SLOVENSKÁ TECHNICKÁ UNIVERZITA V BRATISLAVE

Transcription

1 SLOVENSKÁ TECHNICKÁ UNIVERZITA V BRATISLAVE Fakulta chemickej a potravinárskej technológie Ústav biochémie, výživy a ochrany zdravia Oddelenie biochémie a mikrobiológie Biochemické a genetické aspekty klíčenia konídií Trichoderma atroviride DIPLOMOVÁ PRÁCA Vypracovala: Bc. Peter Žemla Vedúci DP: prof. RNDr. Ľudovít Varečka, DrSc. Evidenčné číslo: FCHPT Študijný odbor: biotechnológie Študijný program: biotechnológia Oponent DP:. BRATISLAVA 2011

2 Ďakujem všetkým, ktorý mi pomohli pri realizácii diplomovej práce, predovšetkým prof. RNDr. Ľudovítovi Varečkovi, DrSc., Ing. Martinovi Šimkovičovi, Phd. a Ing. Petre Olejníkovej, Phd. za odbornú pomoc a konzultácie. Rovnako by som chcel poďakovať aj rodičom a priateľke za podporu.

3 Súhrn Cieľom tejto práce bolo charakterizovať procesy prebiehajúce počas klíčenia konídií Trichoderma atroviride prostredníctvom merania enzýmových aktivít niektorých metabolických dráh a markerových enzýmov niektorých organel. Taktiež boli uskutočnené transportné experimenty rádioaktívne značených prekurzorov a pokus o prípravu (subtraktívnej) knižnice cdna génov aktivovaných počas klíčenia. Boli merané aktivity laktátdehydrogenázy, α-d-manozidázy, citrátsyntázy, izocitrátdehydrogenázy, glutamátdehydrogenázy, izocitrátlyázy, GDPázy Golgiho aparátu a H + ATPázy počas klíčenia v extrakte homogenátu konídií naklíčených v rastovom médiu počas prvých dvanástich hodín pomocou spektrofotometrických techník. Dôležitým zistením bolo, že aktivity väčšiny sledovaných enzýmov boli merateľné aj v nenaklíčených konídiách. Kým aktivita izocitrátlyázy vzrástla už po troch hodinách klíčenia, aktivity LDH, α-dmanozidázy, citrátsyntázy a izocitrátdehydrogenázy začali výraznejšie rásť až po 6 hodine a rovnako tiež v tomto čase bolo možné zaznamenať prítomnosť GDPázy Golgiho aparátu a H + ATPázy, ktoré dovtedy mali nemerateľnú aktivitu. Na rozdiel od predchádzajúcich enzýmov, aktivita glutamátdehydrogenázy vykazovala pomerne vysoký rast už v počiatočných fázach klíčenia a dosiahla aj oveľa vyššie hodnoty ako aktivity pri všetkých ostatných enzýmoch. Aktivita niektorých enzýmov (laktátdehydrogenázy, α-d-manozidázy) bola meraná počas dozrievania konídií. Ukázalo sa, že aktivita LDH počas dozrievania konídií klesala a v 8 týždni dosiahla minimálnu hodnotu. Oproti tomu aktivita α-d-manozidázy klesla len mierne a aj na konci sledovaného obdobia dosahovala pomerne vysoké hodnoty. Bol meraný transport 14 C-uracilu do konídií počas klíčenia v rozmedzí 0 až 48 hodín. Transport uracilu sa výrazne aktivoval po 13 hodinách a bol inhibovaný odpojovačmi až do 80%, pričom stupeň inhibície rástol s aktiváciou transportu. Bol meraný transport 14 C-N-acetylglukózamínu v rovnakom časovom rozsahu ako aj transport uracilu. Transport NAG sa výraznejšie aktivoval po 10 hodinách klíčenia a bol inhibovaný odpojovačmi až do 90%, pričom stupeň inhibície výrazne rástol s aktiváciou transportu. Bol meraný transport 14 C-cholínu v časovom rozsahu 0-30 hodín. K jeho aktivácii došlo po 11 hodinách klíčenia. Inhibícia odpojovačmi dosiahla úroveň 85%, pričom stupeň inhibície výrazne rástol s aktiváciou transportu.

4 Nárast aktivácie transportu týchto metabolitov koreloval s nárastom aktivity H+- ATPázy, ku ktorej došlo po približne ôsmich hodinách klíčenia. To naznačuje úlohu tohto enzýmu pri aktivácii transportu prostredníctvom vytvorenia elektrochemického potenciálu protónov na cytoplazmovej membráne a vysvetľuje účinok odpojovača. Pokus o vytvorenie subtraktívnej knižnice a identifikáciu génov nebol úspešný, z dôvodu kontaminácie mrna s DNA, ktorú sa nám nepodarilo odstrániť. atroviride Kľúčové slová: enzýmová aktivita, transport prekurzorov, klíčenie, Trichoderma

5 Abstract The main purpose of this diploma thesis was characterizing biochemical processes of germination of conidia of Trichoderma atroviride by measuring enzyme activities of important metabolic pathways and marker enzymes of some organelles. Transport experiments of radio-labeled precursors were also carried out as well as an attempt to prepare (subtractive) cdna library of genes activated during germination. Activities of lactate dehydrogenase, α-d-mannosidases, citrate synthase, izocitrate dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, izocitrate lyase, GDPase of Golgi apparatus, and H + ATPase were measured in the extracts from homogenates of germinated conidia in the growth medium during the first twelve hours of germination. Spectrophotometric techniques were used. An important finding was that the majority of the enzyme activities were measured in also in non-germinated conidia. While the activity of izocitrate lyase increased after three hours of germination, the activities of LDH, α-d-mannosidases, citrate synthase, izocitrate dehydrogenase started to grow significantly after 6 hours of germination. Equally, the presence of GDPase and H + ATPase were detected at this time. The activity of glutamate dehydrogenase, however, showed a relatively high growth in the early stages of germination and also reached much higher levels of activity than all other enzymes. Transport of 14 C-uracil into germinating conidia was measured in the range of 0 to 48 hours. It was significantly activated after 13 hours and was inhibited by uncouplers up to 80%, while the degree of inhibition increased with the time of germination. Transport of 14 C-N-acetyl glucosamine was measured within the same time scale as that of uracil. It was significantly activated after 10 hours of germination and was inhibited by uncouplers up to 90%, and the degree of inhibition increased significantly with the time of germination. Transport of 14 C-choline into germinating conidia was measured in the time range of 0-30 hours. Its activation occurred after 11 hours of germination. Its inhibition by uncouplers attained 85%. Also this transport was inhibited by uncouplers more profoundly upon increasing the time of germination. The increase in the activation of the transport of these metabolites correlated with the increase in the activity of H + ATPase, which occurred after about eight hours of germination. This suggests a role of this enzyme in the activation of transport by creating an electrochemical potential of protons on the cytoplasmic membrane and explains the effect of uncouplers.

6 Attempt to construct the subtractive cdna libraries, which could enable the identification of genes activated during conidiation was not successful, due to contamination of mrna with DNA, which we failed to eliminate. Key words: acitivity of enzymes, transport of precursors, germination, Trichoderma atroviride

7 Obsah 1.ÚVOD PREHĽAD LITERATÚRY Charakteristika vláknitých húb Všeobecná charakteristika Morfológia vláknitých húb Rozmnožovanie vláknitých húb Podmienky rastu a nutričné nároky Klíčenie konídií Metabolizmus D-manitolu a trehalózy v počiatočnej fáze klíčenia Proteosyntéza a syntéza RNA počas klíčenia Vývoj respiračného systému Úloha CDK, ras/mapk signálnych dráh Morfologické zmeny Autoinhibícia klíčenia Huby Deuteromycetes Tvorba konídií u Deuteromycét Rod Trichoderma Všeobecná charakteristika Morfologické znaky Využitie Trichoderma Konidiácia Trichoderma Fotoindukcia konidiácie a účinok ph Úloha uhlíka v tvorbe konídií Úloha dusíka v tvorbe konídií Indukcia tvorby konídií poškodením mycélia Indukcia tvorby konídií prchavými látkami Podmienky rastu Druh Trichoderma atroviride CIEĽ PRÁCE MATERIÁLY A METÓDY Chemikálie a látky použité pri práci Prístroje použité pri práci Udržiavanie mikroskopických kultúr Kultivácia T. atroviride Zozbieranie konídií z raže Kultivácia T. atroviride v CzD médiu Spracovanie vzoriek po ukončení kultivácie Homogenizácia naklíčených konídií Stanovenie množstva bielkovín Stanovenie aktivity laktátdehydrogenázy (LDH) Príprava roztokov a meranie aktivity LDH Stanovenie aktivity α-d-manozidázy Príprava roztokov a meranie aktivity α-d-manozidázy Stanovenie množstva fosforečnanov Príprava farebného indikátora a meranie kalibračnej krivky fosforečnanov Stanovenie aktivity GDPázy a cytoplazmatickej H + -ATPázy Príprava roztokov na meranie... 31

8 4.9.2 Meranie aktivity GDPázy/ cytoplazmatickej H + -ATPázy Stanovenie aktivity dehydrogenázy izocitranu Príprava roztokov a meranie aktivity enzýmu Stanovenie aktivity dehydrogenázy α-ketoglutaranu Príprava roztokov a meranie aktivity enzýmu Stanovenie aktivity dehydrogenázy pyrohroznanu Príprava roztokov a meranie aktivity enzýmu Stanovenie aktivity citrátsyntázy Príprava roztokov a meranie aktivity enzýmu Stanovenie aktivity izocitrátlyázy Príprava roztokov a meranie enzýmovej aktivity Stanovenie aktivity glutamátdehydrogenázy Príprava roztokov a meranie enzýmovej aktivity Postup merania transportu cholínu, NAG a URA Príprava konídií na transportný experiment Meranie transportu látok Meranie tvorby biomasy počas klíčenia konídií Vplyv vybraných látok na transport Meranie enzýmových aktivít počas dozrievania konídií Príprava konídií na enzýmové merania Vymytie a homogenizácia Stanovenie enzýmových aktivít a množstva bielkovín VÝSLEDKY Morfologické zmeny konídií počas submerznej kultivácie Enzýmové aktivity v klíčiacich konídiách Aktivita LDH Aktivita α-d manozidázy Aktivita GDPázy Aktivita plazmatickej H + -ATPázy Aktivita citrátsyntázy Aktivita izocitrátdehydrogenázy Aktivita glutamátdehydrogenázy Aktivita izocitrátlyázy Aktivita α-ketoglutarátdehydrogenázy Aktivita pyruvátdehydrogenázy Množstvo bielkovín uvoľnených pomocou homogenizácie z klíčiacich konídií Transport vybraných látok cez membránu počas klíčenia konídií Transport cholínu Vplyv inhibítorov TCS a CCCP na transport Rast biomasy v priebehu kultivácie Transport uracilu Vplyv odpojovačov na transport uracilu Rast biomasy Transport N-acetylglukozamínu (NAG) Vplyv inhibítorov na transport Rast biomasy Identifikácia primárne sa exprimujúcich génov počas prvých fáz klíčenia Aktivita markerových enzýmov v dozrievajúcich konídiách Aktivita LDH Enzýmová aktivita plazmatickej H+ ATPázy... 61

9 5.4.3 Enzýmová aktivita GDPázy Enzýmová aktivita α-d manozidázy Množstvo bielkovín extrahovateľných po homogenizácii z dozrievajúcich konídií DISKUSIA ZÁVER POUŽITÁ LITERATÚRA... 70

10 1.ÚVOD Trichoderma patrí medzi mikroskopické huby s dobre poznaným anamorfným štádiom. Je často prítomná v pôdnom prostredí, nutrične nenáročná, metabolicky prispôsobivá a môže utilizovať široké spektrum substrátov. Ako zdroj uhlíka využíva sacharidy - od monosacharidov až po polysacharidy. Trichoderma je zastúpená v chladných aj v teplých klimatických podmienkach. Uprednostňuje kyslejšie prostredie. Trichoderma je charakterizovaná rýchlym rastom. Vytvára biele kompaktné kolónie s hladkým povrchom. Povrch kolónií sa môže v raných kultivačných štádiách sfarbovať do žlta od produkovaného pigmentu, staršie kolónie majú zafarbenie zelené od spór (konídií), ktoré husto pokrývajú ich povrch. V tejto práci som sa zameral na štádium klíčenia a dozrievania konídií. Klíčenie konídií je často sledovaným javom u vláknitých húb. V súčasnosti sú známe podmienky, morfologické zmeny a vývoj biochemických procesov počas klíčenia viacerých vláknitých húb. Celkový priebeh klíčenia konídií T.atroviride však až tak dobre známy zatiaľ nie je a údaje z literatúry sú rozptýlené do mnohých druhov húb. Jednou z možností, ako popísať priebeh klíčenia konídií je meraním aktivity rôznych enzýmov. Aktivita enzýmov je pomerne ľahko sledovateľným parametrom a venoval som sa jej už aj počas bakalárskeho štúdia. Môže nám poskytnúť značné množstvo informácií o priebehu klíčenia, vývoji organel, príjmu látok z prostredia a aktivácii metabolických dráh. Z týchto informácií môžeme následne získať ucelený pohľad na to, čo sa počas klíčenia konídií T.atroviride deje, a teda aj na celkový vývoj huby. Transport látok je taktiež dôležitou súčasťou živých organizmov a možno predvídať jeho úlohu počas určitej fázy klíčenia, a teda aj meraním transportu môžeme získať informácie o počiatočnom vývoji vláknitých húb. Hlavnú úlohu pri ňom zohrávajú membrány- selektívne bariéry oddeľujúce bunku od okolia. Transport látok môže prebiehať rôznymi procesmi. K najdôležitejším u vláknitých húb patria protónové pumpy napr. H + ATPázy, ktoré často vytvárajú hnaciu silu (elektrochemický potencál H + ) prostredníctvom ktorých bunky transportujú väčšinu látok. Najdôležitejším javom klíčenia konídií je však rýchla expresia génov. Existuje predpoklad, že niektoré gény sa vyskytujú v konídiách už vo forme RNA, čo by významne uľahčilo a urýchlilo počiatočné procesy (napr. syntéza proteínov) v skorých fázach vývoja vláknitých húb. Identifikácia týchto génov by teda mohla odhaliť, ktoré proteíny sú tie 10

