PRODUKCIA ANTIMIKROBIÁLNYCH LÁTOK BAKTÉRIAMI MLIEČNEHO KYSNUTIA

Transcription

1 PRODUKCIA ANTIMIKROBIÁLNYCH LÁTOK BAKTÉRIAMI MLIEČNEHO KYSNUTIA TATIANA MANČUŠKOVÁ, ALŽBETA MEDVEĎOVÁ a ĽUBOMÍR VALÍK Oddelenie výživy a hodnotenia potravín, Ústav biochémie, výživy a ochrany zdravia, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU, Radlinského 9, Bratislava tatiana.mancuskova@stuba.sk Došlo , prijaté Kľúčové slová: baktérie mliečneho kysnutia, antimikrobiálne látky, konzervácia potravín Obsah 1. Úvod 2. Baktérie mliečneho kysnutia 3. Antimikrobiálne metabolity baktérií mliečneho kysnutia 3.1. Organické kyseliny 3.2. Oxid uhličitý 3.3. Etanol 3.4. Peroxid vodíka 3.5. Diacetyl 3.6. Reuterín 3.7. Bakteriocíny 4. Záver 1. Úvod V súčasnosti je v potravinárskom priemysle na konzerváciu využívané široké spektrum chemických látok s mikrobicídnymi a mikrobistatickými účinkami. Mnohé z nich však u spotrebiteľov vyvolávajú obavy z možnej toxicity a negatívneho efektu na ich zdravie. Tlak spotrebiteľov na obmedzenie chemických konzervantov v potravinách a súčasný tlak obchodných reťazcov na predĺženie trvanlivosti výrobkov, vedie k vývoju nových metód konzervácie s využitím prírodných antimikrobiálnych látok produkovaných baktériami mliečneho kysnutia. Viac než sto rokov vzbudzujú baktérie mliečneho kysnutia záujem nielen potravinárskych mikrobiológov. Pozornosť je venovaná na jednej strane účinku kyslomliečnych baktérií na ľudské zdravie, na druhej strane ich schopnosti konzervovať potraviny a predlžovať ich trvanlivosť. Súvislosť medzi kyslomliečnymi baktériami a ľudským zdravím predpokladal už začiatkom 20. storočia I. I. Mečnikov, ktorý odporúčal konzumáciu fermentovaných mliečnych produktov ako prevenciu pred ochoreniami a predčasným starnutím. Schopnosť baktérií mliečneho kysnutia inhibovať negatívny vplyv iných mikroorganizmov vstupujúcich do ľudského organizmu, však bola dlho podceňovaná. Intenzívnejší výskum v tejto oblasti bol zaznamenaný až v 90. rokoch minulého storočia. Táto práca sa venuje popisu vlastností najdôležitejších metabolitov, mechanizmov ich účinku a informuje o možnostiach ich využitia v biokonzervácii potravín. 2. Baktérie mliečneho kysnutia Zabezpečenie mikrobiálnej bezpečnosti a predĺženie trvanlivosti so súčasným zvýšením organoleptickej hodnoty sa v mnohých fermentovaných potravinách dosahuje pomocou prítomnosti a/alebo prídavku baktérií mliečneho kysnutia. Skupina baktérií mliečneho kysnutia pozostáva z grampozitívnych baktérií so spoločnými morfologickými, fyziologickými a metabolickými vlastnosťami. Ide o nesporulujúce, fakultatívne anaeróbne alebo mikroaerotolerantné koky alebo paličky, ktoré fermentujú sacharidy za vzniku kyseliny mliečnej, prípadne ďalších metabolitov. V súčasnosti najmä vďaka molekulárno-genetickým metódam zahŕňa táto skupina veľký počet rôznych bakteriálnych rodov. Medzi baktérie mliečneho kysnutia radia potravinársky relevantné rody Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc a ďalšie rody: Enterococcus, Oenococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Vagococcus, Weisella a Tetragenococcus 1. Pôsobením baktérií mliečneho kysnutia vo fermentovaných výrobkoch dochádza k želanej degradácii sacharidov, lipidov, bielkovín a ďalších zložiek mlieka (napr. citrátov, anorganických solí) za vzniku rôznych metabolických produktov, čo má pozitívny vplyv na fyzikálnochemické i organoleptické vlastnosti konečného produktu. Produkcia kyselín a ďalších antimikrobiálnych látok vedie k inhibícii potenciálne prítomných technologicky a zdravotne nežiaducich mikroorganizmov. Niektoré baktérie mliečneho kysnutia môžu mať dokonca probiotický charakter 1,2. 3. Antimikrobiálne metabolity baktérií mliečneho kysnutia V uplynulých rokoch bolo publikovaných množstvo prác zaoberajúcich sa produkciou antimikrobiálnych metabolitov baktériami mliečneho kysnutia, ktoré sú schopné 179

