Identifikácia a ekofyziológia kokálnych zelených rias dominujúcich v zamrznutých jazerách na ostrove Jamesa Rossa (SV Antarktický polostrov)

Transcription

1 Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Studijní program: Biologie Studijní obor: Ekologie Bc. Martin Mihál Identifikácia a ekofyziológia kokálnych zelených rias dominujúcich v zamrznutých jazerách na ostrove Jamesa Rossa (SV Antarktický polostrov) Identification and ecophysiology of coccoid green algae dominating in ice-covered lakes on James Ross Island (NE Antarctic Peninsula) Diplomová práce Vedoucí závěrečné práce: RNDr. Linda Nedbalová, Ph.D. Praha, 2016

2

3 Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracoval samostatně a že jsem uvedl všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze, Podpis

4 Poďakovanie: V prvom rade by som chcel poďakovať mojej školitelke RNDr. Linde Nedbalovej, Ph.D. za čas, ochotu, trpezlivosť a cenné rady spojené s tvorbou mojej diplomovej práce. Ďalej by som chcel poďakovať Mgr. Lenke Procházkovej za pomoc nielen s fylogenetickými analýzami. Veľká vďaka patri taktiež RNDr. Jane Kvíderovej, Ph.D. za pomoc a podporu pri kultivácií na skrížených gradientoch svetla a teploty v Botanickom ústave AV ČR v Třeboni. Poďakovať by som chcel taktiež Jane Vokurkovej a RNDr. Jasne Vukič, Ph.D. za priateľské slovo, ochotu a pomoc v laboratóriu. V neposlednej rade patrí veľká vďaka mojej rodine, ktorá ma vždy podporovala vo všetkom čo robím.

5 Abstrakt Cieľom tejto práce bolo zistiť fylogenetické vzťahy, morfológické a ekofyziologické charakteristiky troch kmeňov kokálnych zelených rias z Antarktídy. Kmene A a B sú planktóne riasy dominujúce v zamrznutých jazerách na ostrove Jamesa Rossa (SV Antarktický polostrov). Tretí kmeň (Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25) bol pôvodne vyizolovaný zo zeleného ľadu na Ballenyho ostrovoch (Rossova dependencia) a jeho popis bol založený len na morfologických znakoch. Na základe fylogenetických analýz sekvencií 18S rdna, sekundárnej štruktúry ITS2 a morfológie buniek, kmene A a B patria k jednému druhu rodu Monoraphidium (Chlorophyta, Sphaeropleales, Selenastraceae), ktorý by v budúcnosti mohol byť popísaný ako nový. Je to prvá zmienka o tom, že sú kokálne zelené riasy schopné stať sa dominantnými primárnymi producentmi v extrémnom prostredí antarktických jazier s rozsiahlou ľadovou pokrývkou. Kmeň CCAP 202/25 je blízko príbuzný druhu Monoraphidium griffithii (typový organizmus rodu Monoraphidium), čo naznačuje jeho nesprávne zaradenie. Všetky tri kmene boli schopné rásť v širokom rozmedzí teplôt: 1 20 C (A a B) a 1 30 C (CCAP 202/25). Nízke nároky na intenzitu žiarenia odrážajú ich prirodzené habitaty. To spolu s relatívne vysokou rýchlosťou rastu a vysokým obsahom polynenasýtených mastných kyselín (PUFA) pri kultivácií v nízkych teplotách robí tieto kmene zaujímavými kandidátmi na využitie v biotechnológiách. kľúčové slová: Monoraphidium, Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25, zamrznuté jazerá, Antarktída, 18S rdna, ITS2, ekológia, fylogenéza, morfológia, teplota, svetlo, mastné kyseliny

6 Abstract The aim of this study was to assess the phylogenetic relationships, morphological and ecophysiological characteristics of three strains of coccoid green algae from Antarctica. The strains A and B are planktonic algae dominating in ice-covered lakes on James Ross Island (NE Antarctic Peninsula). The third strain (Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25) was originally isolated from green ice from the Balleny Islands (Ross Dependency) and its description has been based only on morphological features. According to the phylogenetic analyses of 18S rdna, ITS2 secondary structure and cell morphology, the strains A and B belong to one species of the genus Monoraphidium (Chlorophyta, Sphaeropleales, Selenastraceae) that should be described as new in the future. It is the first evidence that coccoid green algae are capable to become the dominant primary producer in the extreme environment of Antarctic lakes with extensive ice-cover. The strain CCAP 202/25 is closely related to Monoraphidium griffithii (type species of the genus Monoraphidium) suggesting its incorrect classification. All the strains were able to grow in a wide temperature gradient: 1 20 C (A and B) and 1 30 C (CCAP 202/25). Low light requirements reflected their original habitat. Together with relatively high growth rates and high content of polyunsaturated fatty acids (PUFA) when cultivating in low temperatures, it makes these isolates interesting candidates for biotechnological applications. keywords: Monoraphidium, Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25, ice-covered lakes, Antarctica, 18S rdna, ITS2, ecology, phylogeny, morphology, temperature, light, fatty acids

7 Obsah 1. Úvod Ciele práce Literárny prehľad Planktón antarktických jazier Čeľaď Selenastraceae Adaptácie rias na podmienky v antarktických jazerách Enzymatická aktivita a optimálna teplota rastu Fotosyntéza Obsah mastných kyselín Ľad viažuce proteíny Jazerá na ostrove Jamesa Rossa Metodika Študované kmene Molekulárne analýzy Fylogenetické analýzy Svetelná a elektrónová mikroskopia Skrížený gradient svetla a teploty Zloženie mastných kyselín Výsledky Fylogenetické analýzy Morfológia buniek Rastové optimá Zloženie mastných kyselín Diskusia Fylogenetická analýza a morfológia buniek Ekológia a biogeografia Zloženie mastných kyselín a biotechnológie Záver Zoznam použitej literatúry Prílohy... 57

8 1. Úvod Napriek tomu, že Antarktický kontinent je takmer celý pokrytý ľadovcom, jedným z jeho charakteristických prvkov je prekvapujúca rozmanitosť a hojnosť jazier. Od sladkovodných, brakických, slaných meromiktických, hypersaliných, epišefových až po podľadovcové jazerá (Laybourn-Parry, 2002). Okrem podľadovcových jazier, ktorých bolo do súčasnosti objavených viac než 400 (Siegert et al., 2016), sa väčšina z nich nachádza v odľadnených polárnych oázach pevninskej Antarktídy ako napríklad McMurdo Dry Valleys, Vestfold Hills, Larseman Hill, Bunger Hills, Syowa oáza a Schirmacher oáza (Verleyen et al., 2012). Odľadnené oblasti s jazerami môžeme taktiež nájsť na Antarktickom polostrove a priľahlých ostrovoch ako napríklad jazerá na ostrove Jamesa Rossa (Izaguirre et al., 2003; Nedbalová et al., 2013). Zatiaľ čo na odľadnených územiach môžeme nájsť riedke spoločenstvá lišajníkov, machov a pôdnych mikroorganizmov, obmedzená dostupnosť vody v kvapalnom skupenstve obmedzuje biologickú aktivitu počas väčšiny roku. Práve jazerá sú miestami kde je kvapalná voda dostupná počas celého roku (Laybourn-Parry, 2002). Organizmy žijúce v antarktických jazerách sú vystavené extrémnym abiotickým podmienkam ako nízka teplota, nízka intenzita žiarenia a nízka koncentrácia živín (Laybourn- Parry & Pearce, 2007). Častá ľadová a snehová pokrývka týchto jazier značne znižuje množstvo prenikajúceho slnečného žiarenia (Belzile et al., 2001). Navyše ľadová pokrývka zabraňuje pôsobeniu vetra a tým výrazne redukuje miešanie vodného stĺpca. To vážne obmedzuje taktiež transport živín zo spodných vrstiev vody do oblasti tesne pod ľadom kde je vyššia dostupnosť svetla (Vincent et al., 2008). Okrem toho fytoplanktón antarktických jazier sa musí vyrovnať s niekoľko mesačnou tmou behom zimy, počas ktorých sa slnko neobjavuje nad horizontom (McKnight et al., 2000). Na prežitie tohto obdobia populácie fytoplanktónu využívajú rad mechanizmov ako je tvorba kľudových štádií, mixotrofná výživa alebo akumulácia zásobných látok. Z ďalších mechanizmov umožňujúcich život pri nízkych teplotách môžeme uviesť akumuláciu polynenasýtených mastných kyselín (PUFA) v bunečných membránach, enzýmy s vyššou špecifickou aktivitou pri nízkych teplotách alebo produkciu extracelulárnych látok medzi ktoré patria takzvané ľad viažuce proteíny (D'Amico et al., 2002; Chintalapati et al., 2004; Raymond & Kim, 2012). Pre tieto jazerá sú typické skrátené potravné reťazce, v ktorých dominujú mikroorganizmy (Laybourn-Parry & Pearce, 2007; Laybourn-Parry, 2009). Vo fytoplanktóne antarktických jazier dominujú najmä bičíkaté druhy z tried Chrysophyceae, Chlorophyceae, 1

9 Prasinophyceae a Cryptophyceae (Izaguire et al., 2001; Marshall & Laybourn Parry, 2002; Bell & Laybourn Parry, 2003). Z prírodných vzoriek dvoch zamrznutých jazier odobraných na ostrove Jamesa Rossa, boli vyizolované dva kmene kokálnych zelených rias, ktoré tam tvorili dominantnú zložku fytoplanktónu. Dominancia zelených kokálnych rias v jazerách s rozsiahlou ľadovou pokrývkou je neobvyklá a práve preto sa im venuje táto diplomová práca. Tieto dva kmene boli doplnené o tretí málo známy kmeň kokálnej zelenej riasy Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 vyizolovaný taktiež v Antarktíde, ktorý by mohol poskytnúť zaujímavé porovnanie. Okrem všeobecného ekologického záujmu o diverzitu a adaptačné mechanizmy na extrémne podmienky, záujem o tieto mikroorganizmy adaptované na chlad je spojený s ich potenciálnym využitím v biotechnológiách. Tieto organizmy môžu byť zdrojom cenných látok pre tento priemysel ako napríklad PUFA, enzýmy adaptované na nízke teploty alebo proteíny zabraňujúce zmrznutiu (Griffith & Ewart, 1995; Cavicchioli et al., 2011; Ahn et al., 2012). 2

10 1.1. Ciele práce Cieľom tejto diplomovej práce je s využitím takzvaného polyfázického prístupu popísať tri kmene zelených kokálnych rias pochádzajúce z Antarktídy. Dva kmene boli novo vyizolované zo zamrznutých jazier na ostrove Jamesa Rossa, kde tvorili dominantnú zložku fytoplanktónu. Tretí kmeň (Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25) bol získaný zo vzoriek zeleného ľadu z Ballenyho ostrovov a okrem morfologických údajov nie je o ňom nič známe. Čiastkové ciele práce sú nasledujúce: 1. Identifikovať taxonomické postavenie kmeňov na základe molekulárnej analýzy (18S rdna, ITS2 rdna) a popísať ich fylogenetické vzťahy. Predpokladáme, že vzhľadom k doteraz pozorovaným morfologických znakom naznačujúcim príslušnosť týchto troch kmeňov k čeľadi Selenastraceae, molekulárne analýzy potvrdia a spresnia toto zaradenie. 2. Popísať ich morfologické znaky pomocou svetlenej a elektrónovej mikroskopie a porovnať s morfológiou príbuzných doteraz publikovaných druhov. Očakávame, že morfologické znaky dvoch novo vyizolovaných kmeňov z ostrova Jamesa Rossa nebudú odpovedať žiadnemu z doteraz popísaných druhov. 3. Určiť teplotné a svetelné optimá a hranične limity rastu týchto kmeňov. Vzhľadom k pôvodu týchto troch kmeňov očakávame, že teplotné a svetelné optimá budú posunuté smerom k nižším hodnotám. 4. Analyzovať zloženia mastných kyselín pri nízkej teplote a nízkej intenzite žiarenia. Jednou z adaptácií psychrofilných a psychrotrofných organizmov na prostredie s nízkymi teplotami je akumulácia polynenasýtených mastných kyselín. Hypotézou je, že tieto kmene kultivované pri nízkych teplotách budú obsahovať vysoký podiel týchto kyselín. 3

11 2. Literárny prehľad 2.1. Planktón antarktických jazier Polárne oblasti dostávajú v porovnaní s oblasťami v nižších zemepisných šírkach značne nižšie množstvo dopadajúceho fotosynteticky aktívneho žiarenia (PAR) (Campbell & Aarup, 1989). Tento efekt je ešte umocnený snehovou a ľadovou pokrývkou jazier (Belzile et al., 2001). Jazerá v McMurdo Dry Vallyes sú trvalo pokryté ľadom, ktorý výrazne znižuje množstvo prechádzajúceho slnečného žiarenia. Napríklad v jazere Bonney dosahovala behom letnej sezóny intenzita PAR tesne pod ľadom 1,8 3,3 % celkového slnečného žiarenia dopadajúceho na povrch jazera (Lizotte & Priscu, 1992). Oproti tomu ľadová pokrývka väčšiny sladkovodných a brakických jazier v pobrežných oázach Antarktídy je priehľadnejšia a tenšia (Henshaw & Laybourn-Parry, 2002). Okrem toho strácajú aspoň časť ľadovej pokrývky na niekoľko týždňov behom leta podobne ako aj jazerá v oblasti Antarktického polostrova (Izaguirre et al., 2003). Avšak tieto jazerá môžu byť občasne alebo pravidelne pokryté snehom, čo výrazne znižuje množstvo prenikajúceho PAR do vodného stĺpca (Hawes, 1985; Henshaw & Laybourn-Parry, 2002). Ľadová pokrývka navyše zabraňuje pôsobeniu vetra a tým výrazne redukuje miešanie vodného stĺpca. To vážne obmedzuje taktiež transport živín zo spodných vrstiev vody do oblasti tesne pod ľadom kde je vyššia dostupnosť svetla (Vincent et al., 2008). Antarktické jazerá sú prevažne oligotrofné až ultra-oligotrofné (Laybourn-Parry & Pearce, 2007). Výnimku tvoria niektoré jazerá v pobrežných oblastiach ovplyvnené prísunom živín spojeným s aktivitou živočíchov v ich okolí ako napríklad kolóniami tučniakov (Izaguirre et al., 2003). Trvalo nízka teplota v kombinácií s obmedzenou dostupnosťou svetla a živín má významný vplyv na život v tomto prostredí. Ako môžeme vidieť na Obr. 1, jazerá majú skrátené potravné reťazce, v ktorých dominujú prvoky, riasy a baktérie (Roberts & Laybourn Parry, 1999; Laybourn-Parry & Pearce, 2007). V poslednej dobe sa venuje zvýšená pozornosť vírusom, ktoré môžu mať významný vplyv na kolobeh uhlíku v týchto mikroorganizmami dominujúcich ekosystémoch (Säwström et al., 2008). Nežijú tu žiadne ryby a len pár mnohobunečných bezstavovcov. V jazerách Dry Valley zvyčajne nenájdeme žiadne kôrovce ale len niekoľko vírnikov patriacich k rodu Philodina (Laybourn-Parry et al., 1997). V menej extrémnych podmienkach pobrežných oáz sa vyskytuje perloočka Daphniopsis studeri, veslonôžka Paralabidocera antarctica a niekoľko druhov vírnikov 4

12 (Bell & Laybourn-Parry, 1999; Laybourn-Parry et al., 2005). V oblasti Antarktického polostrova je bežnou súčasťou planktónu perloočka Boeckelia poppei (Izaguirre et al., 2003). Obr. 1. Typická štruktúra potravného reťazca antarktických jazier. Príklad konkrétne zobrazuje sladkovodné alebo brakické jazero v oblasti Vestfold Hills (Laybourn-Parry & Pearce, 2007). Dominantnú zložku rias antarktických jazier často tvoria bičíkaté druhy z tried Chrysophyceae, Chlorophyceae, Prasinophyceae a Cryptophyceae (Izaguire et al., 2001; Marshall & Laybourn Parry, 2002; Bell & Laybourn Parry, 2003). Prítomnosť bičíku dáva týmto organizmom schopnosť migrácie a tým možnosť upraviť svoju pozíciu vo vodnom stĺpci (Priscu & Neale, 1995). Kryptomonády (Cryptophyceae) sú veľmi rozšírenou skupinou rias v antarktických jazerách. V jazere Hoare (Dry Valleys) tvorili viac než 87 % celkovej biomasy fototrofných bičíkovcov (Roberts et al., 2004). Kryptomonády v týchto jazerách vykazujú silnú závislosť na mixotrofii. Štúdia porovnávajúca množstvo uhlíku získaného fotosyntézou a toho získaného požieraním baktérií ukázala, že kryptomonády sú závislé na mixotrofnej výžive aj počas letnej sezóny. V jazere Fryxell bola závislosť na spásaní najvýraznejšia na úrovni hlbokého chlorofylového maxima, kde spoločenstvo kryptomonád získavalo 24 % uhlíku prostredníctvom požierania baktérií (Marshall & Laybourn Parry, 2002). Pyramimonas gelidicola (Prasinophyceae) je typickou súčasťou planktónu jazier v oblasti Vestfold Hills. Vykazuje značnú nutričnú mnohostrannosť. Kým v meromiktickom jazere Ace je schopný požierať baktérie, v susednom brakickom jazere Highway namiesto požierania baktérií prijíma len rozpustený organický uhlík (DOC). Uprednostnenie DOC 5