11 najdôležitejšie pre úplne prvé fázy klíčenia. Preto som sa vo svojej práci pokúsil aj o vytvorenie subtraktívnej knižnice, pomocou ktorej by bola táto identifikácia možná. 11

12 2. PREHĽAD LITERATÚRY 2.1 Charakteristika vláknitých húb Všeobecná charakteristika Mikroorganizmy sa už dlho používajú na produkciu rôznych zlúčenín významných pre farmaceutický a potravinársky priemysel. Vďaka svojej schopnosti produkovať priemyselne aplikovateľné primárne a sekundárne metabolity ako sú peptidy, enzýmy, organické kyseliny a antibiotiká dokázali svoj význam pre priemysel aj vláknité huby (1). Huby patria medzi jedny z najrozšírenejších organizmov na Zemi. Sú prítomne prakticky všade, či už je to pôda, voda (slaná aj sladká) alebo vzduch. Dá sa teda povedať, že huby sú neoddeliteľnou súčasťou ľudského života. Na základe doterajších poznatkov sa predpokladá, že huby sú po hmyze druhou najpočetnejšou skupinou živých organizmov a doteraz z nich bola popísaná len malá časť. Odhaduje sa, že na Zemi je okolo jeden a pol milióna druhov húb. Väčšina z nich je však nenápadná vďaka svojej veľkosti a štruktúry, no napriek tomu majú zásadnú úlohu pri rozklade organickej hmoty a kolobehu živín. Niekoľko štúdií ukázalo, že vláknité huby môžu zohrávať významnú úlohu v recyklácii aromatických zlúčenín (napr. fenoly) v biosfére. Napríklad druhy ako Fusarium flocciferum a Aspergilus fumigatus majú význam vďaka svojmu potenciálu degradácie fenolov (2). Okrem toho vláknité huby majú mnohé ďalšie využitia. V biotechnológii sú používané ako továrne na produkciu chemických zlúčenín, liečivých látok a enzýmov (3). Amylázy a celulázy húb majú uplatnenie v drevárskom a papierenskom priemysle, no stále viac sú huby považované za zdroj prísad do jedál ako sú vitamíny alebo polynenasýtené mastné kyseliny (4) Morfológia vláknitých húb Huby sú eukaryotické jednobunkové (kvasinky) alebo mnohobunkové organizmy. Väčšina húb má telo vláknitej štruktúry a označujú sa ako vláknité alebo mycéliové huby (5). Mycélium sa skladá z mnohojadrovej masy cytoplazmy uzatvorenej v rozvetvenej sústave rúročiek viac menej jednotného priemeru obalených bunkovou stenou. Mycélium normálne vzniká klíčením jednej rozmnožovacej bunky-spóry. Z klíčiacej spóry vyrastie najskôr dlhé 12

13 vlákno (hýfa), ktoré sa ďalej opakovane rozvetvuje (apikálny rast). Mycélium vyšších húb má svoje vlákna pravidelne poprerušované priehradkami (septum) (6). Od rias a rastlín sa huby odlišujú neprítomnosťou plastidov, s čím súvisí aj absencia asimilačných pigmentov. Väčšina húb má vyvinutú bunkovú stenu, ktorá je prevažne zložená z chitínu (vysokomolekulová látka tvorená N-acetyl-glukozamínom), zriedkavejšie z celulózy, manánov (polysacharidy, polyméry manózy) alebo glukánov. Niekedy sú prítomné aj bielkoviny, lipidy, prípadne iné látky. Pod bunkovou stenou sa nachádza cytoplazmová membrána. V bunkách húb sa nachádzajú aj lyzozýmy, ktoré sa vyskytujú tiež u živočíchov a naopak u rastlín chýbajú (5) Rozmnožovanie vláknitých húb Vláknité huby sa rozmnožujú rozrastaním hýf a spórami. Spóry vznikajú buď vegetatívnym spôsobom (nepohlavné spóry) alebo v procese sexuálneho rozmnožovania (pohlavné-generatívne spóry). Podľa prítomnosti a typu pohlavného rozmnožovania huby taxonomicky zaraďujeme do oddelenia tzv. pravých húb Eumycota a nasledovne do nižších taxonomických jednotiek Zygomycotina, Ascomycotina, Basidiomycotina a Deuteromycotina. Pohlavné rozmnožovanie Sexuálna reprodukcia zvyčajne zahŕňa dva individuálne organizmy. Potomstvo, ktoré je produkované z tohto spojenia má zmiešané vlastnosti, polovicu od jedného rodiča a druhú polovicu od druhého rodiča. Sexuálna reprodukcia nie vždy zahŕňa mužského a ženského rodiča, aj keď tí môžu mať špecializované gaméty (reprodukčné bunky, ktorých jedinou úlohou je spojiť sa s inou gamétou počas reprodukcie). Množstvo organizmov je schopných sexuálnej aj asexuálnej reprodukcie ako napr. niektoré vláknité huby (napr. Rhizopus), ktoré produkujú spóry. Tiež môžu produkovať zygospóry umožňujúce sexuálnu reprodukciu Sexuálna reprodukcia má výhodu v poskytovaní množstva variácií medzi druhmi a pomáha im tak prežiť v prípade environmentálnych zmien. Hlavnou nevýhodou tohto procesu je, že si vyžaduje značné množstvo energie, čo znamená, že organizmy môžu produkovať iba malé populácie (7). 13

14 Nepohlavné rozmnožovanie Nepohlavné rozmnožovanie je forma reprodukcie, kedy bunka s jedným chromozómom produkuje od dvoch do štyroch buniek s rovnakým počtom chromozómov. Nepohlavné rozmnožovanie zahŕňa iba jedného rodiča predávajúceho genetickú informáciu svojmu potomstvu. Toto dedenie genetickej informácie spôsobuje identickosť rodiča so svojím potomstvom (7) Podmienky rastu a nutričné nároky Huby vo všeobecnosti vyžadujú mierne kyslé prostredie, majú relatívne jednoduché nutričné potreby a väčšina druhov je schopná rásť v aeróbnych podmienkach, ak majú k dispozícii zdroj uhlíka. Ako zdroj uhlíka huby využívajú organické látky, ktoré sú pre ne aj zdrojom energie, a preto patria huby medzi chemoheterotrofné mikroorganizmy (5). Samozrejme okrem uhlíka potrebujú pre svoj rast aj iné zlúčeniny. Huby nedokážu viazať dusík, a preto musia byť zásobené zlúčeninami, ktoré ho obsahujú či už v organickej alebo anorganickej forme. Ďalšími dôležitými zlúčeninami sú síra a fosfor, pričom fosfor využívajú ako esenciálnu zložku biosyntézy nukleových kyselín, fosfolipidov, ATP a glykofosfátov. Môžeme teda povedať, že prítomnosť fosforu je pre rast húb významná a spolu s dusíkom môže byť v prírode limitujúcim faktorom rastu húb. Hoci v menších koncentráciách, no s nie o moc menším významom je dôležitá pre rast húb aj prítomnosť makro- a mikroelementov. Makroelementy ako napr. draslík a horčík sú vyžadované v milimolárnych koncentráciách, zatiaľ čo koncentrácia mikroelementov (vápnik, železo, mangán a atď) sa pohybuje v mikromóloch. (8). Niektoré huby získavajú živiny zo živých buniek rastlín, živočíchov alebo iných húb. Nazývame ich parazitické. (9) Klíčenie konídií Konídie sú dôležitý nástroj dlhodobého prežitia produkované vo veľkých množstvách a predstavujú aj hlavný spôsob reprodukcie vláknitých húb. Štádium klíčenia konídií je kritickým obdobím bunkového cyklu a práve na túto časť bolo zameraných množstvo štúdií. Ich cieľom bolo popísať morfologické a biochemické procesy počas klíčenia. 14

15 Samotné klíčenie konídií môžeme rozdeliť do štyroch fáz a to narušenia dormantnosti konídií, fáza izotropného napučiavania, vytvorenie bunkovej polarity a tvorba klíčku (10). Klíčenie dormantných konídií nezačne bez vonkajších signálov. Konídie suspendované vo vode klíčiť nebudú, kvôli nedostatu živín, hoci ich viabilita sa nemusí meniť po dlhšiu dobu. (11). Na to, aby konídie začali klíčiť sú potrebné rôzne enviromentálne faktory, ktoré závisia od jednotlivých druhov VH. Napríklad konídie Fusarium culmorum pre klíčenie vyžadujú zdroj uhlíka a dusíka, zatiaľ čo konídie A.nidulans potrebujú glukózu. Avšak voda, kyslík či oxid uhličitý sú univerzálnymi nutričnými faktormi potrebnými pre klíčenie Metabolizmus D-manitolu a trehalózy v počiatočnej fáze klíčenia D-manitol je hlavná zlúčenina uhlíka v konídiách vláknitých húb, keď môže tvoriť až okolo 15% suchej hmotnosti. Aj preto mu bolo pripisovaných množstvo fyziologických funkcií, napr. osmolytu. D-manitol je rapídne spotrebovávaný v skorých fázach klíčenia, a to prostredníctvom D-manitol dehydrogenázy. Aktivita D-manitol dehydrogenázy počas klíčenia konídií klesá a jej syntéza zaznamenaná nebola čo naznačuje, že D-manitol je využívaný ako substrát pre endogénnu respiráciu. Toto tvrdenie podporuje aj spotreba D-manitolu, ktorá začína už po 15 minútach inkubácie, zatiaľ čo príjem glukózy bol spozorovaný neskôr. Predpokladá sa preto, že prvotné štádiá klíčenia sú podporované D-manitolom a až neskoršie sa využíva glukóza (12). Manitol však pravdepodobne neslúži len ako zásobný zdroj uhlíka, ale má funkciu aj antioxidantu a pôsobí aj ako inhibítor trehalázy. Trehaláza bola tiež nájdená v konídiách A.oryzae, jej celková aktivita rástla počas klíčenia konídií a jej hlavná úloha je hydrolýza trehalózy (13), čo však nastane až po poklese koncentrácie D-manitolu. Trehalóza je neredukujúci disacharid, ktorý je akumulovaný množstvom VH. V spórach húb môže trehalóza predstavovať podobne ako manitol pomerne veľké percento suchej hmotnosti. Systematická mobilizácia trehalózy počas klíčenia konídií poukazuje na to, že môže slúžiť ako zásoba uhľohydrátov (sacharidov) potrebných na nástup vývojových štádií. Spotreba trehalózy počas klíčenia konídií je sprevádzaná akumuláciou glycerolu. Ten nie je produkovaný prostredníctvom spotreby extracelulárneho zdroja uhlíka čo naznačuje, že glycerol by mohol vznikať na začiatku glykolýzy, z glukózy tvorenej z trehalózy(14). Tento fakt podporuje aj pozorovanie množstva glycerolu v konídiách. Obsah glycerolu po 18 hodine klesol zo 45 mg/g na 34 mg/g a v 24 hod to bolo 20 mg/g. Tieto dáta ukazujú, že 15