2 inhibovať rast a metabolickú aktivitu technologicky a zdravotne nežiaducej mikrobioty. Medzi takéto látky patria hlavne organické kyseliny, oxid uhličitý, etanol, peroxid vodíka, diacetyl, reuterín, bakteriocíny a ďalšie Organické kyseliny Najbežnejším spôsobom využívaným na zamedzenie rastu nežiaducej mikrobioty je zníženie ph na hodnoty, pri ktorých sú patogénne mikroorganizmy inhibované. Nízke ph v mliečnych výrobkoch je najčastejšie spôsobené produkciou organických kyselín kyslomliečnymi baktériami 3. Lepšie pochopenie mechanizmu, akým bunky odpovedajú na prítomnosť organických kyselín, sa pre predpovedanie a zlepšovanie stratégie konzervovania potravín stalo nevyhnutnosťou. Bolo dokázané, že slabé organické kyseliny iba inhibujú rast mikroorganizmov a predlžujú ich lag-fázu, avšak vo všeobecnosti nespôsobujú ich úplnú elimináciu 4. V kyslom prostredí sú nedisociované organické kyseliny lipofilné a dokážu voľne difundovať cez bunkovú membránu do cytoplazmy. Vo vnútri bunky je ph blízke neutrálnemu, čo vedie k disociácii molekuly za uvoľnenia protónu vodíka a následnému okysleniu cytoplazmy 5,6. Aby mohli v akejkoľvek bunke prebiehať základné životné procesy, ako napríklad expresia génov, proteosyntéza a enzymatická aktivita, nevyhnutnosťou je dostatočná stabilita intracelulárneho ph. Voľné protóny vodíka však znižujú pufrovaciu kapacitu cytoplazmy, spôsobujú pokles jej ph a membrána nie je schopná udržať ph gradient 5. Dochádza k narušeniu bunkovej membrány, jej perforácii a poškodeniu transportných mechanizmov. Na vylúčenie nadbytku vodíkových iónov z bunky je potrebné odstrániť rozdiel membránového potenciálu medzi vnútorným stavom bunky a vonkajším prostredím. Dosiahne sa to vstupom draselných iónov do bunky, čo má však za následok rozvrátenie homeostázy. Obmedzenie aktívneho transportu má vplyv na príjem živín aj efektivitu transportu molekúl kyseliny z bunky 6,7. Mnohé štúdie dokazujú, že účinok kyselín nespočíva len v ovplyvňovaní hodnoty ph. Rast alebo inhibícia nežiaducich mikrobiálnych druhov v potravinách závisí tiež od typu prítomnej kyseliny, jej disociačnej konštanty a koncentrácie 8. Organické kyseliny môžu podporiť syntézu peroxidáz a zasiahnuté bunky sú preto náchylnejšie podliehať oxidačným zmenám. Podobne ako vysoká teplota tiež čiastočne narúšajú vodíkové mostíky a van der Waalsove väzby medzi aminokyselinovými zvyškami bielkovín a spôsobujú ich denaturáciu 9. Dôsledkom vysokej koncentrácie organických kyselín v prostredí je aj inhibícia základných metabolických procesov. Zamedzenie normálnemu priebehu glykolýzy vedie k zníženiu výťažnosti ATP pri metabolizme sacharidov a nižšej využiteľnosti aminokyselín 7. Vyššia spotreba energie, v snahe o udržanie homeostázy, bunku ešte viac vyčerpáva a jej rast sa zastavuje 3. Inhibované sú tiež procesy prebiehajúce ako následok fyziologického stresu (napr. odpoveď na šok vyvolaný vysokou teplotou prostredia) 10. Toxicita a antimikrobiálny účinok organických kyselín sa ďalej pripisuje akumulácii toxických aniónov v bunke. Anióny organických kyselín, ktorých presun cez lipofilnú membránu nie je možný práve pre ich záporný náboj, sa hromadia v bunke, kde blokujú metabolické procesy. Väzbou na bunkovú membránu narúšajú jej permeabilitu, blokujú transport substrátu, a tým množstvo enzymatických reakcií. Bunka nedokáže zvládnuť zvýšený osmotický tlak, zastavuje svoj rast a hynie 3,6. Významnú úlohu zohráva produkcia organických kyselín pri biokonzervácii fermentovaných mliečnych výrobkov, kde pri riadenej fermentácii dosahuje obsah kyseliny mliečnej koncentráciu 35 g l 1. Zistený bol inhibičný efekt produkovaných kyselín a zodpovedajúceho