoze (C 6 H 10 O 5 ) n. Izračun ponovite z upoštevanjem teoretsko prerazporejanje ogljika pri mikrobni razgradnji organskega materiala pri dihanju s kisikom. Primerjajte dobljene rezultate iz meritev in teoretskega razporejanja. Tabela 6: Razlika v teži zračno suhega filter papirja (z.s.s.) med težo na začetku in koncu inkubacije ter količina sproščenega CO 2 pri različnih variantah razgradnje filter papirja. Začetna Končna % CO 2 v plinski fazi Vzorec teža snovi teža snovi (dnevi inkubacije) mg z.s.s. mg z.s.s. A B C D E F G H 17

25 Slika 1: Primer - Grafični prikaz nastajanja ogljikovega dioksida v eksperimentalnih variantah Izračun: 18

26 2. IZKORISTEK PORABE ORGANSKEGA SUBSTRATA V ODVISNOSTI OD FAKTORJEV OKOLJA Vaja 1: Eksperimentalni model porabe škroba in glukoze v okolju Organski substrat je za heterotrofne mikrobe vir energije in vir ogljika kot gradbenega elementa celice. Od tipa energetskega metabolizma je odvisno prerazporejanje substratnega C v metabolne produkte in v novosintetizirano biomaso udeleženega mikroba (glej tabelo pri vaji Kompletnost okolja). V eksperimentalnem rastnem modelu s kompleksno mikrobno združbo bomo ugotavljali prirast mikrobne biomase pri razgradnji škroba v odvisnosti od dostopnosti za kisik. Obnovi biokemijsko znanje o aerobnem in anaerobnem metabolizmu biopolimerov. Gojišče z vsemi potrebnimi hranili za rast heterotrofov in organskim substratom v obliki škroba ali glukoze bomo inokulirali s kompleksno združbo talnih mikrobov. Inkubacija v prisotnosti ali odsotnosti kisika bo trajala do popolne porabe substrata. Po končani inkubaciji bomo kvantificirali mikrobno biomaso in izračunali izkoristek porabe organskega substrata. Katere predpostavke bomo upoštevali pri interpretaciji rezultatov? Eksperimentalne variante: A. aerobna razgradnja škroba V 250 ml erlenmajerico odmerimo 38 ml vode + 5 ml raztopine soli po Winogradskem + 1 ml raztopine (NH 4 ) 2 SO 4 (47,2 mg/ml) + 5 ml raztopine škroba (50,0 mg/ml) + 50 µl raztopine mikroelementov + 1 ml suspenzije travniških tal. Posodo pokrijemo z Al-folijo (da omogočimo izmenjavo plinov). Inkubiramo aerobno na stresalniku (100 rpm), v temi, pri 28 o C, do porabe škroba. B. anaerobna razgradnja škroba V 160 ml penicilinko odmerimo 38 ml vode + 5 ml raztopine soli po Winogradskem + 1 ml raztopine (NH 4 ) 2 SO 4 (47,2 mg/ml) + 5 ml raztopine škroba (50,0 mg/ml) + 50 µl raztopine mikroelementov + 1 ml suspenzije travniških tal. Posodo plinotesno zamašimo z gumijastim zamaškom. Atmosfero zraka v penicilinki izmenjamo z atmosfero N 2 s trikratnim vakumiranjem in polnjenjem z N 2. Inkubiramo anaerobno na stresalniku (100 rpm), v temi, pri 28 o C do porabe substrata. C. aerobna poraba glukoze Enako kot varianta A. Namesto 5 ml raztopine škroba dodamo 5 ml raztopine glukoze (50 mg/ml). D - anaerobna poraba glukoze Enako kot varianta B. Namesto 5 ml raztopine škroba dodamo 5 ml raztopine glukoze (50 mg/ml). 19