13 môže byť výsledkom kompetičného boja s kryptomonádamy a heterotrofnými bičíkovcami o baktérie (Bell & Laybourn Parry, 2003; Laybourn-Parry et al., 2005). V oligotrofných jazerách v oblasti Hope Bay (Antarktický polostrov) dominuje trieda Chrysophyceae, do ktorej patrí Ochromonas sp. (Izaguirre et al., 1998; Allende & Izaguirre, 2003). Ochromonas sp. patrí do skupiny organizmov, ktorých primárnym spôsobom výživy je heterotrofia a fototrofiu zapájajú, len keď je ich heterotrofný rast limitovaný koncentráciou koristi (Andersson et al., 1989; Jones, 2000). Ako môžeme vidieť mixotrofia je veľmi rozšírenou a dôležitou adaptačnou stratégiou v prostredí antarktických jazier. Umožňuje týmto organizmom získavať živiny na podporu fotosyntézy alebo dodatočný uhlík na doplnenie autotrofnej výživy počas limitácie svetlom a živinami (Caron et al., 1990; Nygaard & Tobiesen, 1993). Oproti tomu obligátne fotoautotrofné organizmy musia disponovať inou adaptačnou stratégiou aby prežili v týchto podmienkach. Napríklad Chlamydomonas raudensi (Chlorophyceae) nie je schopný mixotrofnej výživy (Morgan-Kiss et al., 2006) ale disponuje unikátnym fotochemickým aparátom, ktorý dokáže efektívne zachytávať svetlo aj v extrémne slabých svetelných podmienkach (Morgan et al., 1998; Morgan-Kiss et al., 2005). To mu umožňuje žiť a dominovať v hlbokej fotickej zóne jazera Bonney kde je vyššia dostupnosť živín (Priscu & Neale, 1995). Zástupcovia rodu Chlamydomonas sú rozšírený naprieč antarktickými jazerami (Izaguirre et al., 2003; Thurman et al., 2012). Vo fytoplanktóne antarktických jazier môžeme nájsť aj ďalšie organizmy. Výskyt fotosyntetizujúcich obrneniek Gymnodinium sp. a Gyrodinium sp. bol zaznamenaný v jazerách v oblasti Vestfold Hills a na ostrove Signy začiatkom letnej sezóny (Butler et al., 2000; Laybourn-Parry et al., 2002). Desmídie sa bežne nevyskytujú v antarktických jazerách avšak členovia rodu Cosmarium boli pozorovaný v planktóne jazier v oblasti Larsemann Hills a súostrovia Južné Shetlandy (Ellis-Evan et al., 1998; Unrein & Vinocur, 1999). Rozsievky sú často pozorovanou zložkou fytoplanktónu v jazerách prímorskej Antarktídy. Medzi bežné rody patria Fragilaria, Pinnularia, Navicula, Nitzschia, Achnanthes a Gomphonema, pričom väčšina z nich je pravdepodobne bentického pôvodu (Izaguirre et al., 2003; Unrein et al., 2005; Toro et al., 2007). Ďalšou skupinou sú sinice, ktoré tvoria dominantu bentosu ale môžeme ich nájsť aj ako súčasť planktónu. Medzi najčastejšie pozorované rody v jazerách prímorskej Antarktídy patria Oscillatoria, Leptolyngya, Phormidium (Unrein & Vinocur, 1999; Izaguirre et al., 2001). Ich prítomnosť v planktóne jazier kontinentálnej Antarktídy je zriedkavá. Výskyt rodu Phormidium bol pozorovaný v jazerách Hoare a Fryxell (Marshall & Laybourn Parry, 2002). Pikosinice sú veľmi malé (< 2 µm) solitérne sinice. Štúdiu týchto 6

14 organizmov v antarktických jazerách nebola venovaná veľká pozornosť aj keď sú pravdepodobne hojne rozšírené. Patrí medzi ne rod Synechococcus, ktorý bol pozorovaný v jazerách prímorskej a kontinentálnej Antarktídy. V týchto jazerách tvorili pikosinice významnú zložku fytoplanktónu (Allende & Izaguirre, 2003; Powell et al., 2005; Toro et al., 2007) Čeľaď Selenastraceae Zástupcovia tejto čeľade sú veľmi bežnou súčasťou sladkovodného fytoplanktónu a vykazujú veľkú morfologickú variabilitu (Krienitz & Bock, 2012). Môžeme ich nájsť aj v antarktických jazerách, kde môžu tvoriť dokonca dominantnú zložku fytoplanktónu ako napríklad Ankistrodesmus falcatus v jazere Tranquil na ostrove Signy (Butler et al., 2000). Ďalšie druhy ako Monoraphidium contortum, M. minutum, M. griffithii sú súčasťou fytoplanktónu jazier Antarktického polostrova, kde sa môžu rozvinúť behom priaznivých podmienok do občasných maxím (Izaguirre et al., 2001; Izaguirre et al., 2003). Bežne pozorované rody z tejto čeľade ako Ankistrodesmus, Monoraphidium, Selenastrum, Kirchneriella sú vo všeobecnosti solitérne alebo tvoria kolónie, ich bunky sú vretenovitého tvaru, rovné alebo zahnuté s ostrými alebo oblými koncami. Jednou z hlavných charakteristík tejto čeľade je ich spôsob reprodukcie výhradne pomocou autospór (Krienitz et al., 2001). Medzi morfologické znaky bežne využívané v taxonómií tejto čeľade patrí tvorba kolónií, tvar buniek, usporiadanie autospór v materskej bunke alebo štruktúra pyrenoidu (Krienitz et al., 2001). Fawley et al. (2005) porovnal morfologické znaky niekoľkých druhov z čeľade Selenastraceae s ich molekulárnymi charakteristikami. Niektoré kmene, ktoré boli na základe morfologických znakov identifikované ako rovnaké druhy v skutočnosti patrili k rozdielnym vývojovým vetvám v rámci čeľade Selenastraceae, zatiaľ čo iné kmene s identickými alebo takmer identickými sekvenciami 18S rdna mali pomerne odlišnú morfológiu. Tieto dáta ukazujú, že použitie morfologického konceptu druhu na túto čeľaď malo za následok podcenenie jej druhovej diverzity a mohlo viesť v mnohých prípadoch k nesprávnej identifikácií jednotlivých druhov, a tým pádom k nesprávnym záverom ohľadne ich ekológie a rozšírenia. Výsledky výskumu Krienitz et al. (2011) len potvrdzujú pochybnosti ohľadne taxonomickej hodnoty bežne využívaných morfologických znakov v rámci tejto čeľade. Čeľaď Selenastraceae je považovaná za monofyletickú. Na základe molekulárnych štúdií založených na sekvenciách 18S rdna, bolo v tejto čeľadi potvrdených desať odlišných 7

15 rodov. Niekoľko ďalších rodov musí byť ešte podrobených detailnému molekulárnemu skúmaniu, výsledkom ktorého môže byť popis nových rodov. To je obzvlášť prípad príbuzných z rodov Ankistrodesmus s.l. a Monoraphidium s.l., ktorých môžeme nájsť v niekoľkých odlišných vývojových vetvách a pravdepodobne predstavujú rozdielne rody (Krienitz et al., 2011; Krienitz & Bock, 2012) Adaptácie rias na podmienky v antarktických jazerách Enzymatická aktivita a optimálna teplota rastu Psychrofilné enzýmy sa vo všeobecnosti vyznačujú vysokým stupňom štrukturálnej flexibility, nižšou teplotnou stabilitou a vyššou špecifickou aktivitou pri nízkych teplotách v porovnaní s ich mezofilnou obdobou (D'Amico et al., 2002). Niekoľko štúdií ukazuje druhy polárnych rias, ktoré majú enzýmy adaptované na nízke teploty. Loppes et al. (1996) skúmal teplotnú závislosť a teplotnú stabilitu nitrát reduktázy a argininsukcinát lyázy z psychrofilnej riasy Chloromonas sp. (ANT1). Obidva psychrofilné enzýmy vykazovali posun maximálnej enzymatickej aktivity do nižších teplôt. Konkrétne, argininsukcinát lyáza vykazovala 25 % svojej maximálnej aktivity pri teplote 5 C, zatiaľ čo enzým vyizolovaný z mezofilnej riasy Chlamydomonas reinhardtii pri tejto teplote bol úplne neaktívny. Obidva psychrofilné enzýmy taktiež vykazovali nižšiu termálnu stabilitu v porovnaní s mezofilnými. Posun maximálnej enzymatickej aktivity nitrát reduktázy do nižších teplôt bol pozorovaný taktiež u zelenej riasy Koliella antarctica (Di Martino Rigano et al., 2006). Oproti tomu, optimálna teplota pre aktivitu ribulosa-1,5-bisfosfát karboxylázy/oxygenázy (RUBISCO), jedného z najzásadnejších enzýmov fixácie anorganického uhlíku fotosyntetickými organizmami, bola pre psychrofilné a mezofilné RUBISCO podobná a pohybovala sa medzi C. V celom rozpätí teplôt pokusu (0 70 C) bola špecifická aktivita mezofilného enzýmu významne vyššia v porovnaní s psychrofilným. Dokonca pri teplote 0 C, aktivita mezofilného enzýmu bola 1,4 až 2 krát vyššia než psychrofilného (Devos et al., 1998). Ďalšou stratégiou, ktorú psychrofilovia môžu využívať aby prekonali nízku rýchlosť obratu špecifických enzýmov v dôležitých metabolických dráhach je zvýšenie ich koncentrácie. Devos et al. (1998) pozorovali u dvoch psychrofilných druhoch Chloromonas sp. (ANT1, ANT3) kultivovaných pri teplote 5 C dvakrát vyššiu koncentráciu enzýmu RUBISCO než u mezofilných druhov Chloromonas paraserbinowii a Chlamydomonas moewusii, kultivovaných pri teplote 25 C. Toto bolo pozorované taktiež u zelenej riasy Chlorella vulgaris, ktorá obsahovala 2 3 krát viac enzýmu RUBISCO, keď rástla pri teplote 8

16 5 C ako pri 27 C (Savitch et al., 1996). Rovnaký trend bol zaznamenaný aj u psychrofilného druhu Chlamydomonas raudensis UWO241, keď pri teplote 2 C bol obsah enzýmu RUBISCO o 40 % vyšší než pri 8 C (Dolhi, 2014). Napolitano & Shain (2004, 2005) popísali ďalšiu možnú kompenzačnú stratégiu na udržanie dostatočnej rýchlosti biochemických reakcií pri nízkej teplote u psychrofilných organizmov. Títo autori zaznamenali relatívne vysokú hladinu ATP (adenozíntrifosfátu) u psychrofilných organizmov a táto hladina sa zvyšovala s klesajúcou teplotou. Takýto nárast pravdepodobne dokáže vykompenzovať znižovanie rýchlosti difúzie pri poklese teploty a umožňuje udržať dostatočne vysokú koncentráciu ATP požadovanú pre aktivitu enzýmov, ktoré katalyzujú endergonické (biosyntetické) reakcie. S týmto súvisí aj rozmedzie teplôt pri, ktorom sú tieto organizmy schopné rásť. Na Obr. 2 môžeme vidieť porovnanie špecifických rastových rýchlostí jednotlivých druhov rodu Chlamydomonas žijúcich v antarktickej, temperátnej a tropickej oblasti. U antarktického druhu došlo k posunu optimálnej teploty rastu do nižších teplôt (6 9 C) (Teoh et al., 2013). Obr. 2. Graf ukazuje špecifické rastové rýchlosti (µ) založené na meraní optickej hustoty (OD 620 ) pri rôznych teplotách u zástupcov rodu Chlamydomonas žijúcich v antarktickej ( ), temperátnej ( ) a tropickej oblasti ( ) (Teoh et al., 2013). Podobné teplotné optimá boli zaznamenané u Chlamydomonas raudensis UWO241 (8 C) a Chlorela sp. BI (10 C) pričom tieto organizmy neboli schopné rás pri teplote nad 20 C (Morgan-Kiss et al., 2006; Morgan-Kiss et al., 2008). Seaburg et al. (1981) pozorovali schopnosť rastu planktónych zelených rias Chlamydomonas intermedia, Chlamydomonas subcaudata, Chloromonas alpina v teplotnom rozmedzí 1 C až 18 C. Ich optimálna rastová teplota sa pohybovalo okolo 15 C čo je teplota podstatne vyššia než tá, ktorej sú vystavený v ich prirodzenom životnom prostredí. Práve schopnosť rásť pri nízkych teplotách 9

17 mimo ich optimálnu teplotu rastu je pre prežitie týchto organizmov v prostredí antarktických jazier rozhodujúce Fotosyntéza Schopnosť efektívne zachytávať energiu svetla, ktorá poháňa produkciu organických zlúčenín uhlíka a zároveň vyhnúť sa potenciálne oxidačným účinkom absorbovaných ale nevyužitých fotónov je rozhodujúce pre prežitie všetkých fotosyntetických foriem života na Zemi. Fotosyntetické organizmy v ich prirodzenom prostredí musia reagovať na variabilitu fotosynteticky aktívneho žiarenia (PAR) naprieč širokou časovou škálou. Organizmy si museli vyvinúť adaptívne stratégie ako sa vyrovnať s touto variabilitou a zabezpečiť rovnováhu medzi energiou zachytenou fotochemickým aparátom a energiou využitou nadväzujúcimi metabolickými procesmi (Demming-Adams et al., 2012). Práve prostredie s nízkou teplotou poskytuje jedinečnú výzvu pre fotosyntetické organizmy, pretože primárne fotochemické deje ako zachytenie fotónov a separácia náboja sú teplotne nezávislé, kým rýchlosť enzymaticky katalyzovaných reakcií Kelvinového cyklu a iných metabolických procesov sa znižuje s klesajúcou teplotou (Ensminger et al., 2006). Často vysoká účinnosť fotosyntetického aparátu týchto organizmov spôsobuje, že saturácia fotosyntézy môže nastať aj pri veľmi nízkej intenzite žiarenia (Neale & Priscu, 1998). Typickou reakciou na zvýšenie excitačného tlaku, ktorý spôsobuje absorpcia nadbytočného žiarenia, je zníženie množstva chlorofylu a zvýšená syntéza pigmentov xantofylového cyklu. Pigmenty xantofilového cyklu umožňujú odvádzať prebytočnú svetelnú energiu v podobe tepla (Maxwell et al., 1994; Niyogi et al., 1997). Oproti tomu Chlamydomonas raudensis UWO 241 disponuje iným aklimatizačným mechanizmom. Pri optimálnej teplote rastu (8 C) reaguje na zvýšenú intenzitu žiarenia zvýšením rýchlosti rastu, čím odvádza prebytočnú energiu (Morgan-Kiss et al., 2006). Fytoplanktón antarktických jazier sa musí vyrovnať s niekoľko mesačnou tmou behom zimy, počas ktorých sa slnko neobjavuje nad horizontom (McKnight et al., 2000). Na prežitie tohto obdobia populácie fytoplanktónu využívajú rad mechanizmov ako je tvorba kľudových štádií, mixotrofná výživa alebo akumulácia zásobných látok. Tvorba cýst bola pozorovaná u Pyramimonas gelidicola a obrneniek (Gyrodinium sp. a Gymnodinium sp.) (Bell & Laybourn-Parry, 1999). McKnight et al. (2000) zaznamenali behom zimy veľké množstvo škrobu alebo inej zásobnej látky v bunkách zelenej riasy Chlorella sp. Oproti tomu dva druhy kryptomonád boli v porovnaní s letnou sezónou početnejšie behom zimy. McKnight et al. (2000) interpretujú nárast ich populácie ako dôkaz heterotrofného rastu behom zimy. 10

18 Mixotrofia a akumulácia zásobných látok umožňuje bunkám behom zimy zostať vo vegetatívnom štádiu oproti prechodu do kľudového štádia a tým pádom môžu rýchlo zareagovať na príchod priaznivých podmienok počas krátkej letnej sezóny (Roberts & Laybourn Parry, 1999). Ako bolo už naznačené, kľúčovým predpokladom úspešného prežitia mikroorganizmov v antarktických jazerách je vstup do krátkej letnej sezóny s aktívne rastúcou populáciou (Laybourn-Parry, 2002). Zmena svetelných podmienok by taktiež vyžadovala adaptačný a aklimatizačný mechanizmu, ktorý by umožňoval účinnú fotosyntézu krátko po tom čo sa fotosynteticky aktívne žiarenie stane opäť dostupným behom prechodu do letnej sezóny (Morgan-Kiss et al., 2006). Morgan-Kiss et al. (2006) vytvorili model rýchleho zapojenia fotosyntetického aparátu u Chlamydomonas raudensis UWO241 behom prechodu medzi trvalou tmou počas zimy a dostupnosťou svetla v lete. Ich model navrhuje, že behom tohto prechodu dochádza k funkčnému posunu u svetlo zachycujúceho komplexu II (LHCII) z úlohy odvádzania energie k úlohe účinného prenosu svetelnej energie. Autori predpokladajú, že bunky si zachovávajú relatívne vysokú úroveň fotochemického aparátu behom zimy, podobne ako vždyzelené stromy (Öquist & Huner, 2003). Tento model zimnej adaptácie fotosyntetického aparátu bol nedávno testovaný v sérií pokusov, ktoré sledovali reakcie kultúr Chlamydomonas raudensis UWO241 transplantovaných naspäť do ich prirodzeného životného prostredia (jazero Bonney, Dry Valleys) v špeciálnych dialyzačných trubiciach. Ako odpoveď na zníženie dostupnosti svetla behom sezónneho prechodu medzi antarktickým letom a zimou transplantované kultúry vykazovali zníženie expresie génov kódujúcich proteíny zásadné pre fixáciu uhlíku a fotochemické reakcie (rbcl - kóduje veľkú podjednotku proteínu RubisCO [LSU]; psba - kóduje hlavný proteín reakčného centra fotosystému II [D1]). Na rozdiel od expresie génov, hladina proteínu LSU klesala plynule počas prechodu k polárnej noci, kým úroveň D1 zotrvávala relatívne konštantná (Morgan-Kiss et al., 2016). Tieto výsledky sú v súlade s modelom zimnej adaptácie vytvoreným pre Chlamydomonas raudensis UWO241 (Morgan- Kiss et al., 2006), ktorý predpovedal, že fixácia CO 2 bude klesať so znižujúcou sa dostupnosťou fotosynteticky aktívneho žiarenia, zatiaľ čo si bunky budú zachovávať stabilnú úroveň hlavných proteínov fotochemických reakcií aj behom polárnej zimy. Zachovanie fotosyntetického aparátu by bola adaptívna výhoda a dôležitý mechanizmus prežívania u obligátne fototrofných organizmov v prostredí s krátkou letnou sezónou a taktiež 11