poklesu ph na rast Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae a Shigella flexneri v tradičných syroch 11,12. Mikrobistatický účinok kyseliny mliečnej a octovej bol dokázaný voči zástupcom rodu Vibrio, ktoré kolonizujú črevný trakt morských rýb a spôsobujú ich kazenie 13. Uvedené kyseliny majú tiež stabilizujúci efekt pri skladovaní kukuričnej siláže, ktorá bola inokulovaná baktériami z rodov Lactobacillus, Pediococcus a Enterococcus fermentujúcimi sacharidy za vzniku kyselín 14. Mikrobicídny účinok ostatných organických kyselín, napr. propiónovej, maslovej, valérovej a fenylmliečnej, je vo všeobecnosti menej významný, nakoľko ich produkcia baktériami mliečneho kysnutia je v porovnaní s kyselinou mliečnou a kyselinou octovou niekoľkonásobne nižšia Oxid uhličitý Mnohé kyslomliečne baktérie produkujú tiež nízkomolekulové zlúčeniny, ktoré rovnako môžu zabrániť rozvoju patogénnych a potenciálne patogénnych mikroorganizmov. Medzi takéto zlúčeniny patrí oxid uhličitý, ktorý produkujú heterofermentatívne baktérie pri fermentácii sacharidov. CO 2 vzniká tiež pri dekarboxylácii aminokyselín, čo sa môže negatívne prejaviť pri tzv. sekundárnej fermentácii syrov. Oxid uhličitý znižuje redoxný potenciál potravinovej matrice, čím zabraňuje rastu striktne aeróbnych a obligátne aeróbnych mikroorganizmov (rody Pseudomonas, Mycobacterium) 15,16. Okrem znižovania redoxného potenciálu, spočíva antimikrobiálny efekt oxidu uhličitého v schopnosti prechádzať cez bunkovú membránu a rozpúšťať sa vo vode za vzniku kyseliny uhličitej. Tá následne pri neutrálnom intracelulárnom ph disociuje a jej účinok je podobný účinku slabých organických kyselín 17. V dôsledku zvýšenej koncentrácie tohto plynu v prostredí (nad 10 %) sa mení štruktúra bunkovej membrány a znižuje sa absorpcia a využiteľnosť živín bakteriálnou bunkou 18. CO 2 navyše inhibuje niektoré metabolické dráhy, pretože sa viaže na proteíny a enzýmy (najmä enzýmy zúčastňujúce sa procesu karboxylácie alebo dekarboxylácie) 19. Hasapidou a Savvaidis 20 preukázali, že prítomnosť CO 2 nemá inhibičný účinok voči mliečnym baktériám, dokonca môže stimulovať rast niektorých druhov 180

3 (Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides, Lactococcus lactis) Etanol Pri degradácii hexóz heterofermentatívnymi baktériami mliečneho kysnutia je bežným produktom tiež etanol, ktorý podobne ako väčšina chemických látok s dezinfekčným efektom, pôsobí na mikrobiálnu bunku komplexným mechanizmom. Hlavný účinok sa spája so zrážaním a denaturáciou proteínov 22. Molekuly alkoholu interferujú s alkylovými skupinami aminokyselín a tvoria s nimi vodíkové väzby, čím narúšajú pôvodné vodíkové väzby zabezpečujúce sekundárnu a terciárnu štruktúru danej bielkoviny 23,24. Etanol, vzhľadom na svoj polárny charakter, obmedzuje hydrofóbne interakcie nepolárnych častí lipidov, ale tiež oslabuje vodíkové väzby a elektrostatické sily, ktorými sú membránové lipidy viazané s membránovými proteínmi 24. Sorpciou lipidov môže spôsobiť dezintegráciu bunkových membrán 25, čo vedie k uvoľneniu bunkových organel do prostredia a lýze bunky 23. Komplexný antimikrobiálny efekt etanolu zvyšuje jeho schopnosť dehydratovať prostredie a znižovať aktivitu vody 25. Alkoholy, vrátane etanolu, majú vysokú mikrobicídnu aktivitu voči grampozitívnym a gramnegatívnym baktériám vo vegetatívnom štádiu a tiež voči kvasinkám a vláknitým hubám. Účinnosť voči bakteriálnym spóram je však nízka 26. Pri expozícii Listeria monocytogenes nízkemu ph, organickým kyselinám a osmotickému stresu etanol výrazne zvyšuje mikrobicídny efekt prostredia 27. Je účinný tiež voči vegetatívnym bakteriálnym bunkám Bacillus tuberculosis, avšak jeho účinok voči spóram je zanedbateľný 25. Rast baktérií mliečneho kysnutia je inhibovaný, keď obsah