27 Kvalitativno določanje škroba v gojišču z jodovico V vzorcih (0,5 ml), ki jih odvzemamo v nekajdnevnih intervalih pri variantah A in B ugotavljamo prisotnost škroba z barvno reakcijo z jodovico. Pojav modre obarvanosti vzorca po dodatku nekaj kapljic jodovice pomeni prisotnost škroba. Kvalitativno določanje glukoze v gojišču (Molishev test) V nekaj dnevnih intervalih odvzemi približno 1 ml vzorca iz variant C in D in dodaj 3 kapljice 5% 1-naftola v etanolu. Premešaj in previdno ob steni epruvete podplasti z 1 ml koncentrirane H 2 SO 4. Pozitivna reakcija je pojav vijolične barve na stiku obeh raztopin. Določanje mikrobne biomase Ko je porabljen ves organski substrat določimo količino novo sintetizirane mikrobne biomase v vsaki varianti z merjenjem celičnega proteina z biuretno reakcijo. Postopek za biuretno reakcijo: - kulturo homogeniziraj z ultraturaksom - celice iz 30 ml kulture požanji s centrifugo: RPM, 10 min - celice v usedku operi s 5 ml 0,9% NaCl in ponovno centrifugiraj - usedek resuspendiraj v 3 ml 0,9% NaCl - 1 ml (aerobna inkubacija) oziroma 2 ml (anaerobna inkubacija) suspenzije odpipetiraj v 10ml stekleno centrifugirko; vzporedno delaj slepo probo, ki vsebuje 2 ml H 2 O - dodaj 1 ml 3N NaOH - segrevaj 5 min v vodni kopeli pri 100 o C - ohladi - dodaj 1 ml 2,5% CuSO 4 - inkubiraj 5 min pri sobni T - centrifugiraj 10 min pri 3000 RPM - izmeri absorbanco supernatanta pri A 555 proti slepi probi - na osnovi umeritvene krivulje za serumski albumin določi količino proteina v vzorcu Iz podatkov o novonastali biomasi in porabljeni količini substrata izračunaj energetski izplen - donos biomase med rastjo mikrobne združbe v prisotnosti in v odsotnosti kisika. 20

28 Tabela 7: Izračun prirasta biomasnega proteina (BMP), biomase (BM) in ogljika v biomasi BM-C iz porabljenega substrata. Škrob aerobno Škrob anaerobno Glukoza aerobno Glukoza anaerobno BMP/ml BMP/mg BM/mg BM/mmol BM/mg-C BM-C / mg- C Pomembni odnosi: C 50% suhe BM proteini 50% suhe BM Izračun: 21

29 3. VELIKOST ZDRUŽBE IN DELEŽ AMILOLITIČNIH MIKROBOV V VZORCIH TAL IN VODE Škrob je polisaharid, ki se akumulira v različnih delih rastlin kot rezervna energetska snov. Grajen je iz amiloze, kjer so glukozne enote povezane v linearno verigo z α-(1-4) vezmi in amilopektina, kjer so poleg glukoznih enot v linearnih verigah α-(1-4) prisotne tudi razvejitve verig z vezjo α-(1-6). Amiloza je v vodi topna, medtem ko je amilopektin v vodi netopen. Razmisli, kakšna je sekundarna struktura amiloze in amilopektina in kakšne posledice ima to za razgradnjo škroba. V naravnih okoljih je razgradnja škroba predvsem biotične narave. Prva stopnja razgradnje je depolimerizacija, kjer se z aktivnostjo več različnih ekso in endo glukozidaz sproščajo glukozni ostanki. Ta stopnja razgradnje še ne omogoča rasti udeleženih mikrobov. Šele z oksidacijo monomerov v energetskem metabolizmu celice se v organski snovi nakopičena energija preveže v oblike, ki omogočajo energetsko napajanje rastnega procesa. Obnovi zanje o katabolnem in anabolnem metabolizmu celice. Ali znaš iz intermediatov pri razgradnji škroba sestaviti glavne celične komponente? Vaja 1: Velikost združbe amilolitičnih mikrooorganizmov v vzorcih vode in tal Pri konstantnih faktorjih okolja je razgradnja snovi proporcionalna velikosti udeležene mikrobne populacije. Tako je velikost populacije amilolitičnih mikrobov v vzorcu mera za amilolitični potencial vzorca. Velikost amilolitične populacije mikrobov v vzorcu lahko izmerimo z gojitveno metodo ugotavljanja najbolj verjetnega števila (MPN). Predpostavke pri oceni velikosti združbe z MPN metodo: - eksperimentalni sistem pripravimo tako, da za različne amilolitične mikroorganizme limitni faktor predstavlja dostopna energija. - mikroorganizmi, ki poleg amiloze za rast potrebujejo še kateri drugi vir energije ne prispevajo bistveno k amilolitični sposobnosti izbranega okolja - maksimalna hitrost rasti amilolitičnih mikroorganizmov (µ max ) ne vpliva na oceno za velikost združbe - ocena za velikost združbe ni odvisna od saturacijske konstane (K s ) amilolitičnih mikroorganizmov Ali te predpostavke vedno držijo? Razloži. Tekoče selektivno gojišče z amilozo kot edinim virom energije in ogljika nacepimo z razredčitvami vzorca v osmih ponovitvah. Po inkubaciji ugotavljamo porabo škroba z jodovim reagentom (lugol). 22