16 katabolizmus glycerolu sa objavuje o niečo neskôr ako katabolizmus trehalózy a podporuje sa tým fakt, že trehalóza je dôležitá pre prvé fázy klíčenia (15) Proteosyntéza a syntéza RNA počas klíčenia Klíčenie konídií sa nemôže uskutočniť bez schopnosti konídie tvoriť proteíny. Syntéza makromolekúl totiž začína už krátko po začatí inkubácie. Podľa štúdie I.Barasha a spol (16) bol čistý nárast proteínov počas prvej hodiny 47% a do štvrtej hodiny to bolo dokonca až 110%. Syntéza RNA, ktorá je priamo spojená s tvorbou proteínov však taká jednoznačná nie je. Niektoré práce sa dokonca rozchádzajú v tvrdeniach, či syntéza RNA počas prvotných fáz klíčenia prebieha alebo nie. Najčastejším tvrdením však je, že konídie obsahujú súbor mrna a ribozómov, primárne slúžiacich pre okamžitú aktiváciu a transláciu v prítomnosti výživných látok. Takáto mrna bola objavená napr. v konídiách A. nidulans avšak nebola identifikovaná (10). Toto tvrdenie podporuje aj objav Van Ettena, ktorý izoloval cytoplazmatické frakcie trna z nenaklíčených spór Rhizopus stolonifer a B. theobromae. Navyše, tieto typy trna interagovali so všetkými AK bežne prítomnými v proteínoch (17). Aj napriek týmto dôkazom ale nie je jasné, či je syntéza RNA v prvotných fázach klíčenia potrebná alebo nastáva až neskôr Vývoj respiračného systému Už skoršie práce sa zaoberali využívaním kyslíka klíčiacimi konídiami. Pri pozorovaní procesu respirácie počas klíčenia konídií Botrydiplodia Bramelom (18) sa zistilo, že konídie prijímajú kyslík už po 30 minutách inkubácie. Zaujímavosťou tohto zistenia však bolo, že kyselina δ-aminolevulová bola prvýkrát inkorporovaná do spór až 180 minút po začatí inkubácie a cytochrómy bolo možné prvý krát spektroskopicky merať dokonca až po 210 minútach, a teda nejde o proces sprostredkovaný pomocou mitochondrií. Z týchto výsledkov vznikol záver, že konídie Botryodiplodia musia obsahovať potenciálne funkčný respiračný systém, ktorý je aktivovaný cytoplazmatických ribozómami v skorších fázach klíčenia. Ukázalo sa tiež, že tento systém je citlivý na kyanid a cykloheximid a po 150 min inkubácie sa stáva citlivým aj na chloramfenikol. Zdá sa teda, že kompletné mitochondrie Botrydiplodia sa vytvárajú okolo 180 minúty inkubácie, čo naznačuje aj pozorovanie mitochondriálnej proteosyntézy ktoré ukázalo, že konidiálna mitochondria netvorí úplný komplement mitochondriálnych ribozomálnych 16

17 produktov, charakteristických pre fyziologicky zrelé bunky do 180 min klíčenia. Tiež sa odhaduje, že v tomto čase dochádza aj k replikácii mitochondriálnej DNA a syntéze mitochondriálnych ribozomálnych produktov, ktoré môžu byť nevyhnutné pre mitochondriálnu respiráciu. Nakoniec dochádza k tvorbe nového cytochrómového respiračného systému, ktorý je nástupcom toho predchádzajúceho, prítomného v dormantných konídiách Úloha CDK, ras/mapk signálnych dráh Signálne dráhy sprostredkované Ca 2+ iónmi zohrávajú dôležitú úlohu v morfogenéze a vývoji konídií. Ich účinok v skorších fázach klíčenia však závisí od jednotlivých druhov VH. Napr. delécia alebo inhibícia expresie CDK bunkový cyklus A. nidulans spomalí, avšak klíčenie konídií úplne inhibované nie je. Na druhej strane, klíčenie konídií Phyllosticta ampelicida je v prítomnosti špecifických inhibítorov iónových kanálov úplne zastavené. Úloha ras/mapk signálnych dráh v procese klíčenia, podobne ako pri CDK, nie je úplne jasná. Delécia génu smco7, ktorý je homológom ras, klíčenie konídií N. crassa neinhibuje, ale vážne poškodzuje rast hýf. Podobne je to aj s MAPK génom pmk1. Jeho delécia neinhibuje klíčenie konídií M. grisea, ale blokuje tvorbu apresória (11) Morfologické zmeny Počas klíčenia konídií dochádza k niektorým výrazným morfologickým zmenám. V prvotnej fáze ide o izotropný rast alebo pučanie konídií. Počas tohto izotropného rastu konídie zväčšujú svoj objem. Nejde však len o naberanie vody, ale tiež dochádza k zmenám v zložení bunky a k rastu bunkovej steny (19). Taktiež dochádza k nárastu adhezívnych vlastností pričom zvyčajne ide o dvojkrokový proces: iniciácia adhézie, ktorá je výsledkom existencie glykoproteínovej vrstvy a neskôr dochádza k pevnejšej adhézii, ktorá je výsledkom proteínovej syntézy a aktivácie metabolizmu (11). Po fáze izotropného rastu nastáva tzv. polarizovaný rast, ktorý je výsledkom polarizácie bunkovej steny zloženej z polysacharidov. Neskôr dochádza k tvorbe klíčka konídie a nakoniec k tvorbe mycélia (14). 17

18 Autoinhibícia klíčenia Veľmi významným fenoménom je autoinhibícia klíčenia. K autoinhibícii klíčenia dochádza vtedy, ak sa konidie vyskytujú vo veľmi hustej suspenzii. Za túto inhibíciu sú zodpovedné rôzne látky jako napr. 1-oktén-3-ol. Ide o prchavú zlúčeninu, ktorá bola meraná v hustej suspenzii konídií Penicillium paneum. Jej účinok bol však zmiernený nariedením tejto suspenzie. Taktiež sa zistilo, že 1-oktén-3-ol inhibuje myceliálny rast aj ďalších húb (20). 2.2 Huby Deuteromycetes Hlavná skupina húb, rozmnožujúca sa prevažne nepohlavným spôsobom (konídiami) sú Deuteromycéty. Ich pohlavné rozmnožovanie nie je úplne známe, alebo prebieha zriedkavo v určitých, často nedostatočne známych podmienkach (6) Tvorba konídií u Deuteromycét V staršej literatúre sa konídie označovali aj ako spóry. Aby sa zvýraznil ich nepohlavný vznik, v novšej literatúre sa používa prednostne pojem konídie. Deuteromycéty sa rozmnožujú teda prednostne nepohlavne exokonídiami, ktoré vznikajú dvoma spôsobmi: 1. talickým spôsobom ak konídia vzniká z časti už vytvorenej stielky (chlamydospóry, artrokonídie) 2. blastickým spôsobom ak konídia vzniká ako nový útvar (napr. fialokonídie, blastokonídie) Exokonídie môžu mať rôzny tvar, jednobunkové až dvojbunkové (mikrokonídie), viacbunkové (makrokonídie) a sú jednotlivé, v retiazkach alebo v guľovitých útvaroch. Ak sú hýfy, ktoré nesú konídie zreteľne odlišné od ostatných hýf, nazývajú sa konídiofory. Konídiofory môžu byť jednoduché, pravidelne alebo nepravidelne vetvené, alebo na konci zdurené do váčku. Konídie sa buď priamo tvoria na konídiofore alebo na osobitých bunkách fľaškového alebo ihlicovitého tvaru-sterigmách, ktoré vyrastajú z konídiofora (6). 18

19 2.3 Rod Trichoderma Všeobecná charakteristika Prvý opis huby Trichoderma sa datuje do roku Avšak rôzne druhy pridelené k rodom Trichoderma/Hypocrea bolo ťažké morfologicky rozoznať. Preto v niekoľkých prípadoch, obzvlášť v prvotných popisoch sa objavili nesprávne identifikácie určitých druhov keď napr. názov Trichoderma harzianum bol použitý pre odlišné druhy (21). Huby rodu Trichoderma sú kozmopolitné pôdne huby, pozoruhodné svojím rapídnym rastom, schopnosťou utilizovať rôzne substráty a rezistenciou na škodlivé chemikálie. Často sú prevládajúcou zložkou mykoflóry v rôznych pôdach napr. poľnohospodárskych, lesných a púštnych pôdach vo všetkých klimatických pásmach (22) Morfologické znaky Makroskopické znaky-trichoderma spp.: Patria medzi rýchlorastúce huby. Mladé mycélium má vločkovitý charakter a belasé sfarbenie. Zrelé mycélium je zelené, pričom tento vzhľad vytvárajú zelenosfarbené konídie. (23). Mikroskopické znaky: organizmus má prepážkovité sklovité hýfy, rozvetvené sklovité konídiofory, ktoré sú niekedy pozorovateľné ako pyramídové útvary, fialidy sú fľaškového tvaru, sklovité. Trichoderma patrí medzi Deuteromycéty a je typická tým, že vytvára iba jeden druh asexuálnych spór a síce konídie zelenej farby (23). Trichoderma viride a T. atroviride sú kmene charakteristické rýchlo tmavnúcimi konídiami. Guľovité konídie T. viride u niektorých kmeňon tohto druhu prechádzajú do elipsoidného tvaru. Podľa tvaru konídií sa rozlišujú dva typy T. viride. Prvý typ tvoria kmene pravej T.viride, anamorfy Hypocrea rufa spolu s kmeňmi T. atroviride a T. koningii s guľovitým tvarom konídií. Druhý typ reprezentujú kmene T. asperellum, ktoré majú skôr vajcovitý než guľovitý tvar. Konídie majú sliznatú stenu, preto zotrvávajú určitý čas na vrcholkoch fialíd v balíčkoch (19).. Teraz však už vieme, že niektoré druhy tvoria aj chlamydospóry, ako napr. T. virens, u ktorej sa nachádzajú v hojnom počte (24). 19

20 2.3.3 Využitie Trichoderma Súčasná literatúra vo všeobecnosti naznačuje, že huby rodu Trichoderma sú prevažne používane ako biofungicíd. Prvá správa o tom môže byť pripísaná Coleymu a Smithovi (25), ktorí ukázali, že dreň infikovaná Sclerotium delphinii bola kompletne nahradená hýfami a chlamydospórami T. hamatum na agarových platniach. Prospešný účinok rodu Trichoderma nie je limitovaný iba bojom s patogénmi. Ukázalo sa, že sú oportunistickými rastlinnými symbiontami, zvyšujúcimi aj systematickú rezistenciu rastlín (21). So svojou povesťou bezpečného producenta priemyselných enzýmov, Trichoderma bola značne aplikovaná na výrobu potravinárskych aditív a s tým súvisiacich produktov. V súčasnosti sú aplikované rôzne enzýmy Trichoderma na vylepšenie procesu varenia piva, ako aj maceračné enzýmy v produkcii ovocných džúsov a atď. (21). Môžeme teda povedať, že druhy rodu Trichoderma sú ekonomicky dôležité nielen kvôli vyššie uvedeným vlastnostiam, ale aj vďaka svojej schopnosti produkovať antibiotiká. Nie je však známe, či tieto vlastnosti majú iba niektoré druhy Trichoderma alebo ide o všeobecné atribúty viacerých, poprípade všetkých druhov (22) Konidiácia Trichoderma Tvorba konídií vláknitou hubou Trichoderma, ale tiež aj v mnohých ostatných hubách môže byť indukovaná rôznymi environmentálnymi faktormi. Pojem enviromentálne faktory predstavuje osvetlenie bielym alebo modrým svetlom, vplyv ph prostredia, vyčerpanie živín či poškodenie mycélia (26) Fotoindukcia konidiácie a účinok ph Jedným z rozhodujúcich faktorov pri tvorbe konídií je svetlo. Prvý opis vplyvu svetla na konidiáciu Trichoderma bol uvedený už v roku V tme Trichoderma rastie trvalo ako mycélium. Po krátkom osvetlení mycélia nastáva tvorba tmavozelených konídií, pričom charakteristickou črtou Trichoderma je tvorba sústredných konidiálnych kruhov, ako odpoveď na striedanie svetla a tmy. Prvotné reakcie indukované svetlom sú veľmi rýchle, nevyžadujú si prítomnosť molekulového kyslíka a sú závislé od teploty (26). Pri indukcii konidiácie svetlom zohráva úlohu aj ph okolitého prostredia. Fotokonidiácia u T. atroviride 20

21 v závislosti od ph prostredia má najväčšiu odozvu pri najnižšej hodnote ph a to od 2,8 po 3,2, zatiaľ čo s rastom ph výrazne klesala (28). Obr.1. Závislosť tvorby konídií od ph prostredia. Na obrázkoch je znázornená indukcia konidiácie dvoch kmeňov Trichoderma prostredníctvom zmeny ph prostredia.. Obidva kmene boli kultivované na PDA s rozdielnymi ph v rozsahu 2,8-5,2 (podľa 28) Úloha uhlíka v tvorbe konídií Prítomnosť uhlíka, dusíka ako aj pomer C:N v prostredí sú uvádzané ako jedny z hlavých nutričných faktorov, ovplyvňujúcich konidiáciu Trichoderma. Predpokladá sa, že zdroj uhlíka, resp. jeho nedostatok, je dôležitejším nutričným faktorom ovplyvňujúci konidiáciu ako dusík. Huby rodu Trichoderma však dokážu rásť a utilizovať 30 z 32 zdrojov uhlíka vrátane polysacharidov, aminokyselín a alkoholov (29), a preto rozsah a rýchlosť konidiácie závisí aj od toho, aký zdroja uhlíka je k dispozícii. Viaceré práce uvádzajú ako najlepší zdroj glukózu (30). Avšak absencia uhlíka na indukciu tvorby konídií nestačí. Ukázala sa spojitosť medzi vyčerpaním zdroja uhlíka a fotoindukciou. Indukcia konidiácie nedostatkom uhlíka bola totiž závislá aj na expresii génov blr-1 a blr-2, ktoré sú zodpovedné za fotoindukciu konidiácie čo jasne naznačuje prepojenie dráhy indukcie nedostatkom uhlíka s dráhou svetelnej indukcie (30). 21