etanolu v médiu dosiahne hodnotu približne 13 % (v/v), avšak senzitivita na alkohol je rodovo aj druhovo závislá. Zástupcovia z rodu Lactobacillus sú zvyčajne odolnejší ako ostané kyslomliečne baktérie. Lb. fructivorans (predtým Lactobacillus trichodes) znáša až 20 % etanolu v prostredí 28. Konzervácia spoločným účinkom organických kyselín a etanolu produkovaných baktériami mliečneho kysnutia a kvasinkami sa využíva pri výrobe kefírov. Laktobacily sú pritom schopné vyprodukovať viac než 10 g l 1 etanolu 29. Pre zabezpečenie zdravotnej bezchybnosti konečného produktu je preto dôležitý výber vhodnej zákysovej kultúry Peroxid vodíka Niektoré baktérie mliečneho kysnutia dokážu v prítomnosti molekulárneho kyslíka produkovať a akumulovať peroxid vodíka na koncentrácie, ktoré pôsobia inhibične na iné baktérie 7. Kľúčovou reakciou biochemickej premeny sacharidového substrátu je oxidatívna dekarboxylácia pyruvátu pomocou pyruvátoxidázy 26. Dekarboxyláciou pyruvátu vzniká octan a oxid uhličitý, zostávajúce dva vodíkové protóny a dva elektróny sú transportované na FAD kofaktor. Flavín sa potom reoxiduje a redukčné ekvivalenty odovzdáva molekule kyslíka za vzniku peroxidu vodíka 30. Výrazný oxidačný stres, ktorý táto látka spôsobuje bunke, je zodpovedný za jej baktericídny efekt. Mechanizmus pôsobenia je spojený s tvorbou vysoko reaktívnych hydroxylových a superoxidových radikálov, ktoré poškodzujú membránové lipidy, DNA a ďalšie bunkové štruktúry 7. Fosfolipidová dvojvrstva je veľmi senzitívna na oxidačný stres z dôvodu vysokého obsahu polynenasýtených mastných kyselín vo svojej štruktúre. Oxidácia aminokyselín, z ktorých pozostávajú bielkoviny a enzýmy, má za následok ich inaktiváciu a narušenie bunkových funkcií 31. Principiálne je peroxid vodíka účinnejší voči baktériám, pretože na likvidáciu kvasiniek a vláknitých húb sú potrebné vyššie koncentrácie účinnej látky. Poškodzuje predovšetkým vegetatívne bunky. Eliminácia spór sa zvyšuje spravidla zahriatím nad 50 C a v prítomnosti kovov. Obranný mechanizmus mikroorganizmov pozostáva v prvom rade z akumulácie enzýmov produkovaných za účelom odbúrania toxických radikálových derivátov a v druhom rade z aktivácie intracelulárnych systémov zabezpečujúcich rekonštrukciu poškodenej DNA (exonukleáza III a endonukleáza IV u E. coli) 32. Nedávne štúdie preukázali možnosť inhibície patogénov prostredníctvom baktérií produkujúcich H 2 O 2. V genóme mnohých zástupcov skupiny orálnych streptokokov sa nachádza sekvencia kódujúca enzymatickú výbavu pre tvorbu tejto látky, čo ich stavia do antagonistickej pozície voči nežiaducej mikrobiote 33. Streptococcus sanguinis a S. gordonii výrazne spomaľujú rozvoj rodovo príbuzného organizmu S. mutans v dôsledku produkcie H 2 O 2 (cit. 34 ). Antagonistický vplyv S. sanguinis sa potvrdil aj voči Staphylococcus aureus v slinách novorodencov 35. Významný je antimikrobiálny efekt peroxidu vodíka, ktorý produkujú niektoré izoláty laktobacilov z urogenitálneho traktu zdravých žien, voči zástupcom Staphylococcus aureus 36. Izoláciou laktobacilov z gastrointestinálneho traktu mladých ošípaných sa získal súbor kmeňov (Lb. reuteri, Lb. crispatus, Lb. amylovorus), u ktorých bola v polovici prípadov zaznamenaná metabolická aktivita s produkciou peroxidových radikálov inhibujúcich vybrané kmeňe Bacillus cereus, E. coli a S. aureus bežne prítomné v bravčovom mäse 37. Vďaka prídavku rôznych kmeňov rodu Lactobacillus produkujúcich H 2 O 2 na úrovni 1 2 mmol l 1 bol inhibovaný aj S. aureus v surovom kravskom mlieku a výrobkoch z neho Diacetyl Diacetyl (2,3-butándión) je známy predovšetkým pre svoje arómotvorné vlastnosti, avšak už v roku 1927 bol pozorovaný aj jeho antimikrobiálny efekt 2. Vzniká enzymaticky riadenou oxidatívnou dekarboxyláciou acetolaktátu, ktorý je medziproduktom metabolizmu pyruvátu u niektorých druhov baktérií mliečneho kysnutia 26. Prítomnosť génu CitP-M zodpovedného za 181