30 Gojišče za amilolite: razt. soli (Winogradsky) 50ml talni ekstrakt 10ml Amiloza 1,5g NH 4 NO 3 1,0g razt. mikroelementov 1ml deionizirana voda 1000ml Gojišče pripravimo v 250 ml erlenmajericah in avtoklaviramo 15 min pri 121 o C. Na mikrotitrske plošče sterilno prenesemo po 180 µl ohlajenega gojišča in shranimo na 4 o C do uporabe. Vzorci in razredčitve: - obdelovana tla 10-1 do konca mikrotitrske plošče - travniška tla 10-1 do konca mikrotitrske plošče - rečna voda 10-1 do konca mikrotitrske plošče - ustekleničena voda 10 0 do konca mikrotitrske plošče - rečni sediment 10-1 do konca mikrotitrske plošče - morski sediment 10-1 do konca mikrotitrske plošče Nacepljanje: V sterilno stekleno petrijevko prelij del vzorca in na multikanalni pipeti nastavi volumen na 20 µl (preveri natančen volumen na vajah). Zajemi vzorec in ga prenesi v prvo vrsto mikrotitrske plošče s tekočim selektivnim gojiščem z amilozo. Odvrzi nastavke, vzemi sterilne in kontrolirano premešaj vsebino luknjic s počasnim pipetiranjem gor in dol (3x). Nato vsebino prenesi v naslednjo vrsto in odvrzi nastavke. Kakšna je ta redčitvena vrsta? V čem se razlikuje od klasične priprave (serija sukcesivnih 10 kratnih razredčitev vzorca v sterilni fiziološki raztopini (1 ml vzorca + 9 ml fiziološke raztopine), kjer po 1 ml vzorca oz. razredčitve nacepiš v tekoče selektivno gojišče za amilolitične mikrobe)? Inkubacija: aerobna, v temi, vlažna komora, pri 28 o C, več tednov. Odčitavanje: V vsako jamico mikrotitrske plošče dodaj kapljico jodovice (lugol). Modra obarvanost pomeni prisotnost škroba (negativni primeri). Negativni test z jodovico pokaže pozitivne primere, to je nacepljena gojišča, v katerih je ves škrob porabljen (ni modre obarvanosti). Iz razporeda + in - znakov ugotovimo karakteristično število mikroorganizmov in s pomočjo tabel najbolj verjetno število mikrobov v vzorcu tal. Alternativno lahko na svetovnem spletu poiščeš kalkulator MPN (dodatna informacija: uporablja ga tudi,,food and Drugs Administration, ZDA). Kaj nam pove podatek o velikost amilolitične populacije iz naravnega vzorca o delovanju naravnega sistema? 23

31 Tabela 8: Po končani inkubaciji v spodnjo tabelo vpišite rezultate, ki ste jih odčitali z mikrotirske plošče. A B C D E F G H Vaja 2: Delež amilolitičnih mikrobov v mikrobni združbi Agarizirano diferencialno gojišče s peptonsko osnovo ter dodatkom škroba (8 g Nutrient broth, 10 g škroba, 15 g agarja / 1000 ml) omogoča rast širokega spektra heterotrofnih mikrobov. Test z jodovico pokaže kolonije amilolitičnih mikrobov. Nacepljanje: Pripravi serijo sukcesivnih 10 kratnih razredčitev vzorca v sterilni fiziološki raztopini (1 ml vzorca + 9 ml fiziološke raztopine) za nacepljanje z razmazom inokuluma po agariziranem diferencialnem gojišču. Nacepi po 0.1 ml razredčitev 10-3 do 10-6 pri talnih in sedimentnih vzorcih, razredčitev 10-1 do 10-4 pri vzorcu rečne vode in 10 0 do 10-3 pri vzorcu ustekleničene vode. Nacepljene plošče inkubiramo 7 dni v temi pri 28 o C. Odčitavanje: Plošče prelijemo z jodovico (lugolom). Okrog kolonij, ki so porabile škrob v gojišču se pojavi svetlina (ni modre obarvanosti), kar omogoči ločevanje kolonij amilolitičnih mikrobov od kolonij neamilolitičnih mikroorganizmov. S preštevanjem vseh kolonij na ploščah ugotovimo skupno število heterotrofov; s preštevanjem kolonij s svetlinami pa število amilolitičnih mikrobov. Uporabi samo števne plošče. Rezultat izrazi kot delež amilolitičnih mikrobov v vzorcih. Razmisli, na osnovi katere predpostavke lahko podatek o številu aerobnih mineralizatorjev dušika interpretiramo tudi kot število heterotrofov? Glej vaja Amonifikacija. 24