22 Úloha dusíka v tvorbe konídií Funkcia dusíka ako ďalšieho nutričného faktora ovplyvňujúceho konidiáciu bola preukázaná niektorými štúdiami. Uvádza sa, že vyššie hodnoty dusíka v médiu spôsobujú zvýšenie rastu mycélia, zatiaľ čo limitovaný obsah dusíka zlepšuje tvorbu konídií (31). Ako primárne zdroje dusíka sa uvádzajú napr. močovina alebo glutamín a ako sekundárny zdroj sa používa napr. KNO 3 či NaNO 3. V priamom kontraste však pôsobí práca Steyertovej, ktorá pozorovala zlepšenie konidiačných vlastností pri zvýšení obsahu primárneho zdroja dusíka pri niektorých druhoch Trichoderma ako napr. T. asperellum, T. atroviride a T. pleuroticola (30). Preto nemôžeme jednoznačne povedať, či prítomnosť dusíka v médiu tvorbe konídií napomáha alebo nie. Hoci samotné zdroje týchto dvoch prvkov zohrávajú dôležitú úlohu pri tvorbe konídií, ich vzájomný pomer má taktiež nezanedbateľný vplyv na konidiáciu a rast Trichoderma. Ako uvádzajú Gao a Sun (31), tvorba konídií sa významne nemení pri raste pomeru z 10:1 na 80:1, avšak pri pomere 160:1 už je rýchlosť konidiácie dvakrát vyššia ako pri predchádzajúcich podmienkach Indukcia tvorby konídií poškodením mycélia Indukcia tvorby konídií poškodením mycélia bola prvýkrát demonštrovaná v práci Casas-Flores a spol.(32). V tejto práci boli použité mutanty T. atroviride, s odstránenými génmi, ktoré sú zodpovedné za fotoindukciu konidiácie. Autori poškodili mycélium takto upravených kmeňov jednoduchým narezaním pomocou skalpela a nechali kultivovať. Už po 24 hodinách bolo vidieť tvorbu normálnych konídií pozdĺž týchto rezov. Obr.2. Konidíácia T.atroviride spôsobená mechanickým poškodením mycélia. Prvý obrázok je divý kmeň T.atroviride. Ďalšie dva zobrazujú mutantné kmene s deléciou v génoch blr-1 a blr-2 (podľa 32). 22

23 Indukcia tvorby konídií prchavými látkami Svetlo, nutričné faktory či poškodenie mycélia sú hlavné faktory indukcie tvorby konídií. Avšak exitoval predpoklad, že by na tvorbu konidií rodom Trichoderma mohli mať vplyv aj produkty sekundárneho metabolizmu, keďže mnohé z nich zohrávajú dôležitú úlohu v signálnych dráhach. Preto bol uskutočnený pokus Nemčovičom a spol. (26) na zistenie vplyvu prchavých látok produkovaných pri tvorbe konídií kolóniami Trichoderma v susedstve nevysporulovanej kolónie. Ako sa ukázalo, tieto látky napomohli konidiácii, ale tá nikdy neprebiehala v tak veľkej miere ako pri indukcii svetlom, kedy konidiácia bola osemnásobne intenzívnejšia Podmienky rastu Rozvoj vláknitých húb býva v niektorých prípadoch pomerne náročný, keďže mnohé z nich rastú a sporulujú na rôznych syntetických médiách, ktorých zloženie zvyčajné závisí od druhu VH. Vláknité huby sú schopné utilizovať širokú škálu karbohydrátov a dusíkatých zlúčenín dôležitých pre ich rast. Avšak je to pomer týchto dvoch prvkov (C:N), čo ovplyvňuje rast a sporuláciu viac ako samotné zdroje uhlíka a dusíka. Gao a Sun (31) uvádzajú, že optimálny pomer C:N pre Trichoderma sa pohybuje v rozmedzí od 10:1 do 40:1 v prospech uhlíka. Na klíčenie konídií a rast huby majú vplyv aj ďalšie podmienky a nie len nutričné nároky. Jednou z nich je aj optimum teploty. Informácie o vplyve teploty na klíčenie konídií, rast mycélia (ale aj na konkurenčné saprofytické schopnosti a na produkciu prchavých a neprchavých látok druhmi Trichoderma) sú dostupné v niekoľkých štúdiách. V niektorých z nich sa uvádza, že Trichoderma, podobne ako aj mnoho ďalších mikrobiálnych rodov má optimálnu teplotu v rozmedzí od 25 až po 30 C. Pokiaľ sú však podmienky príliš chladné, rast Trichoderma bude pomalší a naopak, ak je teplota okolitého prostredia príliš vysoká, môže sa objaviť dokonca aj odumieranie (33). Existuje však niekoľko druhov (napr. T virose, T.harzianum a T. aureoviride), ktoré dobre rastú aj pri teplote 5 C. Najväčšia odolnosť voči chladu sa však ukázala pri druhu T. viride (34). Ďalším dôležitým faktorom, ovplyvňujúcim klíčenie a rast, je nízky stupeň osmotolerancie, a tak prítomnosť vody je jedným z limitujúcich faktorov ovplyvňujúcich aktivitu Trichoderma. Dokonca bola zistená lineárna závislosť medzi rýchlosťou rastu a 23

24 prítomnosťou vody, kedy sa v rozmedzí teploty od 10 do 25 C zrýchľovalo tempo rastu s rastúcim potenciálom vody (34). Ako posledným, no určite nie zanedbateľným faktorom je ph okolitého prostredia. Keďže druhy Trichoderma sa využívajú hlavne pre svoju schopnosť biokontroly, sú aplikované zväčša do pôd s rôznym ph. Preto bolo dôležité zozbierať informácie aj o vplyve ph na rast a aktivitu extracelulárnych enzýmov. Kultiváciami rôznych druhov Trichoderma v podmienkach s rozličným ph sa zistilo, že tieto druhy dobre rástli v kyslej oblasti ph a síce v rozmedzí od ph 2 až po ph 6, pričom optimálne ph pre rast sa pohybovalo okolo 4 (33) Druh Trichoderma atroviride Trichoderma atroviride nie je iba jeden z najviac používaných druhov proti rastlinným chorobám, ale tiež môže zrýchliť rast a výťažok poľnohospodárskych rastlín (35). Niekoľko druhov Trichoderma atroviride hrajú dôležitú úlohu pri rozklade organických materiálov prostredníctvom produkcie extracelulárnych enzýmov ako sú celulázy, β-glukozidázy, xylanázy a enzýmy zodpovedné za degradáciu bunkových stien húb, čo z nich robí vhodných kandidátov na účasť v programoch zaoberajúcich sa biopesticídmi (36). Hoci T. atroviride je známa ako antagonista proti niektorým druhom fytopatogénov napr. Fusarium sp., Rhizoctonia sp., stále nie je jasný spôsob jej účinku. Veľa autorov poukazovalo na to, že niekoľko lýtických enzýmov produkovaných počas fermentácie by mohli byť hlavným faktorom antagonistického účinku T. atroviride a nakoniec aj niekoľko vedcov úspešne demonštrovalo antagonistický účinok týchto enzýmov (37). 24

25 3. CIEĽ PRÁCE Cieľom tejto práce bola bližšia charakterizácia procesu klíčenia konídií T.atroviride pomocou: sledovania enzýmových aktivít enzýmov metaoblických dráh a dôležitých organel transportných experimentov rádioaktívne značených prekurzorov identifikácie génov pomocou tvorby subtraktívnych knižníc 25

26 4. MATERIÁLY A METÓDY 4.1 Chemikálie a látky použité pri práci Agar, Imuna, Šarišské Michaľany, Slovenská republika α-d-manopyranozid, Sigma Aldrich, USA α-ketoglutarát, Loba Chemie, Rakúsku Azid sodný, Sigma Aldrich, Nemecko CCCP, Sigma Aldrich, USA Coomassie briliant blue R-250, G-250, Sigma-Aldrich, Nemecko Dimetylformamid Merck, Nemecko GDP, Sigma Aldrich, USA Glycerol, Sigma Aldrich, USA Hovädzí sérový albumín, Reanal, Budapešť, Maďarsko Izocitrát trisodný, MO Biomedicals, Francúzsko Kvapalný scintilátor SLD-41, Chemopetrol, Neratovice, Česká republika Kvasničný autolyzát, Imuna, Šarišské Michaľany, Slovenská republika Kyselina chloristá, Merck, Nemecko Kyselina pyrohroznová, Sigma Aldrich, Steinheim, Nemecko Kyselina octová, Merck, Nemecko Kyselina trichlóroctová, Reanal, Budapešť, Maďarsko MES, Serva, Heidelberg, Nemecko NAD, Boehringer Mannheim, Nemecko Na 2 ATP, Sigma Aldrich, USA Raž, Ekotrend, Slovensko TCS, Sigma Aldrich, USA Tris, Boehringer Mannheim, Nemecko Triton x-100, Boehringer, Ingelheim, Nemecko Tween 80, Fluka, Buchs, Švajčiarsko Uracil, Fluka, Buchs, Švajčiarsko Ostatné látky, ktoré tvoria základ CzD pôdy a ostatné chemikálie boli analytickej čistoty pochádzajúce zo spoločnosti Lachema, Brno, Česká republika. Rádioaktívne značené látky 26

27 14 C-N-acetylglukozamín (NAG) od spoločnosti GE Healthcare, UK; 14 C - uracil (URA) od spoločnosti MP Biomedicals, Irvnie, USA; 14 C -cholín chlorid od spoločnosti Amersham Bioscience, UK 4.2 Prístroje použité pri práci Autokláv, Systec, GMBH, Nemecko Automatický autokláv PS 20A, Chirana, Slovensko Aparatúra na elektroforézu, Whatman Biometra, Cottingen, Nemecko Centrifúgy: MiniSpin Plus Eppendorf, Hamburg, Nemecko MPW 317, Mechanika Przecyzyjna, Varšava, Poľsko MPW 310b, Mechanika Przecyzyjna, Varšava, Poľsko K24, Janetzki, Engelsdorf, Nemecko Avanti J-30I, Beckman Coulter, U.S.A Elektrický zdroj na elektroforézu, Labio, Praha Fluorescenčný mikroskop AXIO Imager A1, Carl Zeiss, Jena, Nemecko LKB 1214 RackBeta LS counter, USA Lyofilizátor, LY3TT, Snijders Scientific, Holandsko ph meter, OP 211/1, Radelkis, Budapešť, Maďarsko Spektrofotometer, Spekol 11, Carl Zeiss, Jena, Nemecko UV/Vis spektrofotometer, Specord 250, Carl Zeiss, Jena, Nemecko Sušička, KBC, G-65/250, Premed, Varšava, Poľsko Termoblok, TC-24, Moska, Rusko Termoblok, HB-2, Taiwan Termostat, Plus II incubator, Gallenkamp, Švédsko Vortex, Janke & Kunkel, IKA-Labortechnik, Nemecko 4.3 Udržiavanie mikroskopických kultúr Divý kmeň T. atroviride sa udržiaval pravidelným preočkovávaním na Petriho misku obsahujúcu CzD médium stužené 2% agarom. Preočkovávanie sa uskutočňovalo v sterilnom očkovacom boxe za aseptických podmienok. Po vysporulovaní kultúry, sa sterilným očkom odobrala časť konídií z kultúry a suspendovala sa v 1 ml vysterilizovanej vody alebo 27

28 v roztoku 0,02% Tweenu. Z danej suspenzie sa následne pipetovalo 200 µl do kultivačnej banky. Banka obsahovala 50 g raže zaliatej 50 ml deionizovanej vody a bola vopred vysterilizovaná v autokláve za obvyklých podmienok. Kultúra sa následne kultivovala minimálne tri týždne. 4.4 Kultivácia T. atroviride Zozbieranie konídií z raže Po ukončení kultivácie na raži, sa konídie vymyli niekoľkonásobným premytím sterilným fyziologickým roztokom. Pri premývaní sa suspenzia konídií filtrovala cez trikrát zloženú gázu do Erlenmayerovej banky, odkiaľ sa preliala do skúmaviek Falcon a scentrifugovala pri otáčkach 1000xg po dobu 15 minút. Jednotlivé pelety sa spojili do hustej suspenzie a zaliali sterilným 20% glycerolom aby sa zabezpečila ochrana konídií pri zmrazení Kultivácia T. atroviride v CzD médiu Suspenzia konídií v glycerole sa nechala voľne rozmraziť. Po rozmrazení sa spočítala koncentrácia konídií na 1mL v Bürkerovej komôrke. Daná suspenzia sa potom očkovala do kultivačných baniek obsahujúcich 300 ml sterilného Czapek-Doxovho (CzD) média, pričom očkovaný alikvot suspenzie obsahoval 1, konídií. Kultúra sa následne nechala kultivovať v submerzných podmienka na závesnej rotačnej trepačke s frekvenciou trepania 4 Hz po dobu 0, 3, 6, 9 a 12 hodín Spracovanie vzoriek po ukončení kultivácie Vzorky v bankách sa po ukončení kultivácie scentrifugovali pri 6000 obrátkach 10 minút. Pellet obsahujúci konídie sa suspendoval v minimálnom objeme fyziologického roztoku a prelial do skúmavky Falcon. Následne sa centrifugoval pri otáčkach 1000xg po dobu 10 minút. Supernatant sa odlial a nahradil 7 ml CzD média Homogenizácia naklíčených konídií Vzorky sa homogenizovali v chladiacom boxe priamo v skúmavkách Falcon vortexovaním s balotinou. Vzorky boli homogenizované v troch 30 sekundových cykloch 28