4 transport a konverziu citrátu je často kmeňovo závislá 38 a bola zaznamenaná napríklad u Lactococcus lactis ssp. lactis biovar diacetylactis, Lactobacillus acidophilus, Lb. alimentarius, Lb. delbrueckii, Lb. farciminis, Lb. helveticus, Lb. plantarum, Leuconostoc lactis, L. mesenteroides ssp. cremoris, Pediococcus acidilactici 18,39. Okrem pozitívneho vplyvu na organoleptické vlastnosti má tiež antimikrobiálny účinok voči vláknitým hubám a gramnegatívnym baktériám. Grampozitívne baktérie sú voči jeho pôsobeniu odolnejšie. Tento fakt sa spája s nižším obsahom periplazmových proteínov v priestore medzi bunkovou stenou a cytoplazmovou membránou, ale tiež so širším fondom dostupných aminokyselín 40. Diacetyl totiž špecificky reaguje s arginínom v štruktúre proteínov, pričom vznik komplexu diacetyl-arginín vedie k obmedzeniu katalytickej funkcie enzýmov a k imunologickej odpovedi na modifikovaný proteín 2,7. Inhibičný efekt diacetylu sa spája tiež s jeho schopnosťou depolarizovať membránové štruktúry a inhibovať tak transport iónov 41. Pomocou kultúry Pediococcus acidilactici produkujúcej diacetyl možno kontrolovať rozvoj nežiaducich patogénov E. coli O157:H7 a Salmonella spp. vo fermentovaných mäsových výrobkoch 42. Účinný je aj voči ďalším mikroorganizmom, ktoré spôsobujú znehodnocovanie potravín, vrátane Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolitica a zástupcov z rodov Bacillus a Pseudomonas 40. Pri štúdiu antimikrobiálnej aktivity Lb. paracasei DGCC 2132 voči Penicillium spp. bolo po odstránení prchavých zlúčenín z kultivačného média pozorované zníženie inhibičného účinku 43. Výsledky dokumentujú značný príspevok diacetylu na antifungálnom efekte Lb. paracasei a naznačujú, že význam prchavých zlúčenín v antimikrobiálnom pôsobení baktérií mliečneho kysnutia je potrebné ďalej skúmať. Vo fermentovaných mliečnych výrobkoch je koncentrácia diacetylu zvyčajne nízka (do 10 mg kg 1 ). Toto množstvo je však postačujúce pre dosiahnutie charakteristickej senzorickej kvality a pri synergickom pôsobení zvyšuje antimikrobiálny účinok ďalších faktorov prostredia (organické kyseliny, peroxid vodíka, bakteriocíny, dostupnosť nutrientov) 7, Reuterín Reuterín (3-hydroxypropanal) je nízkomolekulová antimikrobiálna látka, ktorá sa v aktívnej forme vyskytuje ako zmes monoméru, hydratovaného monoméru a cyklického diméru 1. Vzniká v prvom kroku degradácie glycerolu, počas ktorého dochádza k dehydratácii substrátu pomocou glyceroldehydratázy. Druhým krokom je redukcia reuterínu na 1,3-propándiol za súčasnej regenerácie NAD z NADH riadená 1,3-propándiol-oxidoreduktázou. Pri procese glykolýzy bunka spotrebuje NADH, preto je počas exponenciálnej fázy rovnováha reakcie naklonená na stranu 1,3-propándiolu a reuterín sa akumuluje v médiu až počas stacionárnej fázy 44. Schopnosť tvorby reuterínu je kódovaná génom pduc, ktorý je zodpovedný za produkciu glyceroldehydratázy. Zámernou mutáciou tohto génu sa potvrdilo, že jeho expresia je pre tvorbu reuterínu kľúčová. Disrupcia génu dhat zodpovedného za produkciu 1,3-propándioloxidoreduktázy naopak vedie k dvoj- až osemnásobnému zvýšeniu koncentrácie tejto antimikrobiálnej látky v neskoršej stacionárnej fáze s výsledným množstvom 0,25 2 mol l 1 reuterínu 45. Enzýmová výbava pre produkciu reuterínu bola prvýkrát popísaná u baktérie Lactobacillus reuteri, jej nositeľmi sú však aj ďalší zástupcovia z rodu Lactobacillus (Lb. buchneri, Lb. brevis, Lb. collinoides, Lb. coryniformis) 1,2. Mechanizmus mikrobicídnej aktivity reuterínu spočíva vo vysokej reaktivite prítomnej aldehydickej skupiny voči tiolom a primárnym amínom. Z toho vyplýva jeho schopnosť