32 Tabela 9: Število amilolitičnih mikrobov na gram zračno suhih tal oziroma ml vzorca v različnih naravnih okoljih. Št. amilolitov Št. heterotrofov Št. kolonij amilolitov Št. vseh mikrobov žč (metoda MPN) (metoda MPN) (na ploščah) (na ploščah) obdelovana tla travniška tla rečna voda ustekleničena voda rečni sediment morski sediment Iz vaje Amonifikacija 25

33 4. MIKROBNA BIOMASA Mikroorganizmi so pomembna komponenta organskega materiala v vseh ekosistemih. Mikrobna biomasa je zelo dinamična komponenta, ki v povprečju predstavlja 1-3 % celotnega C in 5 % skupnega dušika. Ker mikrobi opravljajo procese, ki so ključnega pomena za funkcioniranje ekosistema (npr. kroženje elementov), je velikost in aktivnost biomase pomemben parameter pri študiju pretoka energije v ekosistemu. Z razpoložljivo analitiko je eksperimentalno določanje skupne mikrobne biomase»in situ«trenutno nemogoče. Mikrobno biomaso lahko določamo v laboratoriju. Kljub temu, da obstaja več metod za določanje skupne mikrobne biomase v kompleksnih vzorcih so te metode večinoma pomankljive. Za določanje mikrobne biomase uporabljamo: - fumigacijsko-inkubacijsko metodo - fumigacijsko ekstrakcijsko metodo - s substratom inducirano respiracijsko metodo - analizo ATP S substratom inducirana respiracija (SIR) V aerobnih razmerah so večinski produkti mikrobne respiracijske presnove organskega ogljika, CO 2, H 2 O in novonastala biomasa. Produkcija CO 2 je lahko mera za hitrost respiracije. Metodo sta razvila Anderson in Domsch za potrebe hitrega določevanja mikrobno biomasnega C v talnih vzorcih. Avtorja sta odkrila, da bakterijska respiracija že v nekaj minutah po dodatku mikrobom dostopnega substrata doseže maksimalno aktivnost. Količina CO 2 /h je konstantna od 6 do 8 ur po dodatku substrata, nato pa količina CO 2 začne naraščati zaradi nastanka nove biomase. Začetna hitrosti respiracije po dodatku substrata v vzorec (npr. glukoze, asparigina, škroba) je mera za skupno mikrobno biomaso tal, ki raste na izbranem substratu. Metoda ne daje absolutnih vrednosti za biomaso, rezultate pa lahko uporabimo za relativne primerjave. Avtorja sta ugotovila značilno visoko korelacijo (R 2 = 0,96) med rezultati te metode in fumigacijske metode določanja biomase. Pri 22 o C tako velja, da je 1 ml CO 2 /h ekvivalenten 40 mg mikrobno biomasnega C. Razmisli zakaj se fumigacijska metoda za določanje biomase uporablja kot referenčna metoda? Predpostavke na katerih temelji SIR metoda za določanje biomase: - SIR odziv različnih mikroorganizmov je konstanten - po dodatku substrata začne večina talnih mikroorganizmov z respiracijo - glukoza je primeren substrat za indukcijo maksimalnega efekta - delež mikroorganizmov, ki ne metabolizirajo glukoze je majhen - pred dodatkom substrata je večina mikroorganizmov v fazi mirovanja oziroma v stacionarni fazi Ali so omenjene predpostavke smiselne? V novejšem času so meritve s substratom inducirane respiracije uporabljene za opis mikrobne združbe. V primeru, da opravimo SIR meritve za več različnih substratov dobimo SIR profil 26