29 medzi ktorými nasledovalo 1 minútové chladenie v ľade, aby sa zabránilo prehriatiu suspenzie. Po ukončení homogenizácie sa balotina nechala usadiť na dne skúmavky a supernatant sa prepipetoval do 1,5 ml ependorfiek. Následne bol odstredený pri maximálnych otáčkach po dobu 2 minút. Po odstredení bol supernatant opäť prepipetovaný do 1,5 ml ependorfiek v objemových alikvotoch 0,5 ml. Vzorky sa následne dali zmraziť do chladiaceho boxu s teplotou -20 C. 4.5 Stanovenie množstva bielkovín Množstvo bielkovín vo vzorke sa stanovovalo pomocou Bradfordovej metódy. Vzorka sa zmiešala s Bradfordovej činidlom a nechala sa odstáť 2 minúty. Následne sa merala absorbancia pri A 595. Rovnakým spôsobom bola pripravená aj kalibračná krivka, kde sa merala absorbancia vzoriek obsahujúcich 2, 4, 8, 10, 15, 20 a 30 µg bielkovín. Pomocou kalibračnej krivky bolo potom vypočítané množstvo bielkovín vo vzorkách. 4.6 Stanovenie aktivity laktátdehydrogenázy (LDH) Príprava roztokov a meranie aktivity LDH Na meranie bol pripravený fosforečnanový tlmivý roztok zložený z Na 2 HPO 4 a NaH 2 PO 4.H 2 O s koncentráciou c=67 mmol/l a ph 7,4. Tiež bol pripravený roztok kyseliny pyrohroznovej s koncentráciou c=25 mmol/l a roztok NADH s c=10 mmol/l. Po rozmrazení vzoriek sa do kyvety napipetovalo 1 ml fosforečnanového tlmivého roztoku, 20 µl roztoku NADH a 50 µl roztoku pyrohroznanu. Po krátkom temperovaní pri 37 o C sa reakcia spustila prídavkom 200 µl bezbunkového homogenátu a následne sa merala zmena absorbancie pri A 340 po dobu 5 minút. Blank tvoril roztok bez bunkového homogenátu. Zo získaných hodnôt zmeny absorbancií bola následne vypočítaná enzýmová aktivita pomocou Lambert-Beerovho zákona, pričom ε NADH = 3, cm 2.mol

30 4.7 Stanovenie aktivity α-d-manozidázy Príprava roztokov a meranie aktivity α-d-manozidázy Na meranie bolo potrebné pripraviť reakčnú zmes zloženú z deionizovanej vody, tlmivého roztoku MES-TRIS výsledná konc. c= 200 mmol/l a ph 6,8 a roztoku α-dmanopyranozidu ( výsledná konc. c= 4 mmol/l). Do 1,5 ml ependorfiek sa nepipetovalo 50 µl bezbunkového homogenátu a následne sa pridalo 50 µl reakčného roztoku. Vzorka sa nechala inkubovať po dobu 30 minút pri teplote 37 C. Po ukončení inkubácie sa reakcia zastavil prídavkom 1 ml roztoku glycín- NaOH s c=50 mmol/l a ph 11. Vzorky sa potom odstredili, aby došlo k usadeniu vyprecipitovaných bielkovín a merala sa absorbancia pri A 400, keď porovnávacím roztokom bol samotný stopovací roztok. Nakoniec bolo potrebné ešte zistiť príspevok neenzýmovej hydrolýzy substrátu. Preto sa spravilo ešte jedno meranie, keď reakcii sa zastavila ihneď po prídavku reakčného roztoku. Samotná aktivita sa nakoniec vypočítala z rozdielu absorbancií v čase 0 a po 30 minútovej inkubácii pomocou Lambert-Beerovho zákona, pričom ε paranitrofenolátu =1725 M -1.cm Stanovenie množstva fosforečnanov Príprava farebného indikátora a meranie kalibračnej krivky fosforečnanov Množstvo anorganických fosforečnanov sa bolo stanovené pomocou trifenylmetánového farbiva malachitová zelená. Samotné farbivo sa pripravilo zmiešaním dvoch roztokov. Prvým (A) bol roztok obsahujúci 0,045% (hmot.) malachitová zeleň, druhý (B) obsahoval 4,5% (hmot.) Na 2 MoO 4 rozpusteného v roztoku HCl s koncentráciou c= 4 mol/l. Výsledný farebný indikátor sa získal zmiešaním roztoku A a B v objemovom pomere 3:1 a po 30 minútovom miešaní sa prefiltroval cez skladaný filter. Pri príprave všetkých potrebných chemikálií bolo nutné používať ultračistú vodu, ktorej vodivosť bola najviac 2 µs. Taktiež bolo potrebné použiť materiál, ktorý neobsahoval na svojom povrchu zlúčeniny fosforečnanov, ktoré by mohli ovplyvniť presnosť merania. Kalibračná čiara sa získala pomocou Na 3 PO 4 v koncentračnom intervale 0 až 10 µm (to je výsledná koncentrácia po prídavku činidla C). Zo zásobného roztoku Na 3 PO 4 s koncentráciou c= 100 µmol/l sa riedením pripravili roztoky s koncentráciou c= 2, 4, 6, 8 30

31 a 10 µmol/l Na 3 PO µl sa následne zmiešalo s 1,75 ml farebného indikátoru a ihneď sa merala absorbancia pri A 660. Porovnávací roztok tvorilo 250 µl ultračistej vody a 1,75 ml indikátora. 4.9 Stanovenie aktivity GDPázy a cytoplazmatickej H + -ATPázy Príprava roztokov na meranie Všetky potrebné roztoky bolo potrebné pripraviť za použitia ultračistej vody a materiálov, ktoré nemali svoj povrch znečistený fosforečnanmi. Reakčná zmes na meranie Golgiho GDPázy obsahovala: manitol (konc. c= 0,5 mol/l), Tris-HCl (konc. c= 25 mmol/l ph 7,4) a 0,1% (obj.) Triton x-100. Reakčná zmes na meranie cytoplazmatickej H + -ATPázy obsahovala: 0,5 mol/l manitol,, 25 mmol/l Tris-HCl (ph 7.4), 5 mmol/l NaN 3, 100 mmol/l KNO 3, 0.2 mmol/l Na 2 MoO 4 a 5 mmol/l MgSO 4. Tiež bolo potrebné pripraviť roztok GDP/Na 2 ATP s koncentráciou c=50 mmol/l a stopovací roztok HClO 4 (c=3mol/l) Meranie aktivity GDPázy/ cytoplazmatickej H + -ATPázy 35 µl bezbunkového homogenátu sa zmiešalo so 100 µl reakčného roztoku. Samotná reakcia sa spustila prídavkom GDP/ Na 2 ATP, ktorého výsledná koncentrácia v zmesi bola 5 mmol/l. Zmes sa následne nechala inkubovať 30 minút pri teplote 37 o C. Po uplynutí doby inkubácie sa reakcia zastavila prídavkom 33 µl HClO 4. Po zastavení reakcie došlo k odstráneniu vyprecipitovaných bielkovín odstredením a k spektrofotometrickému meraniu obsahu voľných fosforečnanov pri A 660. Podobne ako pri α-d manozidáze, bolo potrebné zistiť neenzýmový príspevok hydrolýzy substrátu. Výsledná aktivita sa potom zistila z rozdielu absorbancií vzoriek bez inkubácie a po inkubácii Stanovenie aktivity dehydrogenázy izocitranu Príprava roztokov a meranie aktivity enzýmu Na meranie aktivity bolo potrebné prirpaviť reakčnú zmes so zložením 100 µmol/l Tris-acetát (ph 7,2), 4 µmol/l MnCl 2 a 1 µmol/l NAD +. Tiež bolo potrebné pripraviť roztok izocitrátu trisodnéhi s konc. c= 16 µmol/l ktorým sa spúšťala reakcia. 31

32 Všetky potrebné komponenty sa zmiešali v skúmavke, kde sa pridalo 0,5 ml reakčného roztoku, 0,5 ml vzorky a reakcia sa spustila pridaním 0,5 ml izocitranu. Následne sa merala zmena absorbancie po dobu 5 minút pri A 340, keď blank tvoril roztok bezbunkového homogenátu.. Zo získaných hodnôt zmeny absorbancií bola potom vypočítaná enzýmová aktivita pomocou Lambert-Beerovho zákona, pričom ε NADH = 3, cm 2.mol Stanovenie aktivity dehydrogenázy α-ketoglutaranu Príprava roztokov a meranie aktivity enzýmu Na spustenie reakcie bolo potrebné pripraviť reakčnú zmes so zložením: 0,333 ml fosfátového tlmivého roztokus c=0,2 mol/l a ph 7,2 obsahujúceho kyslý a stredný fosforečna sodný; 0,033 ml cysteínu s c=0,1 mol/l; 0,25 ml CoASH s c=1 mmol/l; 0,033 ml NAD + c=10 mmol/l a 0,055 ml α-ketoglutaranu s c=3 mmol/l. Následne sa objem doplnil na 1 ml redestilovanou a reakcia sa spustila pridaním 0,1 ml enzýmového preparátu. Merala zmena absorbancie po dobu 5 minút pri A 340, keď blank tvoril roztok bezbunkového homogenátu.. Zo získaných hodnôt zmeny absorbancií bola potom vypočítaná enzýmová aktivita pomocou Lambert-Beerovho zákona, pričom ε NADH = 3, cm 2.mol Stanovenie aktivity dehydrogenázy pyrohroznanu Príprava roztokov a meranie aktivity enzýmu Na spustenie reakcie bolo potrebné pripraviť reakčnú zmes so zložením: 0,333 ml fosfátového pufru s c=0,2 mol/l a ph 7,2 obsahujúceho kyslý a stredný fosforečnan sodný; 0,033 ml cysteínu s c=0,1 mol/l; 0,25 ml CoASH s c=1 mmol/l; 0,033 ml NAD + c=10 mmol/l a 0,055 ml kyseliny pyrohroznovej s c=3 mmol/l. Následne sa objem doplnil na 1 ml redestilovanou a reakcia sa spustila pridaním 0,1 ml enzýmového preparátu. Merala zmena absorbancie po dobu 5 minút pri A 340, keď blank tvoril roztok bez bunkového homogenátu.. Zo získaných hodnôt zmeny absorbancií bola potom vypočítaná enzýmová aktivita pomocou Lambert-Beerovho zákona, pričom ε NADH = 3, cm 2.mol

33 4.13 Stanovenie aktivity citrátsyntázy Príprava roztokov a meranie aktivity enzýmu Na meranie enzýmovej aktivity bolo potrebné pripraviť reakčnú zmes s obsahom 100 mmol/l MOPS/KOH (ph 7), 2 mol/l KCL, 1 mmol/l DTNB, 0,2 mmol/l acetyl-coa a 4 mmol/l oxaloctanu. Reakcia sa spustila pridaním enzýmového preparátu k 1 ml reakčného roztoku pričom sa merala zmena absorbancie pri A 412 po dobu 5 minút. Zo získaných hodnôt zmeny absorbancií bola potom vypočítaná enzýmová aktivita pomocou Lambert-Beerovho zákona, pričom ε DTNB-CoA = 14, M -1.cm Stanovenie aktivity izocitrátlyázy Príprava roztokov a meranie enzýmovej aktivity Na meranie enzýmovej aktivity bolo potrebné pripraviť reakčnú zmes, ktorá obsahovala: 100 mmol/l MOPS/KOH (ph 7), 2 mol/l KCL, 5 mmol/l MgCl 2, 5 mmol/l DTT, 3,5 mmol/l fenylhydrazín chlorid a 4 mmol/l DL izocitran. Reakcia sa spustila pridaním enzýmového preparátu k 1 ml reakčného roztoku pričom sa merala zmena absorbancie pri A 324 m po dobu 5 minút. Zo získaných hodnôt zmeny absorbancií bola potom vypočítaná enzýmová aktivita pomocou Lambert-Beerovho zákona, pričom ε fenylhydrazon = M -1.cm Stanovenie aktivity glutamátdehydrogenázy Príprava roztokov a meranie enzýmovej aktivity Aktivita enzýmu sa merala pomocou reakčnej zmesi ktorá obsahovala: 200 mmol/l Tris/HCl (ph 7,8); 1,6 mol/l KCl; 0,4 mol/l NADH; 100 mmol/l octan amónny a 17,5 mol/l α-ketoglutarát. Reakcia sa spustila pridaním enzýmového preparátu k 1 ml reakčného roztoku pričom sa merala zmena absorbancie pri A 365 po dobu 5 minút. Zo získaných hodnôt zmeny absorbancií bola potom vypočítaná enzýmová aktivita pomocou Lambert-Beerovho zákona, pričom ε NADH = 3, M -1.cm