inaktivovať proteíny a ďalšie molekuly s obsahom týchto skupín 45. V cyklickej forme blokuje aktívne centrum ribonukleotidreduktázy, čím priamo ovplyvňuje syntézu DNA 2. Pôsobí mikrobicídne voči grampozitívnym a gramnegatívnym baktériám, kvasinkám a vláknitým hubám, vrátane potravinových patogénov Salmonella, Shigella, Clostridium, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Listeria, Candida, Aspergillus a Fusarium 46. Prídavok reuterínu bol spolu s ďalšími faktormi prostredia využitý na inhibíciu L. monocytogenes, S. enterica subsp. enterica biovar Enteritidis a E. coli vo varenej šunke Bakteriocíny Konzervačný efekt baktérií mliečneho kysnutia môže spočívať v schopnosti produkovať bakteriocíny a bakteriocínom podobné látky 46, ktorých inhibičný účinok sa prejavuje najčastejšie voči príbuzným druhom baktérií. Nedávne výskumy však naznačujú, že vybrané bakteriocíny možno aplikovať aj pri biokontrole mikrobiálneho rastu 48. Na základe štruktúry a mechanizmu účinku sa bakteriocíny rozdeľujú na nasledujúce skupiny: TRIEDA I zahŕňa tzv. lantibiotiká. Sú to peptidové reťazce, u ktorých dochádza k posttranslačným úpravám začleňovaním dehydrovaných alebo tioéterových aminokyselín do štruktúry peptidu. Na rozdiel od antibiotík, ktoré sú syntetizované pomocou enzýmov, lantibiotiká sú syntetizované na ribozómoch. Enzymaticky sú riadené až následné posttranskripčné inzercie 49. Podľa typu základného peptidového reťazca sú lantibiotiká podobné prevažne nizínu produkovanému kmeňmi Lactococcus lactis alebo mutacínu produkovanému kmeňmi Streptococcus mutans 50. Lantibiotiká interagujú s bunkovou stenou, resp. bunkovou membránou hostiteľského mikroorganizmu, pričom v nich vytvárajú mikropóry a spôsobujú tak únik iónov, ATP a ďalších esenciálnych látok 51,52. Baktericídna schopnosť lantibiotík sa tiež pripisuje špecifickej väzbe na lipid II, ktorý je prekurzorom peptidoglykánu. Dochádza k inhibícii syntézy peptidoglykánu nevyhnutného pre stavbu bunkovej steny 49. Nezanedbateľný antimikrobiálny efekt lantibiotík (bakteriocínov triedy I) sa potvrdil voči Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum, C. perfringens, Bacillus cereus 182

5 a ďalším 53. TRIEDA II zahŕňa tzv. non-lantibiotiká. Bakteriocíny tejto skupiny neobsahujú posttranslačne pripojené aminokyseliny, jedinou modifikáciou v ich štruktúre je vznik disulfidových väzieb. Účinok non-lantibiotík spočíva v schopnosti zvýšiť permeabilitu membrán a spôsobiť únik molekúl z bunky citlivého mikroorganizmu 54. Nonlantibiotiká sa delia na 3 podtriedy. Podtrieda IIa zahŕňa peptidy so špecifickou sekvenciou na N-konci (Tyr-Gly- Asn-Gly-Val-Xaa-Cys), ktoré pozostávajú z 37 až 48 aminokyselín. Sú termostabilné a vykazujú vysokú aktivitu voči baktériám z rodu Listeria. Do podtriedy IIb sú zaradené dvojzložkové komplexy, ktoré pozostávajú z dvoch vzájomne sa dopĺňajúcich peptidov. Oddelene vykazujú peptidy zvyčajne nízku baktericídnu schopnosť. Bakteriocíny kruhovej štruktúry, ktorých N-koniec a C-koniec sú spojené peptidovou väzbou, sa radia do podtriedy IIc 55,56. Bakteriocíny triedy II sú účinné voči širokému spektru patogénov, vrátane L. monocytogenes, meticilín-rezistentných kmeňov S. aureus, vankomycín-rezistentným enterokokom a Clostridium difficale 57,53. Dlhšie termolabilné polypeptidové reťazce proteínového charakteru (> 10 kda) sú zaradené do TRIEDY III. Bakteriocíny v tejto skupine fungujú ako peptidoglykánové hydrolázy, pričom degradujú bunkovú stenu baktérií (podtrieda IIIa) alebo rozvracajú membránový potenciál (podtrieda IIIb) a spôsobujú tak letálny únik ATP. Sú účinné napr. voči Staphylococcus aureus 54,55. V súčasnosti málo preskúmanú skupinu tvoria komplexné bakteriocíny, ktoré sa zaraďujú do TRIEDY IV a pozostávajú z peptidovej podjednotky v