34 mikrobne združbe v vzorcu. Za vsak uporabljeni substrat je potrebno določiti optimalno koncentracijo substrata. SIR metoda omogoča enostavno in hitro vrednotenje metabolne raznolikosti mikrobnih združb ter vrednotenje spreminjanja strukture mikrobnih združb v odvisnosti od spreminjanja okolja. Bistvena prednost SIR metode pred ostalimi metodami za vrednotenje biomase je ta, da ni potrebna izolacija in gojenje mikroorganizmov. Razmisli, kako bi uporabil SIR metodo za opis mikrobne združbe. Vaja 1: SIR vzorca tal Substratno inducirano respiracijo določamo v vzorcu svežih tal. Iz vzorca tal odstrani rastlinske ostanke. Vzorec zemlje (50 g tal) dodaj v 125 ml serumsko steklenico in vmešaj predpisano količino substrata. Tla naj bodo primerno navlažena (~ 55% WHC). Vzorce plinotesno zapri in v enournih razmikih meri nastali CO 2 s plinskim kromatografom. Variante: A: 50 g tal (kontrola) B: 50 g tal + 1 g glukoze C: 50 g tal + 1 ml CH 3 Cl + 1 g glukoze D: 50 g tal + 1 g škroba + 1 g glukoze E: 50 g tal + 1 g glukoze + 60 ml H 2 O F: 50 g tal + 1 ml rastlinskega gnojila G: 50 g tal + 1 ml rastlinskega gnojila + 1 g glukoze Tabela 10: Produkcija CO 2 pri vzorcih tal iz različnih eksperimantalnih variantah. Varianta Začetni % CO 2 % CO 2 po eni uri % CO 2 po dveh urah A B C D E F G % CO 2 po treh urah Grafično predočite potek naraščanja koncentracij CO 2 za vse variante v enotah: µg CO 2 -C / g suhih tal h. Upoštevajte v vodi raztopljeni CO 2 in iz ustreznih variant izračunaj velikost mikrobne biomase za obravnavani vzorec. Razmislite, zakaj morate od respiracije v eksperimentalni varianti odšteti respiracijo v kontrolni varianti, ko delate s svežimi vzorci tal. 27

35 Izračun: 28

36 5. METAN OKSIDIRAJOČE BAKTERIJE (MOB) Oksidacija metana lahko poteka tako aerobno kot anaerobno, vendar je poznavanje slednjega procesa, ki naj bi ga opravljale arheje slabše. Aerobne metan oksidirajoče bakterije (MOB) igrajo pomembno vlogo v globalnem kroženju metana, saj bi se brez njihove aktivnosti 60-90% v tleh proizvedenega metana izločilo v atmosfero. Metan oksidirajoče bakterije neposredno zmanjšujejo toplogredni potencial okolja. MOB tipa I (γ-proteobakterije) so sposobne rasti zgolj pri nizkih koncentracijah metana (200 ppm), medtem ko MOB tipa II (α-proteobakterije) rastejo zgolj pri višjih koncentracijah metana v zraku. Znano je, da višja vsebnost vode v tleh in povišana temperatura tal vplivata na strukturo in aktivnost MOB, vendar je kumulativen učinek obeh manjši od učinka vode oziroma temperature posebej. Kako si razlagaš ugotovitev, da je skupen učinek dejavnikov v okolju pogosto manjši od učinka posameznega dejavnika? Vaja 1: Velikost združbe metan oksidirajočih bakterij Velikost te združbe v vzorcu lahko izmerimo z gojitveno metodo ugotavljanja najbolj verjetnega števila (MPN). Tekoče mineralno gojišče nacepimo z ustreznimi razredčitvami vzorca v osmih ponovitvah. Po inkubaciji ugotavljamo prisotnost motnosti. Mineralno gojišče za metan oksidirajoče bakterije: NaH 2 PO 4 2 H 2 O 0,35 g KH 2 PO 4 0,34 g NH 4 Cl 0,54 g MgSO 4 7H 2 O 0,39 g CaCl 2 (0,2 M) 0,5 ml elementi v sledeh 1 ml deionizirana voda 1000 ml ph 6,8 Gojišče pripravimo v 250 ml erlenmajericah in avtoklaviramo 15 min pri 121 o C. Na mikrotitrske plošče sterilno prenesemo po 100 µl ohlajenega gojišča in shranimo na 4 o C do uporabe. Vzorci in razredčitve: - obdelovana tla 10-1 do konca mikrotitrske plošče - travniška tla 10-1 do konca mikrotitrske plošče - morski sediment 10-1 do konca mikrotitrske plošče - rečni sediment 10-1 do konca mikrotitrske plošče - rečna voda 10 0 do konca mikrotitrske plošče - ustekleničena voda 10 0 do konca mikrotitrske plošče 29