19 v konkurencií s inými organizmami schopnými mixotrofnej výživy, ktoré môžu pokračovať v získavaní uhlíku a energie aj pri absencii svetla (Laybourn-Parry, 2002) Obsah mastných kyselín Nízka teplota znižuje fluiditu bunečných membrán a spôsobuje ich tuhnutie. Fluidita membrány ovplyvňuje jej funkciu selektívne bariéry a taktiež ovplyvňuje v nej zakotvené proteíny, ktoré sa zúčastňujú transportných, signalizačných, energetický a ďalších procesov. A preto zachovanie fluidity bunečných membrán je rozhodujúce pre ich správnu funkciu. Najčastejšími zmenami v reakcii na nízku teplotu sú desaturácia a skrátenie dĺžky reťazcov mastných kyselín membránových lipidov. Výsledkom je zvýšenie fluidity bunečnej membrány a zníženie teploty pri ktorej dochádza k jej prechodu z fázy tekutého kryštálu do gélovej fázy (Chintalapati et al., 2004; Morgan-Kiss et al., 2006). Zvýšená koncentrácia polynenasýtených mastných kyselín (PUFA) je jedným z najlepšie dokumentovaných mechanizmov chladovej tolerancie a bola zaznamenaná u polárnych zelených rias, obrneniek a rozsievok (Morgan-Kiss et al., 2002; Thomson et al., 2004; Teoh et al., 2013). Práca Morgan-Kiss et al. (2002) ukazuje, že modelový psychrofilný druh Chlamydomonas raudensis UWO241 má neobvyklé polynenasýtené mastné kyseliny, u ktorých je dvojitá väzba medzi atómami uhlíku posunutá bližšie k hlavičke lipidu. Táto zmena v pozícií dvojitej väzby je pravdepodobne z dôvodu zväčšenia oblasti, ktorú zaberajú reťazce mastných kyselín, a tým zvýšenia fluidity membrán (Dolhi et al., 2013). Existujú aj výnimky medzi, ktoré patrí napríklad Chlorella sp. BI, psychrofilný druh, vyizolovaný z biofilmu antarktického vysychajúceho jazera, ktorý vykazuje úroveň nenasýtených mastných kyselín porovnateľnú s mezofilnými príbuznými. Podľa Morgan-Kiss et al. (2008), Chlorela sp. BI pravdepodobne využíva iný mechanizmus na zachovanie fluidity membrán ako napríklad zmeny v polárnej hlavičke lipidu alebo zmeny pomeru membránových proteínov a lipidov. Rozdiel môže byť spôsobený odlišnými podmienkami pre život. Chlorela sp. BI, na rozdiel od Chlamydomonas raudensis UWO241, je schopná rásť v tme a na vhodnom zdroji organického uhlíku, čo odpovedá mixotrofným podmienkam v biofilme. Každopádne, vysoká koncentrácia nenasýtených mastných kyselín v rámci fotosyntetických membrán môže byť zásadná pre obligátne fotoautotrofné organizmy akým je Chlamydomonas raudensis UWO241, žijúci v jazerách s celoročnou ľadovou pokrývkou (Dolhi et al., 2013). Štúdia Mock & Kroon (2002) ukazuje až 50% nárast špecifických PUFA asociovaných s membránou tylakoidov u kultúry rozsievok vyizolovaných z morského ľadu rastúcich pri teplote 1 C a intenzite žiarenia 2 µmol m 2 s 1 oproti kultúre rastúcej pri 12

20 15 µmol m 2 s 1. Tieto špecifické PUFA zvyšujú fluiditu membrán tylakoidov a tým aj tok elektrónov. Takže zvýšená koncentrácia PUFA môže byť odpoveďou nielen na nízku teplotu ale taktiež na nízku intenzitu žiarenia Ľad viažuce proteíny Ďalším mechanizmom ochrany buniek pred nepriaznivým vplyvom nízkych teplôt a mrazu je produkcia extracelulárnych látok medzi ktoré patria takzvané ľad viažuce proteíny (ice-bindig proteins, IBPs). Fylogenetické analýzy naznačujú, že polárne riasy mohli gény pre IBPs získať prostredníctvom horizontálneho génového prenosu z baktérií (Raymond & Kim, 2012; Raymond & Morgan-Kiss, 2013). IBPs sú schopné zabrániť rekryštalizácií ľadu, procesu tvorby veľkých ľadových kryštálov na úkor malých, a tým chrániť bunky pred mechanickým poškodením (Raymond & Fritsen, 2001). IBPs sú pravdepodobne schopné taktiež ovplyvniť tvorbu ľadu. Pri pokusoch, zamrznuté kultivačné médium obsahujúce prírodnú koncentráciu IBPs bolo nepriehľadné a malo jemnú štruktúru, pričom čisté médium bolo polopriehľadné a malo hrubú štruktúru. To naznačuje, že IBPs zapríčinilo vznik menších dutín pri tvorbe ľadu. Tieto malé dutiny so soľným roztokom sú viac odolné voči odvodneniu, takže IBPs pravdepodobne napomáhajú zachovávať kvapalné prostredie v lade (Raymond et al., 2009; Raymond & Kim, 2012; Raymond & Morgan-Kiss, 2013). Produkcia IBPs bola popísaná aj u Chlamydomonas raudensis UWO241, ktorý sa vo svojom hlavnom životnom prostredí (eufotická vrstva vody v trvalo zamrznutom jazere) nedostáva priamo do kontaktu s ľadom. Podľa Raymond & Morgan-Kiss (2013), sa môžu bunky Chlamydomonas raudensis UWO241 dostávať na povrch jazera spolu s mikrobiálnym biofilmom pri ablácií okrajových častí ľadu. Na povrchu sú vystavené mrazu a vetru a tak by produkcia IBPs mohla mať význam pre ich prežívanie a šírenie medzi jazerami Jazerá na ostrove Jamesa Rossa Ostrov Jamesa Rossa sa nachádza v severovýchodnej oblasti Antarktického polostrova vo Weddellovom mori (Obr. 3). Veľkosť ostrova je okolo 2500 km 2 a viac než 80 % jeho povrchu je pokrytá ľadom (Rabassa et al., 1982). Len najsevernejšia časť, polostrov Ulu, je významne odľadnená a predstavuje jednu z najväčších oblastí bez ľadu v severnej časti Antarktického polostrova (Nedbalová et al., 2013). Ostrov leží na hranici medzi dvoma hlavnými biogeografickými oblasťami Antarktídy, prímorskou a kontinentálnou (Øvstedal & Smith, 2001). Miestna klíma je ovplyvňovaná 13

21 Antarktickým polostrovom, ktorý predstavuje bariéru pre vlhké vzdušné masy prinášané západnými vetrami a preto je suchšia a má kontinentálnejší ráz v porovnaní so súostrovím Južné Shetlandy na západnej strane Antarktického polostrova (Martin & Peel, 1978; Turner et al., 2002). Priemerný ročný úhrn zrážok v podobe snehu je odhadovaný podľa regionálneho atmosférického modelu v rozmedzí mm ekvivalentoch vody (van Lipzig et al., 2004). Priemerná ročná teplota v blízkosti českej vedeckej základne Johana Gregora Mendela behom rokov bola 7,2 C. Priemerná sezónna teplota sa pohybovala od +1,4 C počas letných mesiacov (December Február) po 17,7 C v zime (Jún August). Najvyššie teploty sa vyskytovali behom Januára a dosahovali až +8,1 C. Náhle zmeny atmosférického prúdenia behom zimy spôsobovali behom dňa veľké zmeny teploty vzduchu, dosahujúce amplitúdu až 30 C (Láska et al., 2010; Láska et al., 2011). Suchozemská vegetácia ostrova je obmedzená na bezcievne rastliny a tvorená prevažne machovou a lišajníkovou tundrou (Nedbalová et al., 2013). Interakcia medzi vulkanickým reliéfom a ľadovcovou geomorfológiou behom predchádzajúcich glaciálnych interglaciálnych cyklov, paraglaciálne a periglaciálne procesy behom Holocénu, a relatívna zmena hladiny mora vyústili v súčasnú komplexnú krajinu Obr. 3. Mapa ukazuje pozíciu ostrova Jamesa Rossa a polostrova Ulu (Elster et al., 2016). ostrova Jamesa Rossa (Davies et al., 2013). Všetky tieto procesy ovplyvnili taktiež vznik jazier na polostrove Ulu. Môžeme ich nájsť od nadmorskej výšky < 20 m.n.m. v blízkosti pobrežia až do 400 m.n.m. v horských oblastiach (Nedbalová et al., 2013). Jazerá na ostrove Jamesa Rossa boli podľa Nedbalová et al. (2013) rozdelené do šiestich skupín: 1. stabilné plytké jazerá vo vyššej nadmorskej výške, 2. plytké pobrežné jazerá, 3. stabilné jazerá v starých morénach, 4. malé nestabilné jazerá v mladých morénach, 5. hlboké karové jazerá, 6. vhĺbené jazerá. Jazerá sa líšia svojím pôvodom a históriou, čo 14

22 ovplyvňuje taktiež ich morfometriu, hydrologickú stabilitu, fyzikálne a chemické vlastnosti. Rozmanitosť jazier je taktiež spojená s rozdielmi v zložení ich horninového podložia. Tieto jazerá predstavujú cennú skupinu vodných ekosystémov nachádzajúcich sa v prechodnej zóne medzi prímorskou a kontinentálnou Antarktídou. Okrem toho oblasť Antarktického polostrova, je v súčasnosti vystavená obrovským zmenám v klimatickom systéme, ktorý následne ovplyvňuje množstvo ekologických aspektov a procesov v týchto ekosystémoch. Západná časť Antarktického polostrova zažíva behom posledných 50 rokov najväčší nárast medziročnej teploty vzduchu na Zemi. Priemerná teplota vzduchu na stanici Faraday/Vernadsky sa zvyšuje rýchlosťou 0,56 C za desaťročie (Turner et al., 2005). 15

23 3. Metodika 3.1. Študované kmene Kmene Monoraphidium A a Monoraphidium B boli vyizolované zo vzoriek odobraných v roku 2009 z jazier na ostrove Jamesa Rossa, konkrétne z jazera Naděje a Omega 1, ktoré sú zobrazené na Obr. 4. Jazero Naděje (GPS: 63 48'51.9'' J, 57 50'05.6'' Z) patrí medzi takzvané hlboké karové jazerá. Hlboké ľadovcové kary sa vyskytujú na záveternej strane niektorých vulkanických stolových hôr, kde akumulácia unášaného snehu umožnila vznik karových ľadovcov. Tieto jazerá sú mladé a pravdepodobne vznikli behom posledného ústupu miestnych ľadovcov. Jazero Omega 1 (GPS: 62 51'40.0'' J, 57 48'50.0'' Z) patrí medzi takzvané zahĺbené jazerá. Tieto jazerá vznikli v zníženinách vytvorených degradáciou ľadu pod sutinou pokrývajúcou ľadovec. Tieto jazerá sú najpočetnejším typom jazier na ostrove Jamesa Rossa a sú považované za veľmi mladé a efemérne. Obr. 4. Jazerá Naděje a Omega 1 nachádzajúce sa na ostrove Jamesa Rossa (fotografie: Linda Nedbalová). Spomínané jazerá sa nachádzajú vo vyššej nadmorskej výške (> 200 m.n.m.) a ich dôležitým znakom je prítomnosť rozsiahlej ľadovej pokrývky, ktorá pretrváva minimálne z časti aj behom leta. Charakteristickými vlastnosťami sú taktiež veľká maximálna a relatívna hĺbka, vysoká koncentrácia rozpusteného reaktívneho fosforu a dusičnanov, a stabilná nízka teplota vody (Nedbalová et al., 2013). Základné fyzikálne a chemické parametre jazier sú uvedené v Tabuľke 1. Kmeň Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 bol pôvodne vyizolovaný zo zeleného ľadu na Ballenyho ostrovoch v oblasti Antarktídy v roku 1964 (Kol & Flint, 1968). Tento 16

24 druh bol taktiež zaznamenaný v jazere Limnopolar na ostrove Livingston (Cordellat, 2012). Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 bol objednaný zo zbierky kultúr rias a prvokov (CCAP). Všetky kmene boli kultivované v BBM médiu (Bold Basal Medium; Bischoff & Bold, 1963) pri teplote 10 C a kontinuálnom osvetlení s intenzitou 10 µmol m 2 s 1. Tabuľka 1. Základné fyzikálne a chemické charakteristiky jazier Naděje a Omega 1 (Nedbalová et al., 2013). O 2 ph σ NO 3 -N SRP DOC [mg l 1 ] [µs cm 1 ] [µg l 1 ] [µg l 1 ] [mg l 1 ] Naděje 13,3 8, ,6 1,09 Omega 1 11,3 7, ,4 0, Molekulárne analýzy DNA bola vyextrahovaná pomocou DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Nemecko). Vzorky rias boli scentrifugované, 13 min na 2300 rpm. Sediment bol prevedený do skúmaviek typu eppendorf (1,5 ml) a centrifugovaný 8 min na 3600 rpm. K sedimentu bolo pridané 100 µl lyzačného roztoku AP1 a sklenené guľôčky. Bunky boli nadrvené pomocou oscilačného mlynu MM 200 (Retsch, Nemecko), 6 minút pri frekvencií 30 Hz. Následne bolo pridané 300 µl lyzačného roztoku AP1 a 4 µl zásobného roztoku RNase A (100 mg/ml). Zmes bola inkubovaná 30 min pri teplote 65 C a počas nej 3-krát premiešaná. Ďalej bolo postupované podľa protokolu výrobcu. Kvalita a koncentrácia vyextrahovanej DNA bola zmeraná pomocou NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, USA). Vzorky DNA boli uskladnené v mrazničke pri teplote 20 C. Na amplifikáciu regiónu génu 18S rrna bola použitá kombinácia špecifických eukaryotických primerov NS1 + 18L a F R. Región ITS2 bol amplifikovaný pomocou primerov ITS1 + ITS4, viac Tabuľka 2. Na polymerázovú reťazovú reakciu (PCR) bol požitý icycler (Bio-Rad, USA). PCR reakčné zmesi a cykly sú uvedené v Tabuľke 3 a 4. Výsledné produkty PCR boli skontrolované pomocou gelovej elektroforézy a následne spolu s primermy použitými na amplifikáciu odoslané na sekvenáciu do firmy Macrogen (Amsterdam, Holandsko). 17

25 Tabuľka 2. Zoznam použitých primerov. Primer Sekvencia 5-3 Zdroj NS1 GTAGTCATATGCTTGTCT White et al., L CACCTACGGAAACCTTGTTACGACTT Hamby et al., F GCTACCACATCCAAGGAAGGCA Katana et al., R CTCGTTCGTTAACGGAATTAACC Katana et al., 2001 ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG White et al., 1990 ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC White et al., 1990 Tabuľka 3. PCR reakčná zmes. Chemikálie Objem na jednu PCR reakciu 18S ITS2 MgCl2 (25 mm) 4 µl 2,80 µl 10 x Buffer 5 µl 3,50 µl dntp (2mM) 0,10 µl 2,63 µl Primer 1 (10 µm) 1 µl 1,40 µl Primer 2 (10 µm) 1 µl 1,40 µl TAQ (5 U/µl) 0,40 µl 0,10 µl PCR voda 31,10 µl 22,18 µl Celkový objem 45 µl 34 µl + DNA (5 ng/µl) 5 µl 1 µl Tabuľka 4. Cyklus PCR. Fáza PCR 18S ITS2 Teplota Čas Teplota Čas Začiatočná denaturácia 95 C 5 min 97 C 5 min Denaturácia 94 C 1 min 95 C 1 min 25 s Nasadanie primerov 59 C 45 s 33 x 56 C 2 min Predĺženie 72 C 3 min 72 C 4 min Konečné predlženie 72 C 7 min 72 C 7 min 37 x 18

26 3.3. Fylogenetické analýzy Získané DNA sekvencie boli zobrazené, zostavené a upravené pomocou programov FinchTV (Geospiza, USA) a MEGA 6 (Tamura et al., 2013). Výsledné sekvencie 18S rdna a ITS2 rdna sú v Prílohe 1. Pomocou vyhľadávacieho algoritmu BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., 1990) boli rozpoznané obdobné sekvencie nad definovanou hranicou identity a stiahnuté z databázy GenBank ( Sekvencie génu 18S rrna boli zarovnané pomocou algoritmu ClustalW (Thompson et al., 1994) v programe MEGA 6. Zo zarovnania boli odstránené intróny a pozície kde u viac než polovice sekvencií boli medzery. Keďže boli sekvencie rôzne dlhé, boli zo zarovnania odstránené začiatočné a koncové úseky a výsledná matica bola manuálne skontrolovaná. Zhodné sekvencie vzniknuté týmito úpravami boli z ďalších analýz vynechané a následne dodatočne vložené až pri grafickej úprave vytvoreného fylogenetického stromu. Výsledné zarovnanie použité na fylogenetické analýzy obsahovalo súbor 62 sekvencií s celkovou dĺžkou 1527 pozícií, z toho 3 sekvencie ako outgroup. Na základe predchádzajúcich fylogenetiských štúdií zaoberajúcich sa čeľaďou Selenastraceae (Krienitz et al., 2001; Fawley et al., 2005; Krienitz et al., 2011) boli ako outgroup vybraté druhy Bracteacoccus aerius, Bracteacoccus minor a Desmodesmus communis. Na odhadnutie najvhodnejšieho substitučného modelu bol použitý program jmodeltest (Posada, 2008). Na základe Akaikeho informačného kritéria (AIC) bol vybraný model GTR + I + Γ (GTR general time reversible model, Γ rate heterogenity among sites, I proportion of invariable sites). Dáta boli podrobené celkovo dvom typom fylogenetických analýz: Bayesiánskej inferencií (BI, Bayesian inference) a Maximálnej vierohodnosti (ML, Maximum likelihood). Fylogenetický strom bol nájdený metódou Bayesiánskej inferencie (BI) v programe MrBayes (Ronquist et al., 2012). Dve paralelné analýzy MCMC (Markov Chain Monte Carlo) bežali po dobu 2 miliónov generácií, každá s jedným studeným a tromi teplými reťazcami. Nájdené stromy spolu s aktuálnymi parametrami substitučného modelu boli ukladané každú stú generáciu. Prvých 25 % uložených stromov bolo odstránených ako "burn-in" a posteriórne pravdepodobnosti boli spočítane na základe zhody zvyšných stromov. Na fylogenetickú analýzu metódou Maximum likelihood (ML) bol použitý program GARLI 2.0 (Zwickl, 2006). Pre nájdenie najlepšieho fylogenetické stromu bolo použitých 5 nezávislých replikácií. Ten bol následné použitý ako počiatočný strom pri počítaní štatistickej podpory vetiev, ktorá bola vypočítaná na základe rýchleho heuristického 19