spojení s lipidovou alebo sacharidovou podjednotkou 48. Efektivita bakteriocínov je predmetom mnohých štúdií s cieľom aplikovať tento spôsob biokonzervácie pri výrobe potravín. Zo 115 kmeňov baktérií mliečneho kysnutia izolovaných z fermentovaných mäsových výrobkov vykazovali inhibičný účinok voči Listeria monocytogenes a L. ivanovii najčastejšie zástupcovia rodov Lactobacillus a Enterococcus 58. U pozorovaných kmeňov bola potvrdená prítomnosť génov pre produkciu bakteriocínov. Bakteriocín produkovaný kmeňmi poddruhu Lc. lactis ssp. cremoris, ktoré boli izolované zo syra Piedmont, boli účinné aj pri inhibícii S. aureus 56. Pri fermentácii kakaových bôbov bol zistený antifungálny efekt pediokokov a laktobacilov na rast mikromycét z rodu Aspergillus a produkciu ochratoxínu A, ktorý sa pripisuje pôsobeniu bakteriocínov Záver Baktérie mliečneho kysnutia vykazujú pri svojom raste vo fermentovaných potravinových matriciach vysokú metabolickú aktivitu sprevádzanú produkciou širokého spektra antimikrobiálne pôsobiacich látok. Najsilnejší mikrobicídny a mikrobistatický účinok je pripisovaný organickým kyselinám, avšak aj ďalšie metabolity, ako oxid uhličitý, etanol, peroxid vodíka, diacetyl, reuterín, bakteriocíny a i. majú významný potenciál pre využitie v biokonzervácii potravín. Aplikácia štartovacích kultúr, ktoré sú schopné v dostatočnom množstve tvoriť účinné antimikrobiálne metabolity, môže byť vhodnou alternatívou k používaniu chemických konzervačných látok. Týmto spôsobom je možné uspokojiť nároky trhu na zdravé a hygienicky bezchybné potraviny. LITERATÚRA 1. Lahtinen S., Salminen S., Von Wright A., Ouwehand A. C.: Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functional Aspects. CRC Press, Boca Raton Hui Y. H., Evranuz E. Ö., Chandan R. C.: Handbook of Animal-Based Fermented Food and Beverage Technology. CRC Press, Boca Raton Theron M. M., Lues J. F. R.: Organic Acids and Food Preservation. CRC Press, Boca Raton Fernandes A. R., Mira N. P., Vargas R. C.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 337, 95 (2005). 5. Gravesen A., Diao Z., Voss J.: Appl. Microbiol. 39, 528 (2004). 6. Gauthier R.: I Forum Internacional de aviculture 148, 148 (2005). 7. Russel N. J., Gould G. W.: Food Preservatives. Springer, New York Breidt F., Hayes J. S., McFeeters R. F.: J. Food Protect. 67, 12 (2004). 9. Price-Carter M., Fazzio T. G., Vallbona E. I., Roth J. R.: J. Bacteriol. 187, 3088 (2005). 10. Piper P., Calderon C. O., Hatzixanthis K., Mollapour M.: Microbiol. 147, 2635 (2001). 11. Medveďová A., Valík Ľ., Liptáková D.: J. Food. Nutr. Res. 50, 4, 193 (2011). 12. Geremew T., Kebede A., Andualem B.: J. Food Sci. Technol. 52, 1 (2015). 13. Vázquez J. A., González M. P., Murado M. A.: Aquaculture 245, 149 (2005). 14. Filya I., Sucu E.: Grass Forage Sci. 65, 446 (2010). 15. Falkinham J. O.: Environ. Microbiol. Rep. 1, 6, 477 (2009). 16. Schulz A., Vogt C., Richnow H. H.: Environ. Pollut. 169, 27 (2012). 17. Erkmen O., Bozoglu T. F.: Food Microbiology 3: Food Preservation. Ilke Publishing Company, Ankara Friberg S., Hui Y. H. Handbook of Food and Beverage Fermentation Technology. CRC Press, Boca Raton Singh P., Wani A. A., Karim A. A., Langowski H. C.: Int. J. Dairy Technol. 65, 161 (2012). 20. Hasapidou A., Savvaidis I. N.: Food Res. Int. 44, 2751 (2011). 21. Amanatidou A., Smid E. J., Gorris L. G. M.: J. Appl. Microbiol. 86, 429 (1999). 22. Ascenzi J. M., Favero M. S.: Disinfectans and Aseptics, Model of Action, Mechanism of Resistance, and Testing, v knihe Antibiotics In Laboratory Medicine (Lorian V., ed.) Lippincott Williams and Wilkins, 183