37 Nacepljanje: V sterilno stekleno petrijevko prelij del vzorca in na multikanalni pipeti nastavi volumen na 33 µl (preveri natančen volumen na vajah). Zajemi vzorec in ga prenesi v prvo vrsto mikrotitrske plošče s tekočim mineralnim gojiščem. Odvrzi nastavke, vzemi sterilne in kontrolirano premešaj vsebino inokuliranih luknjic s počasnim pipetiranjem gor in dol (3x). Nato vsebino prenesi v naslednjo vrsto in odvrzi nastavke. Za ta eksperiment je potrebno identično inokulirati dve mikrotitrski plošči. Inkubacija: Kontrolno mikrotitrsko ploščo inkubiraj v stekleni posodi v prisotnosti zraka in zračne koncentracije metana (1,8 ppm), pri temperaturi 28 o C, 4 tedne. Drugo, eksperimentalno mikrotirsko ploščo inkubiraj v drugi stekleni posodi, v katero boš skozi septo dodal 20% volumna posode čistega metana s 50 ml brizgo. Kakšna je koncentracija metana v tem primeru? Odčitavanje: Motne cone na dnu mikrotitrske plošče kažejo pozitivne primere rasti heterotrofnih bakterij v kontrolni plošči oziroma metan oksidirajočih bakterij v eksperimentalni. Iz razporeda + in - znakov ugotovi karakteristično število in s pomočjo tabel odčitaj najbolj verjetno število mikrobov. Šele razlika ugotovljenih najbolj verjetnih števil med eksperimentalno in kontrolno ploščo poda najbolj verjetno število bakterij udeleženih pri oksidaciji metana v izbranem vzorcu iz okolja. Tabeli 11 in 12 : Po končani inkubaciji v spodnjo tabelo vpišite rezultate, ki ste jih odčitali z eksperimentalne in kontrolne mikrotitrske plošče. Eksperimentalna : A B C D E F G H Kontrolna : A B C D E F G H 30

38 Tabela 13: Število metan oksidirajočih bakterij na g zračno suhih tal oziroma ml vzorca iz različnih naravnih okolij. Obdelovana tla Travniška tla Morski sediment rečni sediment Rečna voda Ustekleničena voda Število mikrobov (Metoda MPN) 31

39 III. ŽVEPLO 1. MINERALIZACIJA ŽVEPLA Pri mineralizaciji organskega ogljika prihaja do sproščanja mineralnih oblik žvepla. V aerobnih pogojih je končni produkt mineralizacije žvepla nastanek sulfata. V anaerobnih pogojih je končni produkt mineralizacije H 2 S ali dimetilsulfid, poleg tega pa lahko prihaja tudi do tvorbe različnih merkaptanov. Del mineraliziranega žvepla se takoj porabi za sintezo nove biomase v procesu imobilizacije žvepla. Mikroorganizmi poleg sulfata lahko sprejemajo žveplo v različnih mineralnih oblikah: hiposulfat, tiosulfat, persulfat, sulfid, elementarno žveplo, sulfit, tetrationat in tiocianat. Poleg tega pa lahko mikroorganizmi sprejemajo žveplo tudi v organski obliki kot cistein, cistin, sulfooksalat in metionin. Žveplo, ki se sprosti v okolje predstavlja višek žvepla za rastne potrebe udeleženih mikrobov. Delež mineraliziranega žvepla, ki se sprosti v okolje je podobno kot pri mineralizaciji dušika odvisen od C : S razmerja v razgrajevani organski snovi in razmerja C : S v mikrobni celici. Na žveplu so možne tako biološke kot kemijske spremembe. Pri katerih pogojih so biološke reakcije favorizirane? Pri izrabi organskih žveplovih snovi se mineralno žveplo sprošča v okolje v obliki merkaptanov, dimetilsulfida in H 2 S. Predvsem H 2 S je močno reaktiven in reagira s kovinami v slabo topne ali netopne sulfide. To lastnost izkoriščamo pri identifikaciji anaerobne mineralizacije žvepla. Vaja 1: Velikost mikrobne združbe anaerobnih mineralizatorjev organskega žvepla Tekoče gojišče, ki vsebuje organsko vezano žveplo (cistein) in železov amon citrat nacepimo z razredčitvami vzorca v treh ponovitvah (Metoda MPN). Po inkubaciji ugotavljamo prisotnost črne oborine železovega sulfida. Gojišče za mineralizatorje žvepla: NH 4 Cl 1,00g K 2 HPO 4 0,50g CaCl 2 2H 2 O 0,13g Na-laktat 50% 6,20ml cistein 1,00g Fe-amonijski citrat 0,50g talni ekstrakt 20ml deionizirana voda 1000ml Gojišče pripravimo v 250 ml erlenmajericah in avtoklaviramo 20 min pri 110 o C. 32