27 prehľadávania (100 pseudoreplikácií) s automatickým ukončením po generáciách bez významného zlepšenia topológie stromu (príkaz genthreshfortopoterm nastavený na ). Konsenzný strom bol vytvorený v programe PAUP 4.0 (Swofford, 2003) na základe majoritného pravidla (> 50 %). Bootstrapové podpory a posteriórne pravdepodobnosti boli interpretované na základe Peksa & Škaloud (2011) ako slabé (< 50 %), stredné (BI: %; ML: %) a vysoké (BI: > 94 %; ML: > 79 %). Výsledné fylogenetické stromy boli zobrazené v programe FigTree (Rambaut, 2014) a graficky upravené pomocou Inkscape 0.91 (Free Software Foundation, USA). Región ITS2 bol vymedzený na základe už publikovanej sekvencie Ankistrodesmus gracilis (GenBank: AB917098) (Hoshina, 2014). Sekundárna štruktúra sekvencii ITS2 bola zložená pomocou webovej aplikácie Mfold ( Zuker, 2003). Výsledné sekundárne štruktúry boli vykreslené pomocou programu VARNA 3.9 (Darty et al., 2009) a graficky upravené pomocou Inkscape 0.91 (Free Software Foundation, USA). Prítomnosť kompenzačných zámen bázy (CBC; zmena nukleotidu na oboch z dvoch pozícií, ktoré sa navzájom párujú na dvojreťazcovom helixe) a hemi-cbc (hcbc; keď dochádza k zámene len jednej z dvoch báz, ale zachováva sa ich párovanie) bola sledovaná na konzervatívnych častiach sekundárnej štruktúry ITS2, na základe konsenzuálneho modelu štruktúry ITS2 pre triedu Chlorophyceae (Caisová et al., 2013) Svetelná a elektrónová mikroskopia Morfológia buniek jednotlivých kmeňov bola študovaná pod svetelnými mikroskopmi Eclipse E400 (Nikon, Japonsko) a Olympus BX43 (Olympus, Japonsko). Mikrofotografie boli zaznamenané digitálnym fotoaparátom EOS 650D (Canon, Japonsko) a spracované v programe Quick Photo Camera 3.0 (Promicra, Česká republika). Pomocou softvéru ImageJ (National Institutes of Health, USA) bola zmeraná veľkosť (dĺžka a šírka) päťdesiatich buniek z jednotlivých kultúr rias. Vnútorná štruktúra buniek bola pozorovaná prostredníctvom transmisnej elektrónovej mikroskopie (TEM). Vzorky boli fixované 24 h v 2,5% glutaraldehyde v 0,1 M kakodylátovom pufre (ph 7,2) a následne postfixované v 2% OsO 4 v rovnakom pufre. Fixované vzorky boli dehydratované vzostupnou ethanolovou radou a acetónom a následne zaliatie do živice Araldite - Poly/Bed 812 (Polysciences, Nemecko). Ultratenké rezy boli narezané na ultramikrotome Ultracut E (Reichert-Jung, Rakúsko) a kontrastované 2,5% vodným roztokom octanu uranylu a roztokom citrátu olova. Rezy boli pozorované na 20

28 elektrónovom mikroskope JEM-1011 (JEOL, Japonsko). Obraz bol zachytený pomocou fotoaparátu Veleta a spracovaný v programe item 5.1 (Olympus Soft Imaging Solution, Nemecko). Vzorky na skenovaciu elektrónovú mikroskopiu (SEM) boli fixované 24 h v 2,5% glutaraldehyde v 0,1 M kakodylátovom pufre (ph 7,2) a následne odvodnené vzostupnou etanolovou radou (35%, 50%, 70%, 80%, 96%, 100%) s dobou pôsobenia 10 min pri každej koncentrácií. Vzorky boli nanesené na filtračný papier a vysušené metódou kritického bodu CO 2 v prístroji Bal-tec CPD 030. Následne boli prilepené vodivou páskou na kovové terčíky a pokovované naprašovacím zariadením Bal-tec SCD 050 (Bal-tec, Lichtenštajnsko). Preparáty boli pozorované a vyfotografované použitím mikroskopu 6380 LV (JEOL, Japonsko) Skrížený gradient svetla a teploty Optimálne svetelné a teplotné podmienky rastu študovaných kmeňov boli zisťované použitím kultivačného zariadenia so skríženými gradientmy svetla a teploty (Labio, Česká republika; Kvíderová & Lukavský, 2001). Experiment bol uskutočnený vo fyziologickom laboratóriu Botanického ústavu AV ČR v Třeboni. Kultivačné zariadenie a usporiadanie imunologických doštičiek pri kultivácií je zobrazeného na Obr. 5. Obr. 5. Kultivačné zariadenie so skríženými gradientmy svetla a teploty. 21

29 Základom kultivačného zariadenia bola hliníková doska s plošnými rozmermi cm vybavená kontinuálnym chladením na jednej a pulzným ohrievaním na obidvoch kratších stranách. Výsledkom bol stabilný teplotný gradient 1 20 C v prvom kole a 7 30 C v druhom kole experimentu (viac nižšie). Pre lepší prevod tepla medzi doskou a imunologickými doštičkami bola doska pokrytá gázou ktorá bola pravidelne nasycovaná vodou. Počas kultivácie boli doštičky pod krytom z plexiskla, ktorý zabraňoval nadmernému vyparovaniu a zároveň umožňoval sýtiť kultivačný priestor CO 2. Na dlhšej strane dosky bol umiestnený panel LED žiaroviek s rozmermi cm. Po bokoch gradientu boli počas kultivácie umiestnené hliníkové paneli aby sa eliminovalo zoslabenie žiarenia na konci svetelného telesa. Pre zvýšenie gradientu svetla boli použité papierové filtre, ktoré boli vložené pod vrchnáky doštičiek v počte 0 4 (v závislosti na pozícií). Ožiarenie sa pohybovala v rozmedzí 9 69 µmol m 2 s 1 (viac nižšie). Teplota a ožiarenie (v rôznych stupňoch zatienenia) bola zmeraná na celej ploche dosky v sieti bodov, ktoré boli od seba vzdialené 10 cm. Teplota bola meraná teplomerom s polovodičovým senzorom Gryf 310 (Gryf, Česká Republika) a ožiarenie (fotosynteticky aktívne žiarenie nm) pomocou fotometra LI-250A s kvantovým senzorom LI-190SA (Li-COR, USA). Zo získaných dát boli vytvorené modely gradientu teploty a ožiarenia v programe Statistica 12 (StatSoft, USA). Pre teplotu bola zvolená mnohonásobná lineárna regresia a pre ožiarenie mnohonásobná kvadratická regresia. Pomocou výsledných rovníc bola vypočítaná hodnota teploty a ožiarenia pre stred každej imunologickej doštičky (zaokrúhlené na celé čísla). Kmene boli kultivované v sterilných imunologických doštičkách s 96 jamkami. Okrajové jamky boli naplnené destilovanou vodou. Jednotlivé stĺpce doštičky (n=6) obsahovali študované kmene v poradí Monoraphidium A, Monoraphidium B a Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 trikrát po sebe (celkovo 18 paraleliek pre každý kmeň v jednej doštičke). Každá jamka obsahovala 200 µl príslušnej kultúry s požadovanou koncentráciou odpovedajúcou optickej hustote 0,05 pri vlnovej dĺžke 750 nm (OD 750 ). OD 750 bola v celom experimente meraná pomocou spektrofotometrickej čítačky doštičiek Varioscan TM Flash Multimode Reader (Thermo Fisher Scientific, Fínsko). Doštičky boli prekryté potravinárskou fóliou (redukcia vysychania) a vrchnákom. Nárast biomasy bol sledovaný pravidelným meraním optickej hustoty (OD 750 ) každej jamky po dobu 38 dní. Pri každom meraní boli v rámci každého stĺpca doštičky vylúčené odľahlé hodnoty pomocou K-kritéria pre n=6 a hladine významnosti 0,05 (Likeš & Laga, 1978). 22

30 Na prepočet hodnôt optickej hustoty (OD 750 ) na počet buniek N (bunky ml 1 ) bola pre každý kmeň vytvorená konverzná rovnica podľa Kvíderová (2010). Kultúra bola zahustená centrifugáciou aby OD 750 ~ 1. Následne bola vytvorená zostupná rada s riediacimi faktormi 1 (neriedená kultúra); 0,5; 0,1; 0,05; 0,03; 0,01; 0,005; 0,003; 0,001; 0 (kultivačné médium BBM). Jednotlivé riedenia boli napipetované do imunologickej doštičky v objeme 200 µl na jamku v 6 paralelkách a následne zmeraná hodnota OD 750. Koncentrácia buniek v neriedenej kultúre bola spočítaná pomocou Bürkerovej počítacej komôrky a dopočítaná pre jednotlivé riedenia. Konverznú rovnicu sme dostali preložením lineárnej funkcie grafom závislosti N na OD 750. Výsledné konverzné rovnice sú zobrazené v Tabuľke 5. Tabuľka 5. Konverzné rovnice (OD 750 N [buniek ml 1 ]) študovaných kmeňov a korelačný index r 2. Kmeň Konverzná rovnica r 2 Monoraphidium A 0,997 Monoraphidium B 0,994 Ankistrodesmus antarticus CCAP 202/25 0,999 Z nameraných hodnôt bola vytvorená rastová krivka pre každú jamku zvlášť. Rýchlosť rastu počas exponenciálnej fázy bola spočítaná ako smernica priamky lineárnej regresie závislosti prirodzeného logaritmu počtu buniek ln(n) na čase (Kvíderová & Henley, 2005). Pre štatistické vyhodnotenie a grafické znázornenie výsledkov bol použitý program GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, USA). Pre zistenie vplyvu teploty a intenzity žiarenia na rastovú rýchlosť bola použitá analýza rozptylu (ANOVA) nasledovaná Tukeyovou metódou mnohonásobného porovnania. Testovaná nulová hypotéza bola, že teplota a intenzita žiarenia neovplyvňuje rýchlosť rastu. Výsledky boli považované za signifikantné pre p < 0,05. Na základe priemerných hodnôt rastovej rýchlosti v jednotlivých kultivačných podmienkach bol pre každý študovaný kmeň vytvorený vrstevnicový graf zobrazujúci závislosť rýchlosti rastu na teplote a ožiarení. Dáta boli vyhladené metódou váženej vzdialenosti najmenších štvorcov pomocou programu Statistica 12 (StatSoft, USA). 23

31 3.6. Zloženie mastných kyselín Na analýzu mastných kyselín boli študované kmene Monoraphidium A, Monoraphidium B a Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 kultivované pri teplote 3 C a ožiarení 10 µmol m 2 s 1. Kultúry na začiatku stacionárnej fázy boli scentrifugované a biomasa bola zamrazená. 100 mg lyofilizovanej biomasy bolo zmydelnené 10% roztokom KOH v metanole pri izbovej teplote behom noci. Neutrálne a bázické zlúčeniny boli z roztoku s ph 9 vytrepané dietyléterom. Vodný roztok s mastnými kyselinami bol okyslený na ph 2 a kyseliny boli extrahované do hexánu. Mastné kyseliny boli metylované zmesou BF 3 -metanol a identifikované pomocou GC-MS (plynová chromatografia s hmotnostnou spektrofotometriou, s iontovou pascou s detektorom s ionizáciou nárazu elektrónov). Vzorka bola nastrieknutá do kapilárnej kolóny s polárnou stacionárnou fázou (25 m 0,25 mm 0,1 µm) a pre elúciu bol použitý teplotný gradient 5 min pri 50 C, zahrievanie kolóny rýchlosťou 10 C min 1 do 320 C a izotermicky 15 min pri 320 C. Nosným plynom bolo hélium s prietokom 0,52 ml min 1. Všetky spektra boli skenované v rozsahu Da. Štruktúra metylesterov bola určená na základe retenčných časov, ich fragmentácie a porovnaním spektier so spektrami čistých látok. Analýza bola urobená v Mikrobiologickom ústave AV ČR. 24

32 4. Výsledky 4.1. Fylogenetické analýzy Výsledkom fylogenetických analýz sekvencií génu 18S rrna s dĺžkou 1527 báz pomocou metód Bayesiánskej inferencie (BI) a Maximum likelihood (ML) sú fylogenetické stromy s rovnakou topológiou. Na Obr. 6 je zobrazený výsledný fylogenetický strom s hodnotami bootstrapovej podpory a posteriórnej pravdepodobnosti. Na základe týchto analýz sú študované kmene Monoraphidium A a Monoraphidium B s vysokou štatistickou podporou blízko príbuzné s organizmami v klade označenom ako Monoraphidium-like-II, do ktorého patrí šesť kmeňov Monoraphidium dybowskii a päť kmeňov Monoraphidium sp. V rámci tohto kladu tieto dva študované kmene spoločne s kmeňom Monoraphidium cf. dybowskii SAG 2393 spadajú do jednej samostatnej vývojovej línie, pričom kmeň Monoraphidium B spolu s Monoraphidium cf. dybowskii SAG 2393 tvoria sesterskú skupinu ku kmeňu Monoraphidium A. U týchto kmeňov sú kódujúce sekvencie génu 18S rrna v celej ich dĺžke (bez úprav uvedených v podkapitole 3.3.) z viac než 99,8 % identické. Rozdiel medzi sekvenciami kmeňov A a B je v jednej zámene nukleotidu a v dvoch indeloch. Pri porovnaní sekvencií kmeňa B a SAG 2393 nájdeme rozdiel len v dvoch indeloch. Okrem rozdielov v kódujúcej časti, sekvencie kmeňov Monoraphidium A a Monoraphidium B sa líšia aj v počte intrónov. Sekvencia kmeňa A obsahuje tri intróny na pozíciách 541, 1143, 1242 (vztiahnuté ku sekvencií Chlamydomonas reinhardtii [GenBank: JN903978]). Kmeň B má dva intróny na pozíciách 1143 a U ďalších použitých sekvencií publikovaných vo verejných databázach spadajúcich do kladu Monoraphidium-like- II nebola uvedená informácia o intrónoch. Kmeň Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 spadá s vysokou štatistickou podporou do kladu Monoraphidium-like-III, ktorý zahrňuje kmene Monoraphidium pusillum Pic 8/18 P- 7w, Monoraphidium griffithii AN7-8 a Monoraphidium braunii SAG 2006 (Obr. 6). Rozdiel v sekvenciách génu 18S rrna (bez úprav uvedených v podkapitole 3.3.) medzi kmeňmi Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 a Monoraphidium pusillum Pic 8/18 P-7w je len v jednom indele. Čo sa týka intrónov, ani jedna sekvencia v tomto klade ich neobsahuje. Zo študovaných kmeňov Monoraphidium A, Monoraphidium B a Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 boli získané taktiež sekvencie región ITS2 rdna. Pre ďalšie blízko príbuzné kmene neexistujú verejne dostupné sekvencie regiónu ITS2, čo znemožnilo detailnejšie porovnanie v rámci týchto kladov a zároveň celej čeľade Selenastraceae. 25

33 Obr. 6. Bayesiánsky fylogenetický strom založený na analýze sekvencií génu 18S rrna. Nad vetvami sú uvedené posteriórne pravdepodobnosti a bootstrapové podpory (BI/ML > 50). Sekvencie kmeňov vyznačených červene sú získane v tejto práci. (pokračovanie na ďalšej strane) 26

34 Obr. 6. (pokračovanie) Za ostatnými sekvenciami je uvedené prístupové číslo z databázy GenBank. Označenie kladov podľa Krienitz et al. (2011), s drobnými modifikáciami. Plná štatistická podpora (1/100) je vyznačená hviezdičkou (*). Tučne sú zvýraznené vetvy, ktoré dostali najvyššiu posteriórnu pravdepodobnosť (1). Sekundárnu štruktúru ITS2 študovaných kmeňov tvorili štyri helixy, pričom helix III bol najdlhší a helix I bol rozvetvený. Helix II všetkých troch kmeňov obsahoval nezhodu pyrimidín-pyrimidín. Porovnanie sekundárnych štruktúr ITS2 kmeňov Monoraphidium A a Monoraphidium B môžeme vidieť na Obr. 7. Tieto štruktúry sa líšia len na troch pozíciách. Pri porovnaní jednotlivých helixov kmeňov Monoraphidium A a Monoraphidium B s kmeňom Ankistrodesmus antarcticus CCAP 20/25 môžeme vidieť, že najviac zmien je na helixoch I, IV a koncových oblastiach helixov II a III (Príloha 2). Pri porovnaní Obr. 7. Grafické znázornenie sekundárnej štruktúry ITS2 kmeňa Monoraphidium A. Červenou farbou sú znázornené zmeny u kmeňa Monoraphidium B. Štyri hlavné helixy sú označené rímskymi číslicami I IV. Šípkami je vyznačená pyrimidínpyrimidín nezhoda na helixe II. Model obsahuje 3 koniec 5.8S rrna a 5 koniec 28S rrna. 27