34 4.16 Postup merania transportu cholínu, NAG a URA Príprava konídií na transportný experiment Na transportné experiment bolo potrebné pripraviť vysoko koncentrovanú suspenziu konídií. Tá sa získala vymytím povrchovej kultúry vláknitej huby vyrastenej na Petriho miskách pomocou sterilnej vody. Suspenzia sa potom prefiltrovala cez skladanú gázu a niekoľkonásobne premyla odstredením a zahustila do minimálneho objemu deionizovanou vodou. Po stanovení koncentrácie konídií Bürkerovou komôrkou sa suspenzia použila na prípravu experimentálnej zmesi. Do 40 ml CzD média sa očkoval alikvot suspenzie obsahujúci približne 1,8x10 10 konídií. Následne sa v jednotlivých časových intervaloch odoberali 3,4 ml alikvoty z experimentálnej zmesi. Suspenzia konídií sa odstredila, získaný pelet sa 4 krát premyl a potom suspendoval v 20 ml reakčného tlmivého roztoku Meranie transportu látok Na meranie sa použili 5 ml suspenzie konídií. Na prípravu sa použil buď 1% NaCl v 20 mmol/l Tris-HCl (ph 7,4) (ak sa sledoval transport cholínu alebo URA), alebo 1% NaCl v 20 mmol/l Tris-Maleát (ph 6) (ak sa sledoval transport NAG). Meranie sa spustilo prídavkom rádioaktívne značeného prvku (cholín, NAG, URA) ktorého výsledná koncentrácia v zmesi bola 200 µmol/l a minimálna špecifická rádioaktivita 2000 cpm/nmol. Zmes sa dobre premiešala a následne sa odobral 1 ml alikvot konidiálnej suspenzie. Konídie sa zachytili pomocou borosilikátovej membrány a filtračný koláč sa 2 krát premyl reakčným tlmivého roztoku. Následne sa celý konidiálny koláč aj s membránou vložil do fľaštičky so scintilačnou zmesou obsahujúcou 10% TCA (s vopred premeraným pozadím) Zvyšok suspenzie sa nechal inkubovať za stáleho miešania po dobu 30 (cholín) resp. 40 minút (NAG, URA). Po uplynutí doby inkubácie sa postup opakoval. Výsledný transport sa potom počítal ako rozdiel inkorporovanej rádioaktivity v čase 0 a po inkubácii Meranie tvorby biomasy počas klíčenia konídií Súbežne s meraním transportu rádioaktívne značených látok do klíčiacich konídií sa zisťoval prírastok biomasy v jednotlivých časových intervaloch. 2 ml alikvoty zo suspenzie konídií sa zachytili na Bórsilikátovej membráne premyli reakčným tlmivým roztokom a sušili pri 70 o C do konštantnej váhy. 34

35 Vplyv vybraných látok na transport Vplyv vybraných látok (TCS a CCCP) na transport rádioaktívne značených látok sa zisťoval ich prídavkom k 5 ml suspenzie konídií, 5 min pred pridaním rádioaktívneho prvku. Ostatné podmienky boli rovnaké s tými, ktoré sú popísané vyššie Meranie enzýmových aktivít počas dozrievania konídií Príprava konídií na enzýmové merania Konídie T.atroviride boli naočkované na raž v objemových alikvotoch. Konídie sa po ich vzniku nechali na raži dozrievať niekoľko týždňov. S ľubovoľne vybratými časovými odstupmi (v týždňoch) sa konídie z raže vymývali a spracovávali Vymytie a homogenizácia Po ukončení kultivácie na raži, sa konídie vymyli niekoľkonásobným premytím sterilným fyziologickým roztokom. Pri premývaní sa suspenzia konídií filtrovala cez trikrát zloženú gázu do Erlenmayerovej banky, odkiaľ sa preliala do skúmaviek Falcon a odstredila pri obrátkach 1000xg po dobu 15 minút. Jednotlivé pelety sa spojili do hustej suspenzie a zaliali sterilným 20% glycerolom aby sa zabezpečila ochrana konídií pri zmrazení. V Bürkerovej komôrke sa spočítala koncentrácia konídií na 1mL. Daná suspenzia sa potom očkovala do skúmaviek Falcon (50mL) s obsahom 5 ml sterilného CzD média, pričom očkovaný alikvot suspenzie obsahoval 1, konídií. Homogenizácia prebiehala podľa postupu uvedeného v časti Stanovenie enzýmových aktivít a množstva bielkovín Stanovenia enzýmovej aktivity LDH sa uskutočnilo podľa postupu v časti 4.6 Stanovenia enzýmovej aktivity α-d-manozidázy sa uskutočnilo podľa postupu v časti 4.7. Stanovenia enzýmovej aktivity GDPázy a cytoplazmatickej H + -ATPázy sa uskutočnilo podľa postupu v časti 4.8. Stanovenia množstva bielkovín sa uskutočnilo podľa postupu v časti

36 5. VÝSLEDKY Na objasnenie klíčenia a dozrievania konídií a procesov prebiehajúcich v konídiách boli vybrané viaceré enzýmy významných metabolických dráh a niektorých organel. LDH bol vybraný ako markerový enzým, ktorým sme zisťovali aktiváciu glykolýzy, α-d-manozidáza (vakuola) a GDPáza (Golgiho aparát) boli vybrané ako enzýmy, ktorými sa sledoval vývoj danej organely. Taktiež bola pozorovaná aktivita H + -ATPázy ako protónovej pumpy, vytvárajúcej elektrochemický gradient H + v plazmatickej membráne. Počas klíčenia konídií boli pozorované aj enzýmy citrátového cyklu (napr. citrátsyntáza) na zistenie vývoja mitochondrií a času, kedy dochádza k spusteniu cyklu. Tiež bola meraná aktivita glutamátdehydrogenázy, ktorou sa sledoval priebeh resp. vývoj metabolizmu dusíka. Transportné procesy rádioaktívne značených látok sa uskutočnili na zistenie vývoja bunkovej steny a biologických membrán (NAG, cholín), syntézy RNA (uracil) a hlavne na určenie systému, akým sa tieto látky transportujú do bunky počas klíčenia. 5.1 Morfologické zmeny konídií počas submerznej kultivácie Dôležitou súčasťou experimentov bola charakterizácia morfologických zmien počas klíčenia konídií T.atroviride. Stupeň naklíčenia konídií sa zisťoval mikroskopickou analýzou submerzne kultivovaných vzoriek. Pri mikroskopickom pozorovaní bol taktiež meraný priemer klíčiacich resp. pučiacich konídií a pozorovaný čas, kedy dochádzalo k tvorbe prvých klíčkov. Z výsledkov je zrejmé, že k hlavnému napučiavaniu konídií dochádza v prvých ôsmich hodinách kedy konídie zväčšili svoj priemer viac ako 1,5 krát. Po ôsmich hodinách kultivácie bola priemerná veľkosť konídií okolo 3 µm zatiaľ čo pred inkubáciou to bolo len asi 1,9 µm. Po ďalších 12 hodinách inkubácie sa nám už priemer konídií zväčšil zhruba len 1,2 krát. Preto môžeme povedať, že pravdepodobne 8 hodinou končí fáza napučiavania konídií a začína fáza tvorby zárodočných hýf. Prvé klíčky bolo možné vidieť už po 9 hodinách kultivácie, ale zreteľnejší obraz sa naskytol až v desiatej hodine klíčenia, kedy boli už klíčky dostatočne dlhé. Predlžovanie klíčkov s postupom času pokračovalo značným tempom a už po 14 až 15 hodinách kultivácie dostávala kultúra typický vzhľad mycélia. 36

37 4 3,5 3 2,5 µm 2 1,5 1 0, hodina Obr.3. Závislosť priemeru konídií od doby kultivácie monitorovaný počas submerznej kultivácie huby v CzD médiu. Konídie boli kultivované za stáleho trepania s frekvenciou 4 Hz a teplotou 26oC. Veľkosť priemeru bola meraná pomocou AXIO Imager A1 (Carl Zeiss). Obr.4. Mikroskopické pozorovanie konídií T.atroviride v priebehu submerznej kultivácie v CzD médiu Vzorky boli submerzne kultivované pri teplote 26 o C a snímané mikroskopom AXIO Imager A1 (Carl Zeiss). 37

38 5.2 Enzýmové aktivity v klíčiacich konídiách Aktivita LDH Laktátdehydrogenáza, enzým katalyzujúci premenu kyseliny pyrohroznovej na kyselinu mliečnu, vykazovala aktivitu už aj v počiatočnom štádiu kultivácie, teda v čase 0. Do tretej hodiny bol zaznamenaný pokles, no enzým neprestal byť aktívny úplne, ale naopak sa aktivity znížila len mierne. S pokračovaním klíčenia konídií dochádzalo k nárastu aktivity LDH. Medzi 3 a 9 hodinou síce aktivita vzrástla len o čosi viac ako 15% no po deviatej hodine došlo k výraznému rastu aktivity až o skoro 40%. LDH 60 špecifická aktivita (nmol/min/mg) doba kultivácie (h) Obr.5. Závislosť špecifickej enzýmovej aktivity LDH od času kultivácie. Enzýmová aktivita bola po temperovaní na teplotu 37 o C meraná po dobu 5 minút pri A 340 prostredníctvom oxidácie NADH. Reakcia sa spúšťala prídavkom enzýmového preparátu k reakčnej zmesi. Z rozdielu absorbancií bola následne vypočítaná enzýmová aktivita LDH Aktivita α-d manozidázy α-d manozidáza, enzým posttranslačnej modifikácie bielkovín, prekvapivo vykazoval najväčšiu aktivitu v počiatočnom štádiu kultivácie. Do tretej hodiny aktivita tohoto enzýmu výrazne klesla a to dokonca až o 80%. V nasledujúcom období kultivácie už však dochádzalo k rastu enzýmovej aktivity, no len veľmi pomaly. V 9 hodine kultivácie aktivita enzýmu dosiahla takmer polovicu z aktivity v čase 0. Pomalý rast nasledoval aj naďalej čo naznačuje aj hodnota aktivity po 12 hodinách kultivácie, ktorá dosiahla približne 60% z aktivity v čase 0. 38

39 80 manozidáza 60 špecifická aktivita (nmol/min/mg) doba kultivácie (h) Obr.6. Závislosť špecifickej enzýmovej aktivity α-d manozidázy od času kultivácie. Vzorka enzýmu bola inkubovaná s reakčnou zmesou 30 minút pri teplote 37 o C a po pridaní stopovacieho roztoku sa merala absorbancia pri A 400 prostredníctvom tvorby p-nitranilínu Aktivita GDPázy GDPáza, markerový enzým Golgiho aparátu, počas prvých šiestich hodín nevykazoval prakticky žiadnu aktivitu. Od šiestej do deviatej hodiny však došlo k značnému nárastu v aktivite, čo naznačuje aj hodnota takmer 12 nmol/min/mg bielkovín. Do dvanástej hodiny však prišlo k miernemu poklesu ktorý predstavoval okolo 20% špecifická aktivita (nmol/min/mg) doba kultivácie (h) 39

40 Obr.7. Závislosť špecifickej enzýmovej aktivity GDPázy od času kultivácie. Vzorky s reakčným roztokom boli inkubované 30 minút pri teplote 37 o C. Samotná reakcia sa spustila pridaním GDP (výsledná koncentrácia 5 mmol/l) k zmesi. Následne po zastavení reakcie pomocou 33µL kys.chloristej (c=3 mol/l) a odstredení vyprecipitovaných bielkovín bola meraná A 660 z ktorej sa potom vypočítala aktivita enzýmu Aktivita plazmatickej H + -ATPázy Aktivita plazmatickej H + ATPázy sa počas prvých šiestich hodín klíčenia nepodarila namerať. Prvotná aktivita enzýmu bola teda zaznamenaná až po deviatich hodinách klíčenia. V priebehu ďalšej fázy klíčenia konídií aktivita enzýmu naďalej rástla a aj preto bola jej hodnota po 12 hodinách o takmer 70% väčšia ako pri predchádzajúcom odbere. Celkovo však ATPáza príliš veľkú aktivitu nedosiahla, keďže jej úroveň sa po dvanástich hodinách pohybovala na hodnote okolo 4 nmol/min/mg bielkovín. 4 špecifická aktivita (nmol/min/mg) doba kultivácie (h) Obr.8. Závislosť špecifickej enzýmovej aktivity plazmatickej H + ATPázy od času kultivácie. Vzorky s reakčným roztokom boli inkubované 30 minút pri teplote 37 o C. Reakcia sa spúšťala pridaním Na 2 ATP (výsledná koncentrácia 5 mmol/l). Po zastavení reakcie pomocou 33µL kys.chloristej ( c=3 mol/l) a odstredení vyprecipitovaných bielkovín bola meraná A 660 z ktorej sa potom vypočítala aktivita enzýmu Aktivita citrátsyntázy Citrátsyntáza, počiatočný enzým citrátového cyklu slúžiaci na syntézu kys.citrónovej, mal miernu aktivitu už aj na začiatku kultivácie. Počas prvých šiestich hodín prišlo k nárastu aktivity zhruba o 50% oproti počiatku čo predstavovalo 0,5 nmol/min/mg bielkovín za hodinu. Od šiestej do deviatej hodiny však aktivita začala rásť už trikrát rýchlejšie ako 40

41 predtým no potom nasledovalo mierne spomalenie rastu. Aj napriek tomu bola aktivita na konci kultivácie už viac ako štvornásobne vyššia. 16 citrátsyntáza 12 špecifická aktivita (nmol/min/mg) doba kultivácie (h) Obr.9. Závislosť špecifickej enzýmovej aktivity citrátsyntázy od doby kultivácie. Po vytemperovaní reakčného roztoku na 37 o C a pridaní enzýmového preparátu sa merala zmena A 412 po dobu 5 minút. Z rozdielu absorbancií bola následne vypočítaná aktivita enzýmu Aktivita izocitrátdehydrogenázy Izocitrátdehydrogenáza, ďalší enzým Krebsovho cyklu, mal podobne ako citrátsyntáza už aktivitu aj na začiatku kultivácie pričom jej hodnota sa pohybovala na úrovni 7 nmol/min/mg. V tretej a šiestej hodine nastal pokles v aktivite tejto dehydrogenázy pričom jej hodnota bola takmer o polovicu menšia ako v čase 0. No po šiestej hodine už dochádzalo k rastu. Ten bol spočiatku mierny a v deviatej hodine bola aktivita enzýmu ešte stále 1,5 krát menšia ako v čase 0. Situácia sa zmenila po deviatej hodine, kedy pravdepodobne došlo k masívnej expresii enzýmu keďže len od deviatej do dvanástej hodiny vzrástla aktivita tohto 41

42 enzýmu viac ako trojnásobne a bola o skoro 50% väčšia ako v čase izocitrátdehydrog. špecifická aktivita (nmol/min/mg) doba kultivácie (h) Obr.10. Závislosť špecifickej enzýmovej aktivity izocitrátdehydrogenázy od času kultivácie. Po vytemperovaní reakčnej zmesi na 37 o C a pridaní enzýmového preparátu sa merala zmena A 340 po dobu 5 minút. Reakcia sa indikovala pomocou redukcie NAD + na NADH. Z rozdielu absorbancií bola následne vypočítaná aktivita enzýmu Aktivita glutamátdehydrogenázy Glutamátdehydrogenáza, dôležitý enzým v metabolizme dusíka, mal takmer nulovú aktivitu v počiatku kultivácie, no už v prvých troch hodinách jej aktivita 7 násobne vzrástla pričom tempo rastu sa aj naďalej zvyšovalo. Od tretej do šiestej hodiny došlo k nárastu o viac ako 50% na hodnotu okolo 160 nmol/min/mg bielkovín. Tento jav sa opakoval aj medzi šiestou a deviatou hodinou, kedy aktivita vzrástla opäť takmer o 50%. Vrchol expresie enzýmu však nastal v posledných troch hodinách kultivácie, kedy aktivita enzýmu bola vyššia o takmer 80% oproti aktivite v deviatich hodinách kultivácie. Za celé obdobie kultivácie tak aktivita dehydrogenázy vzrástla takmer 13 krát oproti počiatočnej hodnote čo predstavuje viac ako 100% nárast. 42

43 1600 glutamátdehydrogenáza 1200 špecifická aktivita (nmol/min/mg) doba kultivácie (h) Obr.11. Závislosť špecifickej enzýmovej aktivity glutamátdehydrogenázy od času kultivácie. Po vytemperovaní reakčnej zmesi na 37 o C a pridaní enzýmového preparátu sa merala zmena A 340 po dobu 5 minút prostredníctvom oxidácie NADH na NAD +. Z rozdielu absorbancií bola následne vypočítaná aktivita enzýmu Aktivita izocitrátlyázy Izocitrátlyáza, enzým glyoxylátového cyklu, vykazoval pomerne vysokú aktivitu už v počiatočnom štádiu klíčenia konídií a do tretej hodiny aktivita dokonca ešte vzrástla. A práve v tomto čase dosiahla svoj vrchol na úrovni okolo 13 nmol/min/mg bielkovín. Po tretej hodine došlo k poklesu zhruba na úroveň v čase 0. Znižovanie aktivity sa však nezastavilo a pokračovalo až do deviatej hodiny kultivácie, kedy bola aktivita takmer o polovicu nižšia ako v čase 0 a 60% nižšia ako pri maximálnej hodnote dosiahnutej po troch hodinách kultivácie. V dvanástej hodine kultivácie sa aktivita lyázy už nijako výrazne nezmenila a udržala si v podstate podobnú úroveň ako pri predchádzajúcom odbere. 43

44 20 izocitrátlyáza 15 špecifická aktivita (nmol/min/mg) doba kultivácie (h) Obr.12. Závislosť špecifickej enzýmovej aktivity izocitrátlyázy od času kultivácie. Po vytemperovaní reakčnej zmesi na 37 o C a pridaní enzýmového preparátu sa merala zmena A 324 po dobu 5 minút. Z rozdielov absorbancií sa potom vypočítala aktivita enzýmu Aktivita α-ketoglutarátdehydrogenázy Meranie aktivity α-ketoglutarátdehydrogenázy neprinieslo očakávané výsledky. Očakávanému vzrastu absorbancie (A 340 ) predchádzali zložité (kvázi oscilačné) zmeny absorbancie, ktoré sa nedali jednoducho interpretovať. Priebeh jednotlivých meraní je zobrazený na obr. 11( A, B, C, D, E). Ako si môžeme všimnúť, vo vzorkách odobraných po 9 a 12 hodinách klíčenia sa zhruba po 25 sekundách od spustenia reakcie ukončí fáza nestability a pozoruje sa prírastok absorbancie. Je možné predpokladať, že táto lineárna fáza predstavuje nami sledovanú reakciu. Oscilačná fáza sa nedala eliminovať odstránením cysteínu z média, prídavkom 0,1% Triton X100, ani prídavkom GDP a Pan, ktoré sú substrátmi následnej reakcie sukcinylsyntázy. Ťažko je možné interpretovať najmä strmý pokles na začiatku merania, ktorý sa vyskytoval na začiatku každej reakcie. Pokles v absorbancii trval u všetkých vzoriek približne rovnako a síce prvých sekúnd reakcie. Kvôli tomu ale nebolo možné jednoznačne určiť začiatok sledovanej reakcie a navyše aj vyhodnocovanie aktivity dehydrogenázy by mohlo byť zaťažené veľkou chybou. Tento jav môže byť dôsledok viacerých inhibičných vplyvov, prípadne môže ísť o reakciu nejakého zo spriahnutých enzýmov keďže enzýmový preparát ktorý bol dávkovaný ako vzorka bola vlastne zmes všetkých enzýmov extrahovaných z konídií. 44

45 a) 1,0 b) 0,20 Aktivita 0H Aktivita 3H 0,9 0,18 A 340 0,8 A 340 0,16 0,7 0,14 0, , cas (s) cas (s) c) d) 0,40 0,24 Aktivita 6H Aktivita 9H 0,22 0,38 A 340 0,20 A 340 0,36 0,18 0,34 0,16 0,32 0, , cas (s) cas (s) e) 0,44 Aktivita 12H 0,42 0,40 0,38 A 340 0,36 0,34 0,32 0,30 0,1 0, cas (s) Obr. 13. Časové priebehy zmeny absorbancií pri meraní aktivity α-ketoglutarátdehydrogenázy (A- 0 hodín kultivácie, B-3 hodiny kultivácie, C-6 hodín kultivácie, D-9 hodín kultivácie, E-12 hodín kultivácie). Po vytemperovaní reakčného roztoku na teplotu 37 o C sa reakcia spúšťala pridaním enzýmového preparátu. Bola meraná A 340 (redukcia NAD + na NADH) Aktivita pyruvátdehydrogenázy Aktivita enzýmu pyruvátdehydrogenázy mala v podstate rovnaký priebeh ako α- ketoglutarátdehydrogenázy. Rovnako ako pri ketoglutaráte bol v prvých sekundách reakcie pomerne výrazný pokles v absorbancii. Jediným rozdielom bola vzorka v čase 6 hodín kultivácie, kedy počiatočný priebeh má oscilačný charakter. Neskôr ešte došlo k nárastu absorbancie, no tá vzápätí opäť klesla na predchádzajúcu hodnotu. Vo vzorkách 9 a 12 hodín môžeme opäť vidieť nárast absorbancie rovnako ako pri predchádzajúcom enzýme. Avšak 45

46 z dôvodov opísaných pri α-ketoglutarátdehydrogenáze nebolo možné vyhodnotiť aktivitu pyruvátdehydrogenázy so žiadanou spoľahlivosťou. a) 0,85 b) Aktivita 0H 0,30 Aktivita 3H 0,80 0,75 0,25 A 340 A 340 0,70 0,20 0,65 0,08 0, cas (s) 0,04 0, cas (s) c) 0,20 d) 0,50 Aktivita 6H Aktivita 9H 0,18 0,45 A 340 A 340 0,16 0,40 0, , cas (s) cas (s) e) Aktivita 12H 0,5 A 340 0,4 0,3 0, cas (s) Obr.14. Časové priebehy zmeny absorbancií pri meraní aktivity pyruvrátdehydrogenázy (A- 0 hodín kultivácie, B-3 hodiny kultivácie, C-6 hodín kultivácie, D-9 hodín kultivácie, E-12 hodín kultivácie). Po vytemperovaní reakčného roztoku na teplotu 37 o C sa reakcia spúšťala pridaním enzýmového preparátu. Bola meraná A 340 (redukcie NAD + na NADH) Množstvo bielkovín uvoľnených pomocou homogenizácie z klíčiacich konídií Množstvo vyextrahovaných bielkovín z konídií bolo pomerne vysoké už v počiatočnej fáze klíčenia a dosahovalo hodnotu približne 2,5 mg/ml. Do tretej hodiny však kleslo približne o polovicu no potom nasledoval rast množstva bielkovín, ktorý mal od šiestej hodiny takmer lineárny charakter. 46

47 4 3 m (mg/ml) doba kultivácie (h) Obr.15. Závislosť množstva bielkovín v konídiách od času kultivácie. Množstvo bielkovín sa meralo pomocou Bradfordovej metódy. Vzorky boli pred pridaním činidla 100 násobne riedené, aby bolo možné zistiť množstvo prítomných bielkovín. 47

48 5.3 Transport vybraných látok cez membránu počas klíčenia konídií Je možné predpokladať, že spustenie klíčenia súvisí so skutočnosťou, že konídie registrujú nejakým (zatiaľ neznámym) spôsobom prítomnosť vhodných živín v prostredí a že tieto živiny sa transportujú do konídií, resp., do klíčiacich konídií. Je možné očakávať, že transportné procesy sú aktívne už v prvých fázach procesu klíčenia, ak nie počas celej existencie dormantného stavu. Preto boli uskutočnené experimenty, ktoré mali ukázať, ako sa transportujú prekurzory dôležitých molekúl, ako napr. ribonukleových kyselín (uracil), chitínu (N-acetylglukózamín) alebo lipidov a osmolytov (cholín) Transport cholínu Transport cholínu, zložky fosfolipidov membrán, začal po 8 hodinách kultivácie, no výraznejší nárast bol zaznamenaný už aj v 4 hodine. Medzi ôsmou a štrnástou hodinou bol nárast transportu takmer lineárny, pričom v štrnástej hodine odberu boli bunky schopne prijať o 50% viac cholínu ako v čase 8 hodín. Aj vďaka tomu, transport cholínu dosiahol svoje maximum pomerne skoro a to v 20 hodine kultivácie, kedy boli bunky schopne prijať o 80% cholínu viac ako oproti počiatku kultivácie a o 65% viac ako po 8 hodinách kultivácie. Po dosiahnutí tohto maxima však začal transport cholínu výrazne klesať. V 25 hodiny kultivácie bunky boli schopné transportovať už dvakrát menej cholínu ako pri predchádzajúcom odbere a tento pokles dosiahol veľkosť takmer 0,75 nmol/mg(suš)/h. K miernemu nárastu prišlo ešte medzi 25 a 30 hodinou kultivácie, no prišlo len k miernemu zvýšeniu transportu zhruba o 15% a aj preto bol rozsah transportu na konci sledovaného obdobia ešte stále takmer o polovicu menší ako pri maxime. 48

49 Transport cholínu (nmol/mg(suš)/h) kontrola TCS CCCP doba kultivácie (h) Obr.16. Priebeh transportu cholínu konídiami v závislosti od času kultivácie a vplyv inhibítorov na transport. Transport sa meral pri ph 7,4 dosiahnutého pomocou tlmivého roztoku 1% NaCl v 20 mmol/l Tris-HCl. Koncentrácia cholínu v reakčnej zmesi bola 200 µmol/l a odpojovačov (TCS, CCCP) 30 µmol/l. Jednotlivé odpojovače boli pridané k reakčnej zmesi 5 minút pred rádioaktívnou látkou, ktorej špecifická rádioaktivita bola 1007,64 CPM/nmol Vplyv inhibítorov TCS a CCCP na transport Príjem cholínu klíčiacim konídiami bol pozorovaný aj v prítomnosti odpojovačov, a to TCS a CCCP. Účinok týchto inhibítorov bol závislý od veľkosti transportu a stupňa naklíčenia konídií. Kým v ôsmej hodine kultivácie, teda na začiatku transportu cholínu bola inhibícia TCS na úrovni 65%, v 14 hodine to už bolo takmer 80% a v 20 hodine, teda pri maximálnom transporte dokonca okolo 85%. V porovnaní s TCS, CCCP sa ukázalo byť slabším inhibítorom transportu. Citlivosť systému na prítomnosť CCCP v ôsmej hodine kultivácie, teda na začiatku rastu transportu, takmer nebola ani zaznamenaná. No podobne ako pri TCS, tak aj účinok CCCP rástol so stupňom naklíčenia a rozsahom transportu. Účinok sa výraznejšie prejavil už v 11 hodine kultivácie, keď inhibícia dosiahla okolo 50% a v 17 hodine kultivácie to bolo takmer až 60%. Najväčší účinok, podobne ako TCS, malo CCCP pri maxime transportu v čase 20 hodín kultivácie, keď sa inhibícia pohybovala na úrovni 70%. 49