40 Vzorci in razredčitve: - obdelovana tla 10-1 do travniška tla 10-1 do morski sediment 10-1 do rečni sediment 10-1 do rečna voda 10 0 do ustekleničena voda 10 0 do 10-3 Nacepljanje: Pripravimo serijo sukcesivnih 10 kratnih razredčitev vzorca v sterilni fiziološki raztopini (1 ml vzorca + 9 ml fiziološke) do navedenih najvišjih razredčitev za posamezni vzorec. Po 1 ml vzorca oz. vsake razredčitve nacepimo v treh ponovitvah v pripravljeno tekoče selektivno gojišče z organskim žveplom. V vsako epruveto aseptično dodaj risalni žebljiček, ki si ga predhodno ožgal v plamenu in ohladil. Inkubacija: V anaerobnih razmerah (anaerobni lonec z atmosfero N 2 ), pri temperaturi 28 o C, nekaj tednov. Odčitavanje: prisotnost črne oborine železovega sulfida kaže pozitivne primere. Iz razporeda + in - znakov ugotovimo karakteristično število in s pomočjo tabel najbolj verjetno število mikrobov v vzorcu, ki anaerobno mineralizirajo žveplo v anaerobiozi do H 2 S. Tabela 14: Po končani inkubaciji v spodnjo tabelo vpišite rezultate, ki ste jih odčitali z epruvet. A B C Tabela 15: Število mineralizatorjev žvepla na g zračno suhih tal oziroma ml vzorca iz različnih naravnih okolij. Število mikrobov (Metoda MPN) Obdelovana tla Travniška tla Morski sediment rečni sediment Rečna voda Ustekleničena voda 33

41 2. REDUKCIJA SULFATOV V anaerobnih razmerah skupina striktno anaerobnih bakterij (sulfatni respiratorji) izrablja sulfat kot prevzemnik elektronov (dihanje s sulfatom). Sulfat se pri tem procesu reducira do H 2 S. Vir elektronov so nizkomolekularne organske kisline (npr. acetat, laktat, etanol) in tudi H 2. Vaja 1: Velikost združbe sulfatnih respiratorjev Tekoče gojišče z laktatom, železovim amon citratom in sulfatom nacepimo z razredčitvami vzorca v treh ponovitvah (Metoda MPN). Ob nacepljanju dodamo v vsako epruveto risalni žebljiček, ki smo ga predhodno ožgali nad plamenom. Po inkubaciji ugotavljamo prisotnost črne oborine železovega sulfida. Gojišče za sulfatne respiratorje: NH 4 Cl K 2 HPO 4 MgSO 4 7H 2 O CaCl 2 2H 2 O Na-laktat (50%) Fe-amonijski citrat Deionizirana voda 1,00 g 0,50 g 4,10 g 0, 13 g 6,20 ml 0,5 g 1000 ml Gojišče je pripravljeno po 10 ml v epruvetah 16 x 160 mm in avtoklavirano 20 min pri 110 o C. Vzorci in raredčitve: - obdelovana tla 10-1 do travniška tla 10-1 do morski sediment 10-1 do rečni sediment 10-1 do rečna voda 10 0 do ustekleničena voda 10 0 do 10-3 Nacepljanje: Pripravi serijo sukcesivnih 10 kratnih razredčitev vzorca v sterilni fiziološki raztopini (1 ml vzorca + 9 ml fiziološke) do navedenih najvišjih razredčitev za posamezni vzorec. Po 1 ml vzorca oz. vsake razredčitve nacepi v treh ponovitvah v pripravljeno tekoče selektivno gojišče s sulfatom in laktatom. V vsako epruveto aseptično dodaj risalni žebljiček, ki si ga predhodno ožgal v plamenu in ohladil. Inkubacija: V anaerobnih razmerah (anaerobni lonec z atmosfero N 2 ), pri temperaturi 28 o C, nekaj tednov. 34