35 konzervatívnych oblastí sekundárnej štruktúry ITS2 (viac kapitola 3.3.) analyzovaných kmeňov Monoraphidium A a Monoraphidium B neboli nájdene žiadne CBC a ani hcbc (Obr. 7). Pri porovnaní týchto dvoch kmeňov A a B s kmeňom Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 bola prítomnosť jednej CBC nájdená na tretom helixe a jednej hcbc na prvom helixe (Príloha 2) Morfológia buniek Morfológia buniek študovaných kmeňov bola pozorovaná pomocou svetelnej a elektrónovej mikroskopie. Kmene Monoraphidium A a Monoraphidium B mali bunky vretenovitého tvaru, postupne sa zužujúce smerom k vrcholom, oblúkovito prehnuté so zaoblenými koncami. Bunky kmeňu Monoraphidium A boli v porovnaní s Monoraphidium B viac zahnuté (Obr. 8 A F). Rozmery buniek (dĺžka a šírka) boli pre oba kmene podobné, viac Tabuľka 6. V kultúre sa vyskytovali jednotlivo. Bunky kmeňa Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 boli v porovnaní so zvyšnými dvoma kmeňmi viac než dva krát väčšie (Tabuľka 6). Mali rovný vretenovitý tvar, mierne asymetrický. Väčšinou sa vyskytovali jednotlivo ale občas bola pozorovaná tvorba hviezdicovitých zhlukov, ktoré vznikali spojením niekoľkých buniek pomocou slizu na ich koncoch (Obr. 8 H). Všetky tri študované kmene sa rozmnožovali pomocou tvorby autospór (Obr. 8 C,F,I). Na úrovni ultraštruktúry bol v bunkách pozorovaný jeden parietálny chloroplast so škrobovými zrnami, jadro, mitochondrie, Golgiho aparát, vakuoly (Obr. 9). Ultraštruktúra buniek kmeňov Monoraphidium A a Monoraphidium B bola rovnaká. Výraznou bunečnou štruktúrou v rámci chloroplastu týchto dvoch kmeňov bol nahý pyrenoid sférického tvaru, cez ktorý neprenikali tylakoidy (Obr. 9 A,C). U kmeňa Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 nebola pozorovaná prítomnosť pyrenoidu. Jeho chloroplast obsahoval veľké množstvo škrobových zŕn (Obr. 9 D,E). Tabuľka 6. Rozmery buniek študovaných kmeňov. Kmeň dĺžka (µm) šírka (µm) priemer SD min max priemer SD min max Monoraphidium A 7,7 1,4 5,3 10,4 1,5 0,2 1,1 2,1 Monoraphidium B 8,2 1,1 5,6 10,4 1,4 0,2 0,8 1,8 Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 20,5 2,5 15,4 26,3 3,1 0,4 2,0 3,9 28

36 A B C F D E H G I Obr. 8. Fotografie buniek zo skenovacieho elektrónového a svetelného mikroskopu zobrazujúce kmene Monoraphidium A (A C), Monoraphidium B (D F) a Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 (G I). Fotografie C, F a I zobrazujú rozmnožovanie pomocou autospór. 29

37 J CH M A B S E P CH M V CH J C CH P J S V D S CH G S M J CH Obr. 9. Fotografie buniek z transmisného elektrónového mikroskopu zobrazujúce kmene Monoraphidium B (A B), Monoraphidium A (C) a Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 (D E). Fotografie A a E zobrazujú pozdĺžny, B D priečny rez bunkami. Na fotografiách sú vyznačené štruktúry: pyrenoid (P), jadro (J), chloroplast (CH), škrobové zrná (S), mitochondria (M), Golgiho aparát (G), vakuola (V). 30

38 4.3. Rastové optimá Závislosť rýchlosti rastu na teplote a intenzite žiarenia bola zisťovaná na skríženom gradiente svetla a teploty. Všetky tri študované kmene vykazovali významnú závislosť na obidvoch sledovaných faktoroch. Štatistické vyhodnotenie je uvedené v Prílohe 3. Študované kmene boli schopné rásť v širokom rozpätí teplôt. Kmene Monoraphidium A a Monoraphidium B boli schopné rásť v rozmedzí teplôt 1 20 C, pričom ich optimálna teplota rastu sa pohybovala v rozmedzí 6 20 C (Obr. 10 A,C). Kmeň Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 rástol v celom rozsahu testovaných teplôt a to 1 30 C a jeho optimálna teplota rastu sa pohybovala v rozmedzí 6 25 C (Obr. 10 E). Všetky tri kmene boli schopné rásť pri všetkých testovaných intenzitách žiarenia. Pri tomto experimente nebola dosiahnutá intenzita žiarenia, ktorá by limitovala rast týchto kmeňov. Rastová rýchlosť dosahovala najvyšších hodnôt pri nízkej intenzite žiarenia (9 16 µmol m 2 s 1 ). S rastúcou intenzitou žiarenia sa rýchlosť rastu znižovala (Obr. 7 B,D,F). Maximálna rýchlosť rastu všetkých troch kmeňov bola zrovnateľná a dosahovala hodnôt 0,4 0,6 d 1. Pre lepšie vizuálne znázornenie optimálnych podmienok rastu študovaných kmeňov, vzhľadom na teplotu a intenzitu žiarenia pri ich kultivácií sú v Prílohe 4 zobrazené vrstevnicové grafy zachytávajúce rýchlosť rastu pri jednotlivých podmienkach. 31

39 µ [d -1 ] µ [d -1 ] µ [d -1 ] µ [d -1 ] µ [d -1 ] µ [d -1 ] T [ C] T [ C] A C I [µmol m -2 s -1 ] I [µmol m -2 s -1 ] B D 0.7 E 0.7 F T [ C] I [µmol m -2 s -1 ] I [µmol m -2 s -1 ]: T [ C]: Obr. 10. Závislosť rýchlosti rastu na teplote pri rôznych intenzitách žiarenia a závislosť rýchlosti rastu na intenzite žiarenia pri rôznych teplotách (priemer + SD) pre Monoraphidium A (A,B), Monoraphidium B (C,D) a Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 (E,F). µ rýchlosť rastu, T teplota, I intenzita žiarenia. 32

40 4.4. Zloženie mastných kyselín Zastúpenie jednotlivých mastných kyselín bolo medzi kmeňmi Monoraphidium A a Monoraphidium B veľmi podobné (Tabuľka 7). Celkovo bolo identifikovaných jedenásť mastných kyselín. Dominantné zastúpenie mali polynenasýtené mastné kyseliny (PUFA), ktoré tvorili u Monoraphidium A 72,2 % a u Monoraphidium B 69,7 % z celkového množstva mastných kyselín obsiahnutých v ich bunkách. U obidvoch kmeňov mali najväčší podiel kyselina stearidonová (18:4) a kyselina hexadekatetraenová (16:4). Významný podiel mali tiež kyselina palmitová (16:0), kyselina α-linolenová (18:3) a kyselina olejová (18:1). U kmeňa Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 bolo identifikovaných dvanásť mastných kyselín. PUFA tvorili 60,5 % z celkového množstva mastných kyselín obsiahnutých v ich bunkách. Najväčší podiel mali kyselina α-linolenová (18:3) a olejová (18:1). Okrem nich významný podiel mali aj kyselina palmitová (16:0), kyselina stearidonová (18:4) a kyselina hexadekatetraenová (16:4). Tabuľka 7. Zloženie mastných kyselín (FA) u študovaných kmeňov kultivovaných pri teplote 3 C a intenzite žiarenia 10 µmol m 2 s 1. (Číslo v zátvorke uvádza pozíciu dvojitých väzieb v uhlíkovom reťazci). FA (%) Monoraphidium A Monoraphidium B Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 16:0 15,1 19,2 15,7 16:1 (7) 0,3 0,3 1,5 16:1 (9) 0,6 0,5 2,6 16:2 (7,10) 0 0 1,9 16:3 (7,10,13) 3,3 3,9 0,8 16:4 (3,6,9,12) 18,5 23,1 10,5 18:0 1,1 0,5 0 18:1 (9) 10,7 9,8 18,7 18:2 (9,12) 0,9 1,4 8,5 18:3 (6,9,12) 1,3 0,9 0,7 18:3 (9,12,15) 13,7 10,4 22,5 18:4 (6,9,12,15) 34, ,3 20:1 (11) 0 0 0,3 PUFA 72,2 69,7 60,5 33

41 5. Diskusia 5.1. Fylogenetická analýza a morfológia buniek Výsledky fylogenetických analýz sekvencií génu 18S rrna kmeňov Monoraphidium A, Monoraphidium B a Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 potvrdili, že tieto tri študované kmene patria do čeľade Selenastraceae. Zástupcov rodov Monoraphidium a Ankistrodesmus môžeme nájsť v niekoľkých odlišných kladoch a preto sú tieto dva rody polyfyletické (Obr. 6). To potvrdzujú výsledky predchádzajúcich fylogenetických štúdií zaoberajúcich sa čeľaďou Selenastraceae, pričom jednotlivé klady by mohli predstavovať odlišné rody (Krienitz et al., 2001; Krienitz et al., 2011). Študované kmene Monoraphidium A a Monoraphidium B sú blízko príbuzné kmeňom druhu Monoraphidium dybowskii. Krientiz et al. (2011) označili klad, ktorý obsahoval sekvencie kmeňov Monoraphidium dybowskii SAG 202-7e a M. dybowskii CB 2009/27 ako Monoraphidium-like-II. My sme tento klad rozšírili o ďalšie sekvencie nových kmeňov (v rátane našich sekvencií kmeňov Monoraphidium A a Monoraphidium B) na základe prítomnosti taxónov označených ako Monoraphidium dybowskii a vysokej štatistickej podpory pre tento rozšírený klad Monoraphidium-like-II. Zástupcovia tohto kladu, nie sú úzko prepojený s kladom obsahujúcim typový druh rodu Monoraphidium [Monoraphidium griffithii (Berkley) Komárková-Legnerová] a preto ďalšie taxonomické štúdie by mohli zástupcom tohto kladu priradiť nové rodové meno. Kmene Monoraphidium A, Monoraphidium B a Monoraphidium cf. dybowskii SAG 2393 zdieľajú takmer identické sekvencie génu 18S rrna (> 99,8 %). Kmeň SAG 2393 bol vyizolovaný z kalcifikujúceho biofilmu v krasovom potoku Deinschwanger v Nemecku (Hodač et al., 2015). Bližšie informácie ohľadom jeho morfológie a ekológie nie sú známe. Tento kmeň nie je v súčasnosti v zbierke dostupný a taktiež nie je dostupná jeho sekvencia ITS2. Kmeň Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 je blízko príbuzný ďalším kmeňom z rodu Monoraphidium. Do rovnakého kladu spadá aj kmeň Monoraphidium griffithii AN7-8, pričom Monoraphidium griffithii (Berkeley) Komárková-Legnerová je typovým druhom rodu Monoraphidium. Z tohto dôvodu sme tento klad označili ako Monoraphidium-like-III. Už autori Komárek & Fott (1983) zaradujú druh Ankistrodesmus antarcticus na základe morfológie buniek skôr k rodu Monoraphidium než k rodu Ankistrodesmus. To, že typový druh rodu Ankistrodesmus (Ankistrodesmus fusiformis Corda) spadá do inej vývojovej línie len potvrdzuje tieto pochybnosti. Kmeň Monoraphidium pusillum Pic 8/18 P-7w má 34

42 s kmeňom Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 takmer totožnú sekvenciu génu 18S rrna (> 99,9 %). Kmeň Pic 8/18 P-7w bol vyizolovaný z rybníku Picnic v Minnesote, USA (Fawley et al., 2005). Sekvencie génu 18S rrna sú bežne využívané ako marker vo fylogenetických analýzach. Výnimkou nie sú ani štúdie zaoberajúce sa zástupcami čeľade Selenastraceae (Krienitz et al., 2001; Fawley et al., 2005; Krienitz et al., 2011). Ako ukazujú niektoré štúdie, sekvencie génu 18S rrna môžu byť príliš konzervatívne a nemusia poskytovať dostatočne rozlíšenie na štúdium vzťahov blízko príbuzných druhov (Hegewald & Wolf, 2003; Lewis & Flechtner, 2004; Piganeau et al., 2011). "Internal Transcribed Spacer 2" (ITS2), oblasť medzi sekvenciami kódujúcimi gény 5.8S a 28S rrna sa ukázala byť vhodným markrom pre štúdium blízko príbuzných druhov (Coleman, 2003). Napriek tomu, že primárna sekvencia ITS2 je veľmi variabilná, jej sekundárna štruktúra si zachováva určité znaky, ktoré vyzerajú byť rovnaké naprieč eukaryotickými organizmami. To okrem iného značne prispieva k presnosti zarovnania sekvencií ITS2 pri fylogenetických analýzach (Mai & Coleman, 1997; Schultz et al., 2005). Sekundárna štruktúra ITS2 študovaných kmeňov Monoraphidium A, Monoraphidium B a Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 vykazovala typické znaky pre Eukaryoty ako prítomnosť štyroch helixov (pričom tretí helix je najdlhší) a nezhodu pyrimidín-pyrimidín na druhom helixe (Obr. 7, Príloha 2). Prví helix bol rozvetvený, čo bolo pozorované na sekundárnych štruktúrach ITS2 ďalších zástupcov patriacich k "odvodeným Sphaeropleales", ku ktorým patrí aj čeľaď Selenastraceae (Caisová et al., 2013). Medzi najvariabilnejšie oblasti sekundárnej štruktúry ITS2 zástupcov triedy Chlorophyceae patrí helix I a IV a koncové úseky helixov II a III (Caisová et al., 2013). To môžeme vidieť aj pri porovnaní sekundárnych štruktúr ITS2 všetkých troch študovaných kmeňov v Prílohe 2. Sekundárna štruktúra ITS2 je taktiež spojená s CBC druhovým konceptom (Coleman, 2000). Kompenzačná zámena bázy (CBC) predstavuje zmenu nukleotidu na oboch z dvoch pozícií, ktoré sa navzájom párujú na dvojreťazcovom helixe. Tento koncept bol pôvodne navrhnutý pre vybrané zelené riasy (Volvocales) na základe korelácie nájdenej medzi prítomnosťou alebo absenciou CBC v konzervatívnej oblasti ITS2, helix II a III, a schopnosti alebo neschopnosti kmeňov sa pohlavne krížiť. Müller et al. (2007) našiel silnú koreláciu medzi CBC v rámci celej sekundárnej štruktúry ITS2 a taxónmi klasifikovanými ako odlišné druhy (najme rastliny a huby). Došli k záveru, že prítomnosť CBC v ITS2 je dostačujúca na rozlíšenie druhov a korelácia medzi CBC a speciáciou je nezávislá na spôsobe reprodukcie. Oproti tomu podľa Caisová et al. (2013) u štyroch testovaných radoch triedy Chlorophyceae 35

43 neboli CBC diagnostické na úrovni druhu pre použitý dátový súbor. Podľa autorov, CBC koncept musí byť kritický zhodnotený vo fylogenetickom kontexte pred tým než je použitý na vymedzenie druhov. Na druhú stranu CBC druhový koncept bol nedávno predmetom testovania v širokom merítku a bolo ukázané, že pokiaľ nie je prítomná CBC, tak študované kmene predstavujú rovnaký biologický druh s pravdepodobnosťou ~ 0,76, zatiaľ čo pri prítomnosti CBC, tieto dva kmene patria k dvom rozdielnym biologickým druhom s pravdepodobnosťou ~ 0,96 (Wolf et al., 2013). Medzi našimi analyzovanými kmeňmi Monoraphidium A a Monoraphidium B nebola nájdená prítomnosť CBC a ani hcbc. Zaznamenané tri rozdielne nukleotidy sa nachádzali vo variabilných oblastiach na základe konsenzuálneho modelu sekundárnej štruktúry ITS2 pre triedu Chlorophyceae (Caisová et al., 2013), kam patrí aj čeľaď Selenastraceae. Medzi kmeňom Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 a kmeňmi A a B bola prítomnosť jednej CBC nájdená v konzervatívnej oblasti tretieho helixu a jedno hcbc v konzervatívnej oblasti prvého helixu. Analýza Caisová et al. (2011) u rádu Ulvales ukázala, že CBC a hcbc sú nezávislé evolučné procesy a títo autori nenašli žiaden dôkaz, že by CBC vzniklo prostredníctvom dvoch po sebe nasledujúcich hcbc. Pre ďalšie blízko príbuzné kmene neexistujú verejne dostupné sekvencie regiónu ITS2, čo znemožnilo detailnejšie porovnanie. Na základe našich výsledkov predpokladáme, že kmene Monoraphidium A a Monoraphidium B, pravdepodobne aj s kmeňom Monoraphidium cf. dybowskii SAG 2393, patria k jednému druhu. Na základe morfologických znakov buniek kmeňov Monoraphidium A a Monoraphidium B pozorovaných pod svetelným mikroskopom sa nám nepodarilo tieto dva kmene jednoznačne priradiť ku žiadnemu doteraz popísanému druhu z čeľade Selenastraceae. Pre druh Monoraphidium dybowskii (Woloszynska) Hindák & Komárkova-Legnerová, ktorý na základe fylogenetických analýz vyšiel ako najpríbuznejší ku kmeňom A a B, sú charakteristické cylindrické bunky, niekedy zužujúce sa smerom k vrcholom, takmer rovné alebo mierne oblúkovito prehnuté so zaoblenými koncami. Pri porovnaní týchto morfologických znakov a nákresov buniek v Komárková-Legnerová (1969) s morfológiou študovaných kmeňov Monoraphidium A a Monoraphidium B môžeme vidieť, že bunky našich kmeňov A a B sú oproti tomu značne prehnuté a výraznejšie sa zužujúce smerom ku koncom. Tento rozdiel môžeme vidieť aj pri porovnaní s fotografiami kmeňa Monoraphidium dybowskii SAG 202-7e (Krienitz et al., 2001). Bunky sa líšia aj v rozmeroch. Pri porovnaní ich veľkosti, bunky kmeňov A (7,7 1,5 µm) a B (8,2 1,4 µm) sú o niečo menšie než rozmery uvedené pre druh Monoraphidium dybowskii (10,8 2,8 µm) v Komárková- 36