6 Philadelphia Cohen G. N.: Microbial Biochemistry. Springer, New York Stoker H. S.: General, Organic and Biological Chemistry. Cengage Learning, Hampshire Pommerville J.: Alcamo's Fundamentals of Microbiology. Jones and Bartlett Learning, Burlington Kango N.: Textbook of Microbiology. I. K. International Pvt Ltd, New Delhi Barker C., Park S. F.: Appl. Environ. Microbiol. 67, 1594 (2001). 28. Suzuki K., Asano S., Iijima K., Kitamoto K.: J. Inst. Brew. 114, 209 (2008). 29. Hladíková Z., Smetanková J., Greifová M., Greif G.: Acta Chim. Slov. 5, 80 (2012). 30. Gropper S. S., Smith J. L., Groff J. L.: Advanced Nutrition and Human Metabolism. Cengage Learning, Hampshire Mason R. P., Walter M. F., Mason P. E.: Free Radical Biol. Med. 23, 419 (1997). 32. Asad N. R., Oliveira L. M. B., de Almeida C. E. B.: Gen. Mol. Biol. 27, 291 (2004). 33. Chen Y. S., Lin Y. L., Jan R. L.: Ped. Pulmonol. 45, 1111 (2010). 34. Kreth J., Merritt J., Shi W., Qu F.: J. Bacteriol. 187, 7193 (2005). 35. Uehara Y., Agematsu K., Kikuchi K.: J. Infect. Dis. 194, 98 (2006). 36. Ocaña V. S., Holgado A., Nader-Macías M. E.: FEMS Immunol. Med. Microbiol. 23, 87 (1999). 37. Hacin B., Rogelj I., Matijašić B. B.: Folia Microbiol. 53, 569 (2008). 38. Delbes-Paus C., Dorchies G., Chaabna Z.: Food Microbiol. 27, 924 (2010). 39. Tamime A. Y.: Probiotic Dairy Products. Wiley- Blackwell, Hoboken Smith J.: Technology of Reduced Additive Foods. Wiley-Blackwell, Hoboken Pyar H., Peh K. K., Liong M. T.: J. Pharm. Toxicol. 6, 533 (2011). 42. Kang D. H., Fung D. Y. C.: Lett. Appl. Microbiol. 29, 206 (1999). 43. Aunsbjerg S. D., Honoré A. H., Marcussen J.: Int. J. Food Microbiol. 194, 43 (2015). 44. Vaidyanathan H., Kandasamy V., Ramakrishnan G. G.: AMB Express 1, 37, 1 (2011). 45. Schaefer L., Auchtung T. A., Hermans K. E.: Microbiol. 156, 1589 (2010). 46. Drosinos E. H., Mataragas M., Metaxopoulos J.: Biopreservation: A New Direction Towards Food Safety. v knihe New Developments in Food Policy, Control And Research (Riley A. P., ed.). Nova Publishers, Hauppauge Montiel R., Martín-Cabrejas I., Medina M.: Food Control. 51, 122 (2015). 48. Favaro L., Barretto Penna A. L., Todorov S. D.: Trends Food Sci. Technol. 41, 37 (2015). 49. Smith L., Hillman J. D.: Curr. Opin. Microbiol. 11, 401 (2008). 50. Smith L., Novák J., Rocca J.: Eur. J. Biochem. 267, 6810 (2000). 51. Oman T. J., Van der Donk W. A.: ACS Chem. Biol. 4, 865 (2009). 52. Paiva A. D., Breukink E., Mantovani H. C.: Antimicrob. Agents Chemother. 55, 5284 (2011). 53. Collins B., Cotter P. D., Hill C., Ross R. P.: Application of Lactic Acid Bacteria-Produced Bacteriocins, v knihe Biotechnology of Lactic Acid Bacteria: Novel Applications (Mozzi F., Raya R., Vignolo G. M., ed.). J. Wiley, Hoboken Eijsink V. G. H., Axelsson L., Diep D. B.: AVL Int. J. Gen. Mol. Microbiology 81, 639 (2002). 55. Shpakov A. O.: Microbiol. 78, 255 (2009). 56. Stoyanova L. G., Ustyugova E. A., Netrusov A. I.: Appl. Biochem. Microbiol. 48, 229 (2012). 57. Cotter P. D., Hill C., Ross R. P.: Curr. Protein Pept. Sci. 6, 61 (2005). 58. Fontana C., Cocconcelli P. S., Vignolo G., Saavedra L.: Food Control. 47, 53 (2015). 59. Essia N. J. J., Yadang G., Sado Kamdem S. L.: Biocontrol. Sci. Technol. 25, 245 (2015). T. Mančušková, A. Medveďová, and Ľ. Valík (Department of Nutrition and Food Assessment, Faculty of Chemical and Food Technology, Slovak University of Technology in Bratislava): Production of Antimicrobial Substances by Lactic Acid Bacteria The current tendency to limit the use of chemical preservatives in food and to extend the shelf lives of products leads to increasing use of natural antimicrobials. Therefore, lactic acid bacteria and their metabolites are used in fermented products. Organic acids, carbon dioxide, ethanol, hydrogen peroxide, diacetyl, reuterin, bacteriocins and other substances produced by lactic acid bacteria exhibit good activity in inhibition of undesirable microbiota. 184