42 Odčitavanje: Pojav črne oborine železovega sulfida na žebljičku kaže pozitivne primere. Iz razporeda + in - znakov ugotovi karakteristično število in s pomočjo tabel najbolj verjetno število sulfatnih respiratorjev v vzorcu. Tabela 16: Po končani inkubaciji v spodnjo tabelo vpišite rezultate, ki ste jih odčitali z epruvet A B C Vaja 2: Vpliv kisika na sulfatno respiracijo Gojišče enake sestave kot pri vaji 1 nacepi s suspenzijo tal. Varianti: A. 50 ml gojišča v 250 ml erlenmajerici, 1 ml suspenzije tal. Inkubacija: aerobno na stresalniku pri 28 o C, v temi; nekaj tednov. B. 50 ml gojišča v 150 ml serumski steklenici, 1 ml suspenzije tal. Inkubacija: anaerobno - plinska faza v steklenici je N 2 - na stresalniku pri 28 o C, v temi; nekaj tednov Odčitavanje: Po nekaj tednih opazuj pojavljanje črne oborine fero sulfida. Primerjaj dobljeni rezultat z rezultati podobnih testov pri denitrifikaciji. Slika 2: Grafično prikažite vpliv prisotnosti / odsotnosti kisika na proces sulfatne respiracije 35

43 Vaja 3: Sulfatna respiracija v sedimentu V morski vodi je sulfatni ion prisoten v visoki koncentraciji (~30 mm) zato ni pričakovati omejujoče vloge tega iona za sulfatno respiracijo v anaerobnih morskih sedimentih. Nasprotno, količina sulfata je v sladkih vodah nizka, zato je sulfat lahko omejujoči dejavnik za sulfatno respiracijo v sladkovodnih sedimentih. Drugi omejujoč dejavnik tega procesa je v naravnih okoljih lahko tudi donor elektronov organska snov. Morebitno omejujočo vlogo energetskega substrata in/ali prevzemnika elektronov lahko preverimo z opazovanjem in kvantifikacijo sulfatne respiracije v vzorcih sedimenta, ki jih obogatimo z laktatom kot modelnim energetskim virom in sulfatom kot prevzemnikom elektronov. Priprava, obogatitev in inkubacija vzorcev: Vzorce morskega in ločeno sladkovodnega sedimenta (po 50g) zatehtaj v pet 130 ml infuzijskih steklenic in dodaj po 20 ml morske oz. sladke vode. Variante: A: kontrola - brez obogatitev B: 1 ml 50% raztopine Na-laktata, C: 1 ml raztopine Na 2 SO 4 (85,2 mg Na 2 SO 4 /ml), D: 1 ml 50% raztopine Na-laktata in 1 ml raztopine Na 2 SO 4 (85,2 mg Na 2 SO 4 /ml), E: varianta D brez zamenjane atmosfere (prisotnost kisika) Steklenice zamaši z gumijastimi zamaški in Al pokrovčki, zračno atmosfero pa zamenja z atmosfero N 2, razen v varianti E. Vzorce inkubiramo nekaj tednov pri 28 o C v temi. Odčitavanje: Opazuj in primerjaj obarvanost obogatenih vzorcev glede na kontrolne vzorce. Produkt sulfatne respiracije je H 2 S, ki reagira s kovinami v temno obarvane kovinske sulfide. Tabela 17: Število sulfatnih respiratorjev na g zračno suhih tal oziroma ml vzorca iz različnih naravnih okolij. Obdelovana tla Travniška tla Morski sediment rečni sediment Rečna voda Ustekleničena voda Število mikrobov (Metoda MPN) 36

44 Tabela 18: Sulfatna respiracija v morskem in rečnem sedimentu Variante morski sediment rečni sediment A B C D E Slika 3: Primer rezultatov eksperimenta komplementacije okolja za sulfatne respiratorje v vzorcih rečnega in morskega sedimenta. 37