44 Legnerová (1969). Na základe odlišnej morfológie a skutočnosti, že kmene Monoraphidium A a Monoraphidium B tvoria s kmeňom Monoraphidium cf. dybowskii SAG 2393 dobre podporenú líniu v rámci kladu Monoraphidium-like-II, pravdepodobne by mohli byť popísané ako nový druh. Ale pred taxonomickými závermi je nutné detailné porovnanie morfológie s kmeňom SAG 2393 a využitie variabilnejších genetických markrov. Preto tieto kmene A a B vo fylogenetickom strome označujeme ako Monoraphidium sp. Morfológia buniek kmeňa Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 sa zhoduje s tou, ktorú popísal Kol & Flint (1968) pri izolácií a popise tohto druhu. Bunky sa väčšinou vyskytovali jednotlivo ale občas bola pozorovaná formácia hviezdicovitých zhlukov, ktoré vznikali spojením niekoľkých buniek pomocou slizu na ich koncoch. Tvorba kolónií môže byť veľmi variabilným znakom. Zmeny v podmienkach prostredia môžu viesť k ich rozpadu (Krienitz et al., 2012). Krienitz et al. (2001) pozoroval rozpad kolónií na jednotlivé bunky v rýchlo rastúcich kultúrach. Kmeň Monoraphidium pusillum Pic 8/18 p-7w, ktorý zdieľal s kmeňom Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 takmer totožnú sekvenciu génu 18S rrna bol priradený k duhu Monoraphidium pusillum (Printz) Komárkova-Legnerová na základe morfologických znakov, ktoré sú podľa Komárkova-Legnerová (1969) veľmi variabilné. Morfológia buniek kmeňa Monoraphidium pusillum Pic 8/18 p-7w, ktorú popísali Fawley et al. (2005) je podobná tej kmeňa Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25. U väčšiny druhov z rodov Monoraphidium a Ankistrodesmus sa predpokladalo, že nemajú pyrenoid (Komárková-Legnerová, 1969). Využitím transmisnej elektrónovej mikroskopie sa nakoniec ukázalo, že ho obsahujú (Eloranta, 1979; Krienitz & Klein, 1983; Krienitz et al., 2001). Pri pozorovaní buniek kmeňov Monoraphidium A a Monoraphidium B pod svetelným mikroskopom nie je prítomnosť pyrenoidu rozoznateľná. Pri pozorovaní ultraštruktúry buniek prostredníctvom transmisného elektrónového mikroskopu, môžeme v bunkách rozoznať nahý pyrenoid sférického tvaru, cez ktorý neprenikajú tylakoidy. Rovnakú štruktúru pyrenodiu pozorovali Krienitz et al. (2001) v bunkách kmeňa Monoraphidium dybowskii SAG 202-7e. Nahým pyrenoidom sa označuje pyrenoid bez škrobového obalu, ktorý je veľmi ťažko rozoznateľný použitím len bežnej svetelnej mikroskopie. Krienitz et al. (2001) ukázal, že takýto pyrenoid je možné pozorovať využitím diferenciačného interferenčného kontrastu aj svetelným mikroskopom. Avšak použitie transmisného elektrónového mikroskopu je nevyhnutné na štúdium detailov štruktúry pyrenoidu. V bunkách kmeňa Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 nebol pyrenoid pozorovaný ani pod transmisným elektrónovým mikroskopom. Oproti tomu v bunkách kmeňa Monoraphidium braunii SAG 2006 patriaceho do kladu Monoraphidium-like-III bola 37

45 prítomnosť pyrenoidu zaznamenaná (Krienitz et al., 2001). Eloranta (1979) popísal prítomnosť pyrenoidu aj u druhu Monoraphidium griffithii (Berkeley) Komárková-Legnerová. Prítomnosť alebo absencia pyrenoidu bola taxonomicky využívaným znakom u tejto čeľade rias. Tvorbu pyrenoidu však môže ovplyvňovať koncentrácia CO 2 (Miyachi et al. 1986). Pri kultivácií Monoraphidium terrestre pri vzdušnej koncentrácii CO 2 bol pyrenoid dobre vyvinutý kým pri zvýšenej koncentrácií CO 2 ho nebolo možné pozorovať (Krienitz & Klein, 1988). Podľa Krienitz et al. (2012) z tohto dôvodu prítomnosť alebo absencia pyrenoidu nemôže byť využívaná ako znak na rozlišovanie členov čeľade Selenastraceae. U všetkých troch študovaných kmeňov bolo pozorované rozmnožovanie pomocou produkcie autospór, čo je charakteristickým znakom zástupcov čeľade Selenastraceae (Krienitz et al., 2001) Ekológia a biogeografia Organizmy dobre adaptované na chlad sa obecne rozdeľujú na psychrofilné a psychrotrofné. Morita (1975) zaraďuje ku psychrofilným organizmom tie, ktorých optimálna teplota rastu je nižšia než 15 C, pričom ich maximálna teplota rastu neprekračuje 20 C. Oproti tomu ku psychrotrofným organizmom patria tie, ktorých optimálnu teplotu rastu sa nachádza nad 15 C a ich horná teplotná hranica, ktorú sú schopné prežiť môže dosahovať až 40 C. Napriek týmto zjavným rozdielom medzi teplotnými nárokmi psychrofilných a psychrotrofných organizmov, niektoré organizmy nie je možné jednoznačne zaradiť do jednej ani druhej skupiny (Russell, 2006). Z ekologického hľadiska, takto definované kategórie nemusia byť užitočné. Dôležitá je práve schopnosť týchto organizmov rásť pri nízkych teplotách v ich prirodzenom prostredí mimo ich optimálnu tepotu rastu (Seaburg et al., 1981). Všetky tri študované kmene dokázali rásť v relatívne širokom rozpätí teplôt, takže ich môžeme považovať za psychrotrofné (Obr. 10). Kmene Monoraphidium A, Monoraphidium B dokázali rásť v rozmedzí teplôt 1 20 C. Kým pri teplote 20 C dosahovala rýchlosť rastu ešte vysokých hodnôt, pri teplote 25 C a vyššej však neboli tieto kmene schopné rásť. Ich optimálna teplota rastu sa pohybovala v rozmedzí 6 20 C. Kmeň Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 dokázal rásť v ešte širšom rozsahu teplôt (1 30 C), pričom optimálna teplota rastu sa nachádzala v rozmedzí 6 25 C. Schopnosť tolerovať takto vysoké teploty bola zaznamená aj u niekoľkých ďalších polárnych rias z rodov ako Navicula, Chlorella, Chlamydomonas (Seaburg et al., 1981; Teoh et al., 2004; Cao et al., 2016). Schopnosť organizmov rásť v širokom rozmedzí teplôt bola spájaná najmä s prostredím s veľkou 38

46 fluktuáciou teplôt (Seaburg et al., 1981). No výsledky predbežných pokusov Dolhi et al. (2013) ukazujú výskyt mikroorganizmov so širokým rozmedzím optimálnej teploty rastu (8 20 C) a maximálnej teploty 25 C aj v extrémnom ale stabilnom prostredí jazier v McMurdo Dry Valleys. Na druhu stranu všetky tri študované kmene dokázali dobre rásť aj pri teplote 1 C, kde sa ich rastová rýchlosť pohybovala v rozmedzí 0,1 0,3 (d 1 ) v závislosti na intenzite žiarenia. Práve táto schopnosť relatívne dobre rásť aj pri nízkych teplotách mimo ich optimálnu teplotu rastu, im umožňuje prežiť v ich prirodzenom prostredí. Kmene Monoraphidium A a Monoraphidium B boli vyizolované z jazier kde sa teplota vody pohybovala okolo 1 C (Nedbalová et al., 2013). Veľmi nízkym teplotám vo svojom prirodzenom prostredí bol vystavený aj kmeň Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25, ktorý bol vyizolovaný z ľadu (Kol & Flint, 1968). Okrem schopnosti rásť pri nízkej teplote sú študované kmene Monoraphidium A, Monoraphidium B a Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 dobre prispôsobené na život pri nízkej intenzite žiarenia (Obr. 10). Rýchlosť rastu dosahoval najvyšších hodnôt pri intenzite žiarenia 9 16 µmol m 2 s 1. Všetky tri kmene boli schopné rásť v celkom rozsahu testovaných intenzít žiarenia (9 69 µmol m 2 s 1 ) a v experimente nebola dosiahnutá intenzita žiarenia, ktorá by limitovala ich rast. Takáto nízka intenzita žiarenia odpovedá podmienkach v ich prirodzenom prostredí. Kmene Monoraphidium A, Monoraphidium B boli vyizolované z jazier, pre ktoré bola charakteristická rozsiahla ľadová pokrývka, ktorá pretrvávala aj behom leta. Táto vrstva ľadu mala výrazný vplyv na množstvo prenikajúceho slnečného žiarenia. V jazere Naděje dosahovala intenzita slnečného žiarenia behom mesiaca Február tesne pod ľadom 8 µmol m 2 s 1 počas oblačného dňa a 97 µmol m 2 s 1 behom slnečného dňa (Nedbalová, nepublikované dáta). Tieto organizmy obývajúce prostredie pod ľadom alebo v ľade sú dobre adaptované na veľmi nízku intenzitu slnečného žiarenia. U rozsievok žijúcich v morskom ľade bola zaznamenaná aktívna fotosyntéza pri intenzite žiarenia < 0,5 µmol m 2 s 1, čo sa rovnalo 0,03 % na povrch dopadajúceho slnečného žiarenia (Cota, 1985). Hawes & Schwarz (1999) pozorovali spoločenstvo bentických rozsievok žijúcich v hĺbke okolo 20 metrov v trvalo zamrznutom jazere Hoare. Toto spoločenstvo bolo dobre adaptované na nízku intenzitu žiarenia pohybujúcu sa okolo 2 µmol m 2 s 1, čo bola zároveň hodnota žiarenia, pri ktorej dochádzalo k saturácií ich fotosyntézy. Ďalšie tri antarktické endemické riasy dosahovali 1 svetlom saturovaný rast pri intenzite žiarenia medzi µmol m 2 s bez ohľadu na teplotu kultivácie (Wiencke & Fischer, 1990). Pokusy na antarktických morských riasach ako 39

47 Phaeocystis antarctica a Fragilariopsis cylindrus ukázali inhibíciu rastu pri intenzite žiarenia prekračujúcej 65 µmol m 2 s 1 (Arrigo et al., 2010). Informácie o nárokoch na tepotu a intenzitu žiarenia príbuzných kmeňov, našim študovaným kmeňom, vyizolovaných z lokalít v temperátnej oblasti sú obmedzené. U kmeňa Monoraphidium sp. Dek19 bola popísaná schopnosť rásť pri teplote 10 C a nízkej intenzite žiarenia, 30 µmol m 2 s 1 (Holbrook et al., 2014). U kmeňa Monoraphidium dybowskii C29 bola zaznamenaná rýchlosť rastu 0,67 (d 1 ) pri teplote 26 C a intenzite žiarenia 200 µmol m 2 s 1 (Yang et al., 2012) a u kmeňa Monoraphidium dybowskii PJD060 rýchlosť rastu 0,21 (d 1 ) pri teplote 28 C a intenzite žiarenia 300 µmol m 2 s 1 (Heo et al., 2015). Bolo by obzvlášť zaujímavé môcť porovnať nároky na teplotu a intenzitu žiarenia medzi našimi študovanými kmeňmi a kmeňmi Monoraphidium cf. dybowskii SAG 2393 a Monoraphidium pusillum Pic 8/18 P-7w vyizolovanými v temperátnej oblasti, ktoré zdieľali s našimi kmeňmi takmer totožné sekvencie génu 18S rrna. Druh Monoraphidium sp. tvoril dominantnú zložku fytoplanktónu zamrznutých jazier Naděje a Omega 1 na ostrove Jamesa Rossa (Nedbalová, nepublikované dáta). Dominancia kokálnych zelených rias v prostredí jazier s rozsiahlou ľadovou pokrývkou je neobvyklá. Butler et al. (2000) síce pozorovali dominanciu druhu Ankistrodesmus falcatus vo fytoplanktóne jazera Tranquil na ostrove Signy, ale oproti jazerám Naděje a Omega 1, jazero Tranquil behom leta úplne rozmŕzalo. To umožňovalo miešanie vodného stĺpca pôsobením vetra. Oproti tomu dominantnú zložku fytoplanktónu antarktických jazier s rozsiahlou ľadovou pokrývkou často tvoria bičíkaté druhy z tried Chrysophyceae, Chlorophyceae, Prasinophyceae a Cryptophyceae (Izaguire et al., 2001; Marshall & Laybourn Parry, 2002; Bell & Laybourn Parry, 2003). Prítomnosť bičíku dáva týmto organizmom schopnosť migrácie a tým možnosť upraviť svoju pozíciu a zároveň schopnosť udržať sa v stabilnom vodnom stĺpci (Priscu & Neale, 1995). Ako už bolo spomínané v úvode, v antarktických jazerách bol zaznamenaný výskyt ďalších zástupcov z čeľade Selenastraceae ako napríklad Ankistrodesmus falcatus, Monoraphidium contortum, M. minutum, M. griffithii (Butler et al., 2000; Izaguirre et al., 2001; Izaguirre et al., 2003). Identifikácia týchto druhov bola založená len na morfologických znakoch pozorovaných pomocou svetelného mikroskopu. Výsledky štúdie Fawley et al. (2005) naznačujú, že diakritické znaky využívane k vymedzeniu druhov v čeľadi Selenastraceae, minimálne u polyfyletických rodov Monoraphidium a Ankistrodesmus, nie sú spoľahlivé a je veľmi ťažké presne priradiť zástupcu čeľade Selenastraceae z prírodného vzorku k druhu len na základe morfologických znakov viditeľných pod svetelným 40

48 mikroskopom. Bolo by zaujímavé, obzvlášť vo svetle výsledkov Fawley et al. (2005), môcť zistiť príbuznosť týchto organizmov z ďalších antarktických lokalít s našimi študovanými kmeňmi a taktiež s kmeňmi vyizolovanými v temperátnych a tropických oblastiach. Ako ukázali výsledky fylogenetických analýz génu 18S rrna, najbližšími príbuzný našich študovaných kmeňov Monoraphidium A, Monoraphidium B a Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25, sú kmene Monoraphidium cf. dybowskii SAG 2393 a Monoraphidium pusillum Pic 8/18 P-7w vyizolované v temperátnej oblasti. Tieto výsledky by mohli byť ďalším príspevkom do diskusie ohľadne rozšírenia mikroorganizmov a endemizme v polárnych oblastiach. V nedávnej štúdií Hodač et al. (2016) sa ukázalo, že polárne kmene rodov Chlorella a Stichococcus sú blízko príbuzné kmeňom pochádzajúcim z temperátnej oblasti, čo poukazuje na možný široký areál ich rozšírenia. Oproti tomu, napríklad štúdie zaoberajúce sa rozsievkami ukazujú významný podiel endemických druhov v Antarktíde (Van de Vijver et al., 2011; Souffreau et al., 2013) Zloženie mastných kyselín a biotechnológie Psychrofilné a psychrotrofné organizmy si vyvinuli rad stratégií, ktoré im umožňujú rásť v extrémnom prostredí nízkych teplôt (D'Amico et al., 2006). Ich úspešné prežitie je zvyčajne spojené s produkciou špecifických látok medzi ktoré patria aj polynenasýtené mastné kyseliny (PUFA). U študovaných kmeňov Monoraphidium A, Monoraphidium B a Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 kultivovaných pri nízkej teplote a nízkej intenzite žiarenia (3 C; 10 µmol m 2 s 1 ) mali v bunkách dominantné zastúpenie práve PUFA. U kmeňa A tvorili PUFA 72,2 %, kmeňa B 69,7 % a kmeňa CCAP 202/25 60,5 % z celkového množstva mastných kyselín obsiahnutých v ich bunkách. Vysoká koncentrácia PUFA je jedným z najlepšie dokumentovaných mechanizmov chladovej tolerancie a bola zaznamenaná u polárnych rozsievok, obrneniek a zelených rias (Morgan-Kiss et al., 2002; Thomson et al., 2004; Teoh et al., 2013). Řezanka et al. (2008) zistili, že obsah PUFA môže byť viac než 75 % z celkového množstva mastných kyselín v bunkách snežnej riasy Chloromonas brevispina. Rovnako vysokú koncentráciu PUFA pozorovali An et al. (2013) u antarktickej zelenej riasy Chlamydomonas sp. ICE-L. Zvýšená koncentrácia PUFA zvyšuje fluiditu bunečných membrán a tým zabraňuje ich stuhnutiu pri nízkej teplote (Chintalapati et al., 2004; Morgan-Kiss et al., 2006). Na zloženie mastných kyselín môže mať vplyv aj intenzita žiarenia. Mock & Kroon (2002) ukázali 50% nárast špecifických PUFA asociovaných s membránou tylakoidov u kultúry rozsievok vyizolovaných z morského ľadu rastúcich pri teplote 1 C a intenzite žiarenia 2 µmol m 2 s 1 oproti kultúre rastúcej pri 41

49 15 µmol m 2 s 1. Tieto špecifické PUFA zvyšujú fluiditu membrán tylakoidov a tým aj tok elektrónov. Produkcia týchto látok samozrejme okrem významu pre samotné bunky má potenciálny význam pre biotechnologický priemysel. Kyselina α-linolenová (ALA, 18:3ω-3), kyselina stearidononová (SDA, 18:4ω-3), kyselina eikozapentaénová (EPA, 20:5ω-3) a kyselina dokozahexaénová (DHA, 22:6ω-3) patria medzi omega-3 mastné kyseliny. Štúdie ukazujú na pozitívne účinky týchto látok, najmä EPA a DHA, na ľudský organizmus. Ich konzumácia je spojená s priaznivým vplyvom na kardiovaskulárny systém a choroby s ním spojené (GISSI- Prevenzione Investigators, 1999; Wang et al., 2006). Hlavným zdrojom EPA a DHA v ľudskej strave je konzumácia morských rýb ako losos, tuniak, makrely, sardinky (Hibbeln et al., 2006). So zvýšený dopytom po omega-3 mastných kyselinách sa hľadajú alternatívne zdroje týchto látok, ktorými sú napríklad riasy. V bunkách kmeňa Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 mala dominantné zastúpenie ALA, ktorá tvorila 22,5 % z celkového množstva mastných kyselín obsiahnutých v ich bunkách. Táto mastná kyselina mala významný podiel taktiež u kmeňov Monoraphidium A a Monoraphidium B (13,7 a 10,5 %). ALA spolu s kyselinou linolovou (LA, 18:2ω-6) patria medzi esenciálne mastné kyseliny, ktoré musí človek primať z potravy, pretože si ich nevie sám biosyntetizovať. Niektoré štúdie ukazujú, že u ľudí je premena ALA na mastné kyseliny s dlhším reťazcom ako EPA a DHA obmedzená (Pawlowsky et al., 2001; Burge & Calder, 2005). Objavujú sa štúdie ktoré ukazujú, že iná omega-3 mastná kyselina rastlinného pôvodu, SDA, je v tele efektívnejšie premieňaná na EPA oproti ALA a preto môže poskytnúť dobrý spôsob ako zvýšiť úroveň EPA v ľudskom tele (James et al., 2003; Harris et al., 2008; Lemke et al., 2010). Okrem toho, riasy obsahujúce vyšší podiel SDA môžu byť vhodnou zložkou krmiva v akvakultúrach rýb. Miller et al. (2007) ukázali, že atlantický losos môže byť chovaný na krmive, v ktorom klasicky používaný rybí olej je nahradený rastlinným olejom obsahujúcim 14 % SDA bez očividného ovplyvnenia rastu, zdravia a redukcie obsahu EPA a DHA u týchto rýb. Práve SDA tvorila dominantnú zložku PUFA študovaných kmeňov Monoraphidium A a Monoraphidium B. U kmeňa A tvorila 34,9 % a kmeňa B 30 % z celkového množstva mastných kyselín obsiahnutých v ich bunkách. U kmeňa Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 mala táto kyselina taktiež významný podiel (15,3 %). Obsah tejto kyseliny u ďalších kmeňov rodu Monoraphidium a Ankistrodesmus v zbierke kultúr SAG nikdy nepresahoval 22 % a u väčšiny kmeňov bol pod 10 %. U kmeňov A a B mala významný podiel aj kyselina hexadekatetraenová [16:4 (3,6,9,12)] 18,5 % a 23,1 %. Kyselina hexadekatetraenová ale 42

50 s inými pozíciami dvojitých vezieb [16:4 (4,7,11,13)] bola identifikovaná aj u dalších kmeňov rodu Monoraphidium a Ankistrodesmus v zbierke kultúr SAG pričom ale podiel tejto mastnej kyseliny u väčšiny z nich bol pod 10 % (Lang et al., 2011). V poslednej dobe sa venuje zástupcom čeľade Selenastraceae zvýšená pozornosť v spojitosti s ich využitím v biotechnológiách. Niekoľko kmeňov z rodov Monoraphidium a Ankistrodesmus bolo identifikovaných ako potenciálny zdroj lipidov na produkciu biopalív (Yu et al., 2012; Bogen et al., 2013; He et al., 2015). Schopnosť našich študovaných kmeňov Monoraphidium A, Monoraphidium B a Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 dosahovať relatívne vysokú rýchlosť rastu v širokom rozmedzí teplôt a nízke nároky na intenzitu žiarenia dávajú týmto kmeňom potenciál efektívnej kultivácie v chladných klimatických oblastiach bez požiadavku na reguláciu teploty. 43

51 6. Záver Výsledky fylogenetických analýz sekvencií 18S rdna kmeňov Monoraphidium A, Monoraphidium B a Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 potvrdili ich príslušnosť ku čeľadi Selenastraceae (Chlorophyceae, Sphaeropleales). Kmene A a B spadajú do kladu Monoraphidium-like-II, ktorý nezahrňuje typový druh rodu Monoraphidium [Monoraphidium griffithii (Berkley) Komárková-Legnerová], preto by mohli ďalšie taxonomické štúdie zástupcom tohto kladu priradiť nové rodové meno. Naopak kmeň CCAP 202/25 je blízko príbuzný druhu Monoraphidium griffithii, čo naznačuje jeho nesprávne zaradenie k rodu Ankistrodesmus. Typový druh rodu Ankistrodesmus [Ankistrodesmus fusiformis Corda] spadá do iného kladu. Na základe fylogenetických analýz sekvencií 18S rdna, sekundárnej štruktúry ITS2 a morfológie buniek, kmene A a B patria k jednému druhu rodu Monoraphidium, ktorý by v budúcnosti mohol byť pravdepodobne popísaní ako nový. Všetky tri študované kmene sú blízko príbuzné temperátnym kmeňom čo by mohlo naznačovať široký areál rozšírenia daných druhov. Je to prvá zmienka o tom, že sú kokálne zelené riasy schopné stať sa dominantnými primárnymi producentmi v extrémnom prostredí antarktických jazier s rozsiahlou ľadovou pokrývkou. Všetky tri študované kmene dokázali rásť v relatívne širokom rozpätí teplôt, 1 20 C (A a B) a 1 30 C (CCAP 202/25), najrýchleší rast bol pozorovaný v rozmedzí 6 20 C, respektíve 6 25 C. Schopnosť udržovať relatívne vysokú rýchlosť rastu aj pri veľmi nízkych teplotách mimo ich optimálnu teplotu rastu im umožňuje prežiť v ich prirodzenom prostredí. Všetky tri kmene sú dobre prispôsobené na život pri nízkej intenzite žiarenia, ktorej sú vystavené v ich prirodzenom prostredí. Rýchlosť rastu dosahovala najvyšších hodnôt pri intenzite žiarenia 9 16 µmol m 2 s 1. Pri kultivácií týchto kmeňov v nízkej teplote a nízkej intenzite žiarenia mali v ich bunkách dominantné zastúpenie polynenasýtené mastné kyseliny (PUFA). Vysoká koncentrácia PUFA patrí medzi najlepšie dokumentované mechanizmy chladovej tolerancie. Schopnosť týchto študovaných kmeňov dosahovať relatívne vysokú rýchlosť rastu v širokom rozmedzí teplôt a nízke nároky na intenzitu žiarenia dávajú týmto kmeňom potenciál efektívnej kultivácie v chladných klimatických oblastiach bez požiadavku na reguláciu teploty a ožiarenia. Tieto vlastnosti spolu so zaujímavý obsahom PUFA robia 44

52 z týchto kmeňov dobrých kandidátov na ďalšie štúdium ich možnosti využitia v biotechnológiách. 45

53 7. Zoznam použitej literatúry Ahn, J. W., Hwangbo, K., Lee, S. Y., Choi, H. G., Park, Y. I., Liu, J. R., & Jeong, W. J. (2012). A new Arctic Chlorella species for biodiesel production. Bioresource Technology, 125, Allende, L., & Izaguirre, I. (2003). The role of physical stability on the establishment of steady states in the phytoplankton community of two Maritime Antarctic lakes. Hydrobiologia, 502, Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., & Lipman, D. J. (1990). Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology, 215, An, M., Mou, S., Zhang, X., Ye, N., Zheng, Z., Cao, S., Xu, D., Fan, X., Wang, Y., & Miao, J. (2013). Temperature regulates fatty acid desaturases at a transcriptional level and modulates the fatty acid profile in the Antarctic microalga Chlamydomonas sp. ICE-L. Bioresource Technology, 134, Andersson, A., Falk, S., Samuelsson, G., & Hagström, Å. (1989). Nutritional characteristics of a mixotrophic nanoflagellate, Ochromonas sp. Microbial Ecology, 17, Arrigo, K. R., Mills, M. M., Kropuenske, L. R., van Dijken, G. L., Alderkamp, A. C., & Robinson, D. H. (2010). Photophysiology in two major Southern Ocean phytoplankton taxa: photosynthesis and growth of Phaeocystis antarctica and Fragilariopsis cylindrus under different irradiance levels. Integrative and Comparative Biology, 50, Bell, E. M., & Laybourn Parry, J. (1999). Annual plankton dynamics in an Antarctic saline lake. Freshwater Biology, 41, Bell, E. M., & Laybourn Parry, J. (2003). Mixotrophy in the Antarctic phytoflagellate, Pyramimonas gelidicola (Chlorophyta: Prasinophyceae). Journal of Phycology, 39, Belzile, C., Vincent, W. F., Gibson, J. A., & Hove, P. V. (2001). Bio-optical characteristics of the snow, ice, and water column of a perennially ice-covered lake in the High Arctic. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 58, Bischoff, H. W., & Bold, H. C. (1963). Some soil algae from Enchanted Rock and related algal species. Phycological Studies IV. University of Texas Publications, 6318, Bogen, C., Klassen, V., Wichmann, J., La Russa, M., Doebbe, A., Grundmann, M., Uronen, P., Kruse, O., & Mussgnug, J. H. (2013). Identification of Monoraphidium contortum as a promising species for liquid biofuel production. Bioresource Technology, 133, Burdge, G. C., & Calder, P. C. (2005). Conversion of α-linolenic acid to longer-chain polyunsaturated fatty acids in human adults. Reproduction Nutrition Development, 45, Butler, H. G., Edworthy, M. G., & Ellis Evans, J. C. (2000). Temporal plankton dynamics in an oligotrophic maritime Antarctic lake. Freshwater Biology, 43, Caisová, L., Marin, B., & Melkonian, M. (2011). A close-up view on ITS2 evolution and speciation - a case study in the Ulvophyceae (Chlorophyta, Viridiplantae). BMC Evolutionary Biology, 11,

54 Caisová, L., Marin, B., & Melkonian, M. (2013). A consensus secondary structure of ITS2 in the Chlorophyta identified by phylogenetic reconstruction. Protist, 164, Campbell, J. W., & Aarup, T. (1989). Photosynthetically available radiation at high latitudes. Limnology and Oceanography, 34, Cavicchioli, R., Charlton, T., Ertan, H., Omar, S. M., Siddiqui, K. S., & Williams, T. J. (2011). Biotechnological uses of enzymes from psychrophiles. Microbial Biotechnology, 4, Cao, K., He, M., Yang, W., Chen, B., Luo, W., Zou, S., & Wang, C. (2016). The eurythermal adaptivity and temperature tolerance of a newly isolated psychrotolerant Arctic Chlorella sp. Journal of Applied Phycology, 28, Caron, D. A., Porter, K. G., & Sanders, R. W. (1990). Carbon, nitrogen, and phosphorus budgets for the mixotrophic phytoflagellate Poterioochromonas malhamensis (Chrysophyceae) during bacterial ingestion. Limnology and Oceanography, 35, Coleman, A. W. (2000). The significance of a coincidence between evolutionary landmarks found in mating affinity and a DNA sequence. Protist, 151, 1 9. Coleman, A. W. (2003). ITS2 is a double-edged tool for eukaryote evolutionary comparisons. TRENDS in Genetics, 19, Cordellat, C. R. (2012). Functional ecology of microbial freshwater commnunities from Byers Peninsula (Livigston Island, Antarctica) (Doctoral dissertation, Universitat de València, Facultat de Ciències Biològiques). Cota, G. F. (1985). Photoadaptation of high Arctic ice algae. Nature, 315, D'Amico, S., Claverie, P., Collins, T., Georlette, D., Gratia, E., Hoyoux, A., Meuwis, M.A., Feller, G., & Gerday, C. (2002). Molecular basis of cold adaptation. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences, 357, D'amico, S., Collins, T., Marx, J. C., Feller, G., & Gerday, C. (2006). Psychrophilic microorganisms: challenges for life. EMBO reports, 7, Darty, K., Denise, A., & Ponty, Y. (2009). VARNA: Interactive drawing and editing of the RNA secondary structure. Bioinformatics, 25, Davies, B. J., Glasser, N. F., Carrivick, J. L., Hambrey, M. J., Smellie, J. L., & Nývlt, D. (2013). Landscape evolution and ice-sheet behaviour in a semi-arid polar environment: James Ross Island, NE Antarctic Peninsula. Geological Society, London, Special Publications, 381, Demmig-Adams, B., Cohu, C. M., Muller, O., & Adams III, W. W. (2012). Modulation of photosynthetic energy conversion efficiency in nature: from seconds to seasons. Photosynthesis Research, 113, Devos, N., Ingouff, M., Loppes, R., & Matagne, R. F. (1998). RUBISCO adaptation to low temperatures: a comparative study in psychrophilic and mesophilic unicellular algae. Journal of Phycology, 34,

55 Di Martino Rigano, V., Vona, V., Lobosco, O., Carillo, P., Lunn, J. E., Carfagna, S., Esposito, S., Caiazzo, M., & Rigano, C. (2006). Temperature dependence of nitrate reductase in the psychrophilic unicellular alga Koliella antarctica and the mesophilic alga Chlorella sorokiniana. Plant, Cell & Environment, 29, Dolhi, J. M. (2014). Environmental impacts on RubisCO: From green algal laboratory isolates to Antarctic lake communities (Doctoral dissertation, Miami University). Dolhi, J. M., Maxwell, D. P., & Morgan-Kiss, R. M. (2013). Review: the Antarctic Chlamydomonas raudensis: an emerging model for cold adaptation of photosynthesis. Extremophiles, 17, Ellis-Evan, J. C., Layboum-Parry, J., Bayliss, P. R., & Perriss, S. J. (1998). Physical, chemical and microbial community characteristics of lakes of the Larsemann Hills, Continental Antarctica. Archiv für Hydrobiologie, 141, Eloranta, V. (1979). The compound internal pyrenoid in cultured cells of the green alga Monoraphidium griffithii (Berkel.) Komar.-Legner. Protoplasma, 99, Elster, J., Nedbalová, L., Vodrážka, R., Láska, K., Haloda, J., & Komárek, J. (2016). Unusual biogenic calcite structures in two shallow lakes, James Ross Island, Antarctica. Biogeosciences, 13, Ensminger, I., Busch, F., & Hüner, N. (2006). Photostasis and cold acclimation: sensing low temperature through photosynthesis. Physiologia Plantarum, 126, Fawley, M. W., Dean, M. L., Dimmer, S. K., & Fawley, K. P. (2005). Evaluating the morphospedies concept in the Selenastraceae (Chlorophyceae, Chlorophyta). Journal of Phycology, 42, GISSI-Prevenzione Investigators. (1999). Dietary supplementation with n-3 polyunsaturated fatty acids and vitamin E after myocardial infarction: results of the GISSI-Prevenzione trial. The Lancet, 354, Griffith, M., & Ewart, K. V. (1995). Antifreeze proteins and their potential use in frozen foods. Biotechnology Advances, 13, Hamby, K. R., Sims, L., Issel, L., & Zimmer, E. (1988). Direct ribosomal RNA sequencing: optimization of extraction and sequencing methods for work with higher plants. Plant Molecular Biology Reporter, 6, Harris, W. S., Lemke, S. L., Hansen, S. N., Goldstein, D. A., DiRienzo, M. A., Su, H., Nemeth, M. A., Taylor, M. L., Ahmed, G., & George, C. (2008). Stearidonic acid-enriched soybean oil increased the omega-3 index, an emerging cardiovascular risk marker. Lipids, 43, Hawes, I. (1985). Light climate and phytoplankton photosynthesis in maritime Antarctic lakes. Hydrobiologia, 123, Hawes, I., & Schwarz, A. M. (1999). Photosynthesis in an extreme shade environment: benthic microbial mats from Lake Hoare, a permanently ice covered Antarctic lake. Journal of Phycology, 35,

56 He, Q., Yang, H., & Hu, C. (2015). Optimizing light regimes on growth and lipid accumulation in Ankistrodesmus fusiformis H1 for biodiesel production. Bioresource Technology, 198, Hegewald, E., & Wolf, M. (2003). Phylogenetic relationships of Scenedesmus and Acutodesmus (Chlorophyta, Chlorophyceae) as inferred from 18S rdna and ITS-2 sequence comparisons. Plant Systematics and Evolution, 241, Henshaw, T., & Laybourn-Parry, J. (2002). The annual patterns of photosynthesis in two large, freshwater, ultra-oligotrophic Antarctic lakes. Polar Biology, 25, Heo, J., Cho, D. H., Ramanan, R., Oh, H. M., & Kim, H. S. (2015). PhotoBiobox: a tablet sized, low-cost, high throughput photobioreactor for microalgal screening and culture optimization for growth, lipid content and CO 2 sequestration. Biochemical Engineering Journal, 103, Hibbeln, J. R., Nieminen, L. R., Blasbalg, T. L., Riggs, J. A., & Lands, W. E. (2006). Healthy intakes of n 3 and n 6 fatty acids: estimations considering worldwide diversity. The American Journal of Clinical Nutrition, 83, Hodač, L., Brinkmann, N., Mohr, K. I., Arp, G., Hallmann, C., Ramm, J., Spitzer, K., & Friedl, T. (2015). Diversity of microscopic green algae (Chlorophyta) in calcifying biofilms of two karstic streams in Germany. Geomicrobiology Journal, 32, Hodač, L., Hallmann, C., Spitzer, K., Elster, J., Faßhauer, F., Brinkmann, N., Lepka, D., Diwan, V., & Friedl, T. (2016). Widespread green algae Chlorella and Stichococcus exhibit polar-temperate and tropical-temperate biogeography. FEMS Microbiology Ecology, fiw122. Holbrook, G. P., Davidson, Z., Tatara, R. A., Ziemer, N. L., Rosentrater, K. A., & Grayburn, W. S. (2014). Use of the microalga Monoraphidium sp. grown in wastewater as a feedstock for biodiesel: cultivation and fuel characteristics. Applied Energy, 131, Hoshina, R. (2014). DNA analyses of a private collection of microbial green algae contribute to a better understanding of microbial diversity. BMC Research Notes, 7, 592. Chintalapati, S., Kiran, M. D., & Shivaji, S. (2004). Role of membrane lipid fatty acids in cold adaptation. Cellular and Molecular Biology, 50, Izaguirre, I., Vinocur, A., Mataloni, G., & Pose, M. (1998). Phytoplankton communities in relation to trophic status in lakes from Hope Bay (Antarctic Peninsula). Hydrobiologia, 369, Izaguirre, I., Mataloni, G., Allende, L., & Vinocur, A. (2001). Summer fluctuations of microbial planktonic communities in a eutrophic lake Cierva Point, Antarctica. Journal of Plankton Research, 23, Izaguirre, I., Allende, L., & Marinone, M. C. (2003). Comparative study of the planktonic communities of three lakes of contrasting trophic status at Hope Bay (Antarctic Peninsula). Journal of Plankton Research, 25, James, M. J., Ursin, V. M., & Cleland, L. G. (2003). Metabolism of stearidonic acid in human subjects: comparison with the metabolism of other n 3 fatty acids. The American Journal of Clinical Nutrition, 77,

57 Jones, R. I. (2000). Mixotrophy in planktonic protists: an overview. Freshwater Biology, 45, Katana, A., Kwiatowski, J., Spalik, K., Zakryś, B., Szalacha, E., & Szymańska, H. (2001). Phylogenetic position of Koliella (Chlorophyta) as inferred from nuclear and chloroplast small subunit rdna. Journal of Phycology, 37, Kol, E., & Flint, E. A. (1968). Algae in green ice from the Balleny Islands, Antarctica. New Zealand Journal of Botany, 6, Komárek, J. & Fott, B. (1983). Chlorophyceae (Grünalgen), Ordnung Chlorococcales. In Huber-Pestalozzi, G. (Ed.), Das Phytoplankton des Süsswassers, Die Binnengewässer 16 (pp ). Schweizerbart Verlag, Stuttgart. Komárková-Legnerová, J. (1969). The systematics and ontogenesis of the genera Ankistrodesmus Corda and Monoraphidium gen. nov. In Fott, B. (Ed.), Studies in Phycology (pp ). Academia, Prague. Krienitz, L., & Bock, C. (2012). Present state of the systematics of planktonic coccoid green algae of inland waters. Hydrobiologia, 698, Krienitz, V. L., & Klein, H. H. (1983). Morphology and ultrastructure of some species of the genus Monoraphidium (Chlorellales) I. Monoraphidium griffithii, M. neglectum and M. tortile. Algological Studies, 33, Krienitz, L., Ustinova, I., Friedl, T., & Huss, V. A. (2001). Traditional generic concepts versus 18S rrna gene phylogeny in the green algal family Selenastraceae (Chlorophyceae, Chlorophyta). Journal of Phycology, 37, Krienitz, L., Bock, C., Nozaki, H., & Wolf, M. (2011). SSU rrna gene phylogeny of morphospecies affiliated to the bioassay alga "Selenastrum capricornutum" recovered the polyphyletic origin of crescent-shaped Chlorophyta. Journal of Phycology, 47, Kvíderová, J. (2010). Rapid algal toxicity assay using variable chlorophyll fluorescence for Chlorella kessleri (Chlorophyta). Environmental Toxicology, 25, Kvíderová, J., & Henley, W. J. (2005). The effect of ampicillin plus streptomycin on growth and photosynthesis of two halotolerant chlorophyte algae. Journal of Applied Phycology, 17, Kvíderová, J., & Lukavský, J. (2001). A new unit for crossed gradients of temperature and light. Nova Hedwigia Beiheft, 123, Lang, I., Hodač, L., Friedl, T., & Feussner, I. (2011). Fatty acid profiles and their distribution patterns in microalgae: a comprehensive analysis of more than 2000 strains from the SAG culture collection. BMC Plant Biology, 11, 124. Láska, K., Prošek, P., & Budík, L. (2010). Seasonal variation of air temperature at the Mendel Station, James Ross Island in the period of In EGU General Assembly Conference Abstracts, 12, Láska, K., Barták, M., Hájek, J., Prošek, P., & Bohuslavová, O. (2011). Climatic and ecological characteristics of deglaciated area of James Ross Island, Antarctica, with a special respect to vegetation cover. Czech Polar Reports, 1,

58 Laybourn-Parry, J. (2002). Survival mechanisms in Antarctic lakes. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences, 357, Laybourn-Parry, J. (2009). No place too cold. Science, 324, Laybourn-Parry, J., & Pearce, D. A. (2007). The biodiversity and ecology of Antarctic lakes: models for evolution. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences, 362, Laybourn-Parry, J., James, M. R., McKnight, D. M., Priscu, J., Spaulding, S. A., & Shiel, R. (1997). The microbial plankton of Lake Fryxell, southern Victoria Land, Antarctica during the summers of 1992 and Polar Biology, 17, Laybourn-Parry, J., Quayle, W., & Henshaw, T. (2002). The biology and evolution of Antarctic saline lakes in relation to salinity and trophy. Polar Biology, 25, Laybourn-Parry, J., Marshall, W. A., & Marchant, H. J. (2005). Flagellate nutritional versatility as a key to survival in two contrasting Antarctic saline lakes. Freshwater Biology, 50, Lemke, S. L., Vicini, J. L., Su, H., Goldstein, D. A., Nemeth, M. A., Krul, E. S., & Harris, W. S. (2010). Dietary intake of stearidonic acid enriched soybean oil increases the omega-3 index: randomized, double-blind clinical study of efficacy and safety. The American Journal of Clinical Nutrition, 92, Lewis, L. A., & Flechtner, V. R. (2004). Cryptic species of Scenedesmus (Chlorophyta) from desert soil communities of western North America. Journal of Phycology, 40, Likeš, J., & Laga, J. (1978). Základní statistické tabulky. SNTL. Lizotte, M. P., & Priscu, J. C. (1992). Photosynthesis irradiance relationships in phytoplankton from the physically stable water column of a perennially ice covered lake (lake Bonney, Antarctica). Journal of Phycology, 28, Loppes, R., Devos, N., Willem, S., Barthélemy, P., & Matagne, R. F. (1996). Effect of temperature on two enzymes from a psychrophilic Chloromonas (Chlorophyta). Journal of Phycology, 32, Mai, J. C., & Coleman, A. W. (1997). The internal transcribed spacer 2 exhibits a common secondary structure in green algae and flowering plants. Journal of Molecular Evolution, 44, Marshall, W., & Laybourn Parry, J. (2002). The balance between photosynthesis and grazing in Antarctic mixotrophic cryptophytes during summer. Freshwater Biology, 47, Martin, P. J., & Peel, D. A. (1978). The spatial distribution of 10 m temperatures in the Antarctic Peninsula. Journal of Glaciology, 20, Maxwell, D. P., Falk, S., Trick, C. G., & Huner, N. P. (1994). Growth at low temperature mimics high-light acclimation in Chlorella vulgaris. Plant Physiology, 105, McKnight, D. M., Howes, B. L., Taylor, C. D., & Goehringer, D. D. (2000). Phytoplankton dynamics in a stably stratified Antarctic lake during winter darkness. Journal of Phycology, 36,

59 Miller, M. R., Nichols, P. D., & Carter, C. G. (2007). Replacement of dietary fish oil for Atlantic salmon parr (Salmo salar L.) with a stearidonic acid containing oil has no effect on omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acid concentrations. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 146, Miyachi, S., Tsuzuki, M., Maruyama, I., Gantar, M., Miyachi, S., & Matsushima, H. (1986). Effects of CO 2 concentration during growth on the intracellular structure of Chlorella and Scenedesmus (Chlorophyta). Journal of Phycology, 22, Mock, T., & Kroon, B. M. (2002). Photosynthetic energy conversion under extreme conditions II: the significance of lipids under light limited growth in Antarctic sea ice diatoms. Phytochemistry, 61, Morgan, R. M., Ivanov, A. G., Priscu, J. C., Maxwell, D. P., & Huner, N. P. (1998). Structure and composition of the photochemical apparatus of the Antarctic green alga, Chlamydomonas subcaudata. Photosynthesis Research, 56, Morgan-Kiss, R., Ivanov, A. G., Williams, J., Khan, M., & Huner, N. P. (2002). Differential thermal effects on the energy distribution between photosystem II and photosystem I in thylakoid membranes of a psychrophilic and a mesophilic alga. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 1561, Morgan Kiss, R. M., Ivanov, A. G., Pocock, T., Król, M., Gudynaite Savitch, L., & Hüner, N. (2005). The antarctic psychrophile, Chlamydomonas raudensis Ettl (UWO241) (Chlorophyceae, Chlorophyta), exhibits a limited capacity to photoacclimate to red light. Journal of Phycology, 41, Morgan-Kiss, R. M., Priscu, J. C., Pocock, T., Gudynaite-Savitch, L., & Huner, N. P. (2006). Adaptation and acclimation of photosynthetic microorganisms to permanently cold environments. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 70, Morgan-Kiss, R. M., Ivanov, A. G., Modla, S., Czymmek, K., Hüner, N. P., Priscu, J. C., Lisle, J.T., & Hanson, T. E. (2008). Identity and physiology of a new psychrophilic eukaryotic green alga, Chlorella sp., strain BI, isolated from a transitory pond near Bratina Island, Antarctica. Extremophiles, 12, Morgan Kiss, R. M., Lizotte, M. P., Kong, W., & Priscu, J. C. (2016). Photoadaptation to the polar night by phytoplankton in a permanently ice covered Antarctic lake. Limnology and Oceanography, 61, Morita, R. Y. (1975). Psychrophilic bacteria. Bacteriological Reviews, 39, Müller, T., Philippi, N., Dandekar, T., Schultz, J., & Wolf, M. (2007). Distinguishing species. RNA, 13, Napolitano, M. J., & Shain, D. H. (2004). Four kingdoms on glacier ice: convergent energetic processes boost energy levels as temperatures fall. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences, 271, Napolitano, M. J., & Shain, D. H. (2005). Distinctions in adenylate metabolism among organisms inhabiting temperature extremes. Extremophiles, 9, Neale, P. J., & Priscu, J. C. (1998). Fluorescence quenching in phytoplankton of the McMurdo Dry Valley lakes (Antarctica): Implications for the structure and function of the 52

60 photosynthetic apparatus. In Priscu, J. C. (Ed.), Ecosystem dynamic in a polar desert: the McMurdo Dry Valleys, Antarctica (pp ). American Geophysical Union, Washington. Nedbalová, L., Nývlt, D., Kopáček, J., Šobr, M., & Elster, J. (2013). Freshwater lakes of Ulu Peninsula, James Ross Island, north-east Antarctic Peninsula: origin, geomorphology and physical and chemical limnology. Antarctic Science, 25, Niyogi, K. K., Björkman, O., & Grossman, A. R. (1997). The roles of specific xanthophylls in photoprotection. Proceedings of the National Academy of Sciences, 94, Nygaard, K., & Tobiesen, A. (1993). Bacterivory in algae: a survival strategy during nutrient limitation. Limnology and Oceanography, 38, Öquist, G., & Huner, N. P. (2003). Photosynthesis of overwintering evergreen plants. Annual Review of Plant Biology, 54, Øvstedal, D. O., & Smith, R. L. (2001). Lichens of Antarctica and South Georgia: a guide to their identification and ecology. Cambridge University Press, Cambridge. Pawlosky, R. J., Hibbeln, J. R., Novotny, J. A., & Salem, N. (2001). Physiological compartmental analysis of α-linolenic acid metabolism in adult humans. Journal of Lipid Research, 42, Peksa, O., & Škaloud, P. (2011). Do photobionts influence the ecology of lichens? A case study of environmental preferences in symbiotic green alga Asterochloris (Trebouxiophyceae). Molecular Ecology, 20, Piganeau, G., Eyre-Walker, A., Grimsley, N., & Moreau, H. (2011). How and why DNA barcodes underestimate the diversity of microbial eukaryotes. PLoS One, 6, e Posada, D. (2008). jmodeltest: phylogenetic model averaging. Molecular Biology and Evolution, 25, Powell, L. M., Bowman, J. P., Skerratt, J. H., Franzmann, P. D., & Burton, H. R. (2005). Ecology of a novel Synechococcus clade occurring in dense populations in saline Antarctic lakes. Marine Ecology Progress Series, 291, Priscu, J. C., & Neale, P. J. (1995). Phototactic response of phytoplankton forming discrete layers within the water column of Lake Bonney, Antarctica. Antarctic Journal of the United States, 30, Rabassa, J., Skvarca, P., Bertani, L., & Mazzoni, E. (1982). Glacier inventory of James Ross and Vega Islands, Antarctic Peninsula. Annals of Glaciology, 3, Rambaut, A. (2014). FigTree Version Institute of Evolutionary Biology, University of Edinburgh. Available at: Raymond, J. A., & Fritsen, C. H. (2001). Semipurification and ice recrystallization inhibition activity of ice-active substances associated with Antarctic photosynthetic organisms. Cryobiology, 43, Raymond, J. A., & Kim, H. J. (2012). Possible role of horizontal gene transfer in the colonization of sea ice by algae. PLoS ONE, 7, e

61 Raymond, J. A., & Morgan-Kiss, R. (2013). Separate origins of ice-binding proteins in Antarctic Chlamydomonas species. PLoS ONE, 8, e Raymond, J. A., Janech, M. G., & Fritsen, C. H. (2009). Novel ice-binding proteins from a psychrophilic antarctic alga (Chlamydomonadaceae, Chlorophyceae). Journal of Phycology, 45, Roberts, E. C., & Laybourn Parry, J. (1999). Mixotrophic cryptophytes and their predators in the Dry Valley lakes of Antarctica. Freshwater Biology, 41, Roberts, E. C., Priscu, J. C., & Laybourn Parry, J. (2004). Microplankton dynamics in a perennially ice covered Antarctic lake Lake Hoare. Freshwater Biology, 49, Ronquist, F., Teslenko, M., van der Mark, P., Ayres, D. L., Darling, A., Höhna, S., Larget, B., Liu, l., Suchard, M.A., & Huelsenbeck, J. P. (2012). MrBayes 3.2: efficient Bayesian phylogenetic inference and model choice across a large model space. Systematic Biology, 61, Russell, N. J. (2006). Antarctic microorganisms: coming in from the cold. Culture, 27, 1 4. Řezanka, T., Nedbalová, L., & Sigler, K. (2008). Unusual medium-chain polyunsaturated fatty acids from the snow alga Chloromonas brevispina. Microbiological Research, 163, Savitch, L. V., Maxwell, D. P., & Huner, N. P. (1996). Photosystem II excitation pressure and photosynthetic carbon metabolism in Chlorella vulgaris. Plant Physiology, 111, Säwström, C., Lisle, J., Anesio, A. M., Priscu, J. C., & Laybourn-Parry, J. (2008). Bacteriophage in polar inland waters. Extremophiles, 12, Seaburg, K. G., Parked, B. C., Wharton, R. A., & Simmons, G. M. (1981). Temperature growth responses of algal isolates from antarctic oases. Journal of Phycology, 17, Schultz, J., Maisel, S., Gerlach, D., Müller, T., & Wolf, M. (2005). A common core of secondary structure of the internal transcribed spacer 2 (ITS2) throughout the Eukaryota. RNA, 11, Siegert, M. J., Ross, N., & Le Brocq, A. M. (2016). Recent advances in understanding Antarctic subglacial lakes and hydrology. Philosophical Transactions of the Royal Society A, 374, Souffreau, C., Vanormelingen, P., Van de Vijver, B., Isheva, T., Verleyen, E., Sabbe, K., & Vyverman, W. (2013). Molecular evidence for distinct Antarctic lineages in the cosmopolitan terrestrial diatoms Pinnularia borealis and Hantzschia amphioxys. Protist, 164, Swofford, D. L. (2003). PAUP*: phylogenetic analysis using parsimony, version 4.0 b10. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., & Kumar, S. (2013). MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution, 30,

62 Teoh, M. L., Chu, W. L., Marchant, H., & Phang, S. M. (2004). Influence of culture temperature on the growth, biochemical composition and fatty acid profiles of six Antarctic microalgae. Journal of Applied Phycology, 16, Teoh, M. L., Phang, S. M., & Chu, W. L. (2013). Response of Antarctic, temperate, and tropical microalgae to temperature stress. Journal of Applied Phycology, 25, Thompson, J. D., Higgins, D. G., & Gibson, T. J. (1994). CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positionspecific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22, Thomson, P. G., Wright, S. W., Bolch, C. J., Nichols, P. D., Skerratt, J. H., & McMinn, A. (2004). Antarctic distribution, pigment and lipid composition, and molecular identification of the brine dinoflagellate Polarella glacialis (Dinophyceae). Journal of Phycology, 40, Thurman, J., Parry, J., Hill, P. J., Priscu, J. C., Vick, T. J., Chiuchiolo, A., & Laybourn-Parry