50 Transport cholínu (nmol/mg(suš)/h) Kontrola TCS CCCP doba kultivácie(h) Obr.17. Inhibícia transportných procesov cholínu prostredníctvom TCS a CCCP a porovnanie s transportom bez prídavku inhibítora v jednotlivých časoch merania. Vplyv inhibítorov sa meral pri ph 7,4. Jednotlivé inhibítory boli pridané k zmesi 5 minút pred rádioaktívne označenou látkou a ich výsledná koncentrácia bola 30 µmol/l. Do kontroly bolo namiesto inhibítorov pridané ekvivalentné množstvo MeOH Rast biomasy v priebehu kultivácie Počas merania transportných procesov bol sledovaný aj prírastok biomasy počas jednotlivých odberov. Mierny nárast sa vyskytol už po 2 hodinách kultivácie, no potom prišlo k značnému spomaleniu rastu a množstvo biomasy sa držalo takmer na rovnakej úrovni. Tento stav trval až do ôsmej hodiny kultivácie, kedy sa množstvo biomasy začalo opäť zväčšovať. Jej prírastok za hodinu predstavoval približne 6,5% a toto tempo prírastku pretrvávalo až do ukončenia kultivácie. Celkový prírastok biomasy za celý časový úsek predstavoval viac ako 12 násobok počiatočnej hodnoty. 50

51 3,0 2,5 biomasa 2,0 m(mg/ml) 1,5 1,0 0,5 0, doba kultivácie (h) Obr.18. Rast množstva biomasy v priebehu kultivácie. Biomasa bola zachytávaná pomocou borosilikátovej membránky a následne vysušená do konštantnej hmotnosti Transport uracilu Začiatok transportu uracilu, prvku potrebného v syntéze RNA, bol zaznamenaný okolo trinástej hodiny kultivácie, kedy klíčiace konídie boli schopné prijať o 40% viac uracilu ako pri predchádzajúcom odbere. Dovtedy bol jeho príjem pomerne nízky a navyše ani nepodliehal vplyvu inhibítorov. Po nasledujúcich troch hodinách kultivácie došlo k ďalšiemu nárastu transportu, no najvyššiu hodnotu dosiahol o niečo neskôr a síce v 19 hodine kultivácie, kedy boli konídie schopné prijať 3,5 krát viac uracilu ako po prvých trinástich hodinách kultivácie. Taktiež rozdiel oproti počiatku kultivácie predstavoval dokonca až 80%. V nasledujúcich siedmich hodinách však už dochádzalo k miernemu poklesu a táto tendencia pokračovala až do druhého dňa, kedy tvoriace sa mycélim bolo schopné prijať o 25% uracilu menej ako pri maximálnej hodnote. 51

52 0,4 cccp TCS kont. Transport uracilu (nmol/mg(suš)/h) 0,2 0, doba kultivácie (h) Obr.19. Transport uracilu konídiami v závislosti od času kultivácie a vplyv inhibítorov na transport. Transport sa meral pri ph 7,4 dosiahnutého pomocou tlmivého roztoku 1% NaCl v 20 mmol/l Tris-HCl. Koncentrácia uracilu v reakčnej zmesi bola 200 µmol/l a odpojovačov (TCS, CCCP) 30 µmol/l. Jednotlivé inhibítory boli pridané k reakčnej zmesi 5 minút pred rádioaktívnou látkou, ktorej špecifická rádioaktivita bola 2500 CPM/nmol Vplyv odpojovačov na transport uracilu Transport uracilu podobne ako cholínu bol pozorovaný v prítomnosti inhibítorov TCS a CCCP. Prvé hodiny kultivácie nepreukázali citlivosť transportných mechanizmov uracilu na prítomnosť inhibítorov. Prekročením 13 hodiny bol už vplyv TCS a CCCP podstatne výraznejší. Oba inhibítory mali prakticky rovnaké inhibičné účinky v dobe maximálneho transportu čo bolo až po takmer 80%. Aj v neskorších hodinách sa účinky TCS a CCCP pohybovali na rovnakej úrovni a síce 70%. Jediný rozdiel bol zaznamenaný v skoršom štádiu, keď v trinástej hodine spôsobilo TCS 70% a CCCP iba 50% inhibíciu. 52

53 Transport uracilu (nmol/mg(suš)/h) Kontrola TCS CCCP 0 2,5 5 7, , doba kultivácie(h) Obr.20. Inhibícia transportných procesov uracilu prostredníctvom TCS a CCCP a porovnanie s transportom bez prídavku inhibítora v jednotlivých časoch merania. Vplyv inhibítorov sa meral pri ph 7,4. Jednotlivé inhibítory boli pridané k zmesi 5 minút pred rádioaktívne označenou látkou a ich výsledná koncentrácia bola 30 µmol/l. Do kontroly bolo namiesto inhibítorov pridané ekvivalentné množstvo MeOH Rast biomasy Prírastok biomasy pri pozorovaní transportných procesov uracilu mal odlišný priebeh ako pri cholíne. Množstvo biomasy s menšími odchýlkami bolo v podstate rovnaké až do 13 hodiny kultivácie. Potom začalo rásť. Spočiatku to bol len mierny nárast o ani nie 7%. Neskôr však už bol oveľa viac výraznejší. Medzi 13 a 22 hodinou predstavoval prírastok už takmer 30%. V 26 hodine bol síce zaznamenaný pokles v množstve, no potom pravdepodobne aj vďaka dlhšiemu časovému úseku došlo k značnému nárastu. 53

54 3,0 2,5 biomasa 2,0 m(mg/ml) 1,5 1,0 0,5 0, doba kultivácie (h) Obr.21. Rast množstva biomasy v závislosti od času kultivácie. Biomasa bola zachytávaná pomocou borosilikátovej membránky a následne vysušená do konštantnej hmotnosti Transport N-acetylglukozamínu (NAG) Zvýšený príjem N-acetylglukozamínu, prvku potrebného pre syntézu bunkovej steny, bol spozorovaný už po uplynutí 10 hodín kultivácie, čiže od času začatia tvorby prvých klíčkov. Počas ďalších hodín kultivácie dochádzalo k neustálemu zvyšovaniu transportu NAG do buniek. Rozdiely v rozsahu transportov pri jednotlivých odberoch v rozmedzí 13 a 26 hodiny kultivácie sa pohyboval na úrovni 15%. Tento nárast transportu N-acetylglukozamínu je porovnateľný aj s prírastkom biomasy, keď v rovnakom časovom úseku bol nárast biomasy v jednotlivých odberoch na úrovni 20%. Príjem NAG pravdepodobne aj naďalej rástol. Tento predpoklad potvrdzuje aj fakt, že najviac NAG prijatého bunkami bolo na konci kultivácie, teda po 48 hodinách. V tomto štádiu kultivácie boli bunky schopné prijať o 70% viac NAG oproti predchádzajúcemu odberu v 26 hodine. 54

55 Transport N-acetylglukozamínu (nmol/mg(suš)/h) 0,6 0,3 0,0 cccp TCS kont doba kultivácie (h) Obr.22. Transport NAG konídiami v závislosti od času kultivácie a vplyv inhibítorov na transportné procesy. Transport sa meral pri ph 6 dosiahnutého pomocou tlmivého roztoku 1% NaCl v 20 mmol/l Tris-maleát. Koncentrácia NAG v reakčnej zmesi bola 200 µmol/l a odpojovačov (TCS, CCCP) 30 µmol/l. Jednotlivé odpojovače boli pridané k reakčnej zmesi 5 minút pred rádioaktívnou látkou, ktorej špecifická rádioaktivita bola 1374 CPM/nmol Vplyv inhibítorov na transport Rovnako ako v predchádzajúcich prípadoch, aj pri NAG sme zisťovali vplyv odpojovačov TCS a CCCP na transport do buniek. Zo získaných výsledkov vyplýva, že rovnako ako pri uracile, tak aj pri transporte NAG je pôsobenie týchto látok pomerne významné a podstatne ovplyvňujú jeho príjem bunkami. Rovnako ako pri uracile, tak aj pri N- acetylglukózamíne sa inhibícia transportu pohybovala na úrovni okolo 70% percent pre TCS. CCCP malo dokonca ešte o niečo väčší účinok a inhibícia ním dosiahla aj viac ako 75%. Maximálny účinok však inhibítory dosiahli na konci kultivácie, kedy bol aj najväčší transport NAG. Tvoriace sa mycélium prakticky nebolo schopné prijať žiaden NAG v prítomnosti TCS a CCCP. Ich účinok sa totiž pohyboval až na úrovni 90%. 55

56 Transport N-acetylglukozamínu (nmol/mg(suš)/h) 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0, ,5 5 7, , doba kultivácie (h) Kontrola TCS CCCP Obr.23. Inhibícia transportných procesov NAG prostredníctvom TCS a CCCP a porovnanie s transportom bez prídavku inhibítora v jednotlivých časoch merania. Vplyv inhibítorov sa meral pri ph 6. Jednotlivé inhibítory boli pridané k zmesi 5 minút pred rádioaktívne označenou látkou a ich výsledná koncentrácia bola 30 µmol/l. Do kontroly bolo namiesto inhibítorov pridané ekvivalentné množstvo MeOH Rast biomasy Biomasa pri transportoch NAG si udržiavala takmer konštantné množstvo až do 16 hodiny kultivácie. K miernemu nárastu prišlo len po 2 hodinách kultivácie. Od 16 do 26 hodiny však začalo množstvo biomasy narastať o približne 5% za hodinu. Medzi 26 a 48 hodinou sa množstvo vytvorenej biomasy za hodinu začalo zväčšovať na úroveň približne 14%/hod. 56

57 3,0 2,5 biomasa 2,0 m(mg/ml) 1,5 1,0 0,5 0, doba kultivácie (h) Obr.24. Rast množstva biomasy v závislosti od času kultivácie. Biomasa bola zachytávaná pomocou borosilikátovej membrány a následne vysušená do konštantnej hmotnosti. 57

58 5.4 Identifikácia primárne sa exprimujúcich génov počas prvých fáz klíčenia Vo svojej práci som sa taktiež venoval izolácii mrna z konídií a tiež pokusu o vytvorenie subtraktívnej knižnice cdna. Pomocou tohto experimentu by bolo možné zistiť, ktoré gény sa exprimujú v klíčiacich konídiách ako prvé, resp. ktoré gény sa vyskytujú v konídiách už vo forme RNA. Takáto RNA by mohla slúžiť na syntézu proteínov potrebných pre skoré štádiá klíčenia. Tento projekt som však musel prerušiť kvôli tomu, že pri izolačnom postupe som nezískal dostatočne čisté preparáty mrna. Na izoláciu som používal magnetické guličky, ktoré mali oligodt koniec. Pomocou toho sa viazali na poly A konce mrna čo malo umožniť izoláciu len mrna. Napriek tomuto teoreticky istému spôsobu izolácie získané preparáty nemali požadovanú čistotu. Pri každej izolácii došlo k tomu, že spolu s mrna sa na magnetické guličky nešpecificky viazala aj DNA, ktorá by mohla predstavovať komplikácie pri príprave cdna a subtraktívnej knižnice cdna (obr. 25). Na odstránenie tejto kontaminujúcej DNA som vykonal tieto experimenty: zmena iónovej sily roztoku používaného na premytie mrna izolovanej a ukotvenej na magnetických guličkách zmena ph roztoku používaného na elúciu mrna z magnetických guličiek viacnásobná izolácia mrna v rovnakej vzorke pomocou magnetických guličiek predĺženie času pôsobenia DNA polymerázy a použitie čistiacich kolón izolácia pomocou Trizolovej extrakcie denaturácia prípadného duplexu zloženého z RNA a DNA zahriatím na 94 o C a náhlym ochladením v ľade Úspech som zaznamenal iba pri použití DNAázy, no tu nastal ďalší problém. Bolo potrebné odstrániť aj zvyšky z rozštiepenej DNA. Aj tento problém sa nakoniec podarilo vyriešiť, ale iba čiastočne. Na odstránenie zvyškov DNA som použil čistiace kolóny od spoločnosti QiaGene, avšak pri procese čistenia dochádzalo k priveľkým stratám mrna. Rozdiel izolácie s použitím kolón a bez použitia je jasne viditeľný na obrázku nižšie (obr. 25). PCR produkt zo získanej mrna je po premytí na kolónkach oveľa menej viditeľný ako produkt bez premytia. Keďže na pokračovanie projektu bolo potrebných až 2 µg čistej mrna, spôsob izolácie mrna s použitím DNAázy a čistiacich kolón nebol príliš výhodný, vzhľadom na to, že pri ňom dochádzalo k signifikantným stratám produktu. 58

59 Obr.25. Agarózová elektroforéza PCR produktov získaných z cdna. Vedľa štandardu (prvá dráha zľava) sa nachádza dráha bez vzorky. Vedľa prázdnej dráhy sa nachádza dráha so vzorkou, ktorá bola premytá na kolónkach QiaGene. Štvrtá dráha zľava obsahuje vzorku bez premytia na kolónke. Posledné dve dráhy zľava, prvej sady obsahujú vzorky, ktoré sú kontrolami kontaminácie s DNA. Ako je vidieť, kontaminujúca DNA sa vyskytovala v oboch vzorkách, a to dokonca aj po 2 hodinovej inkubácii s DNAázou. Posledné 4 vzorky majú rovnaké poradie a slúžia na kontrolu reprodukovateľnosti. Pásy viditeľné na konci dráh so vzorkami sú primery použité v procese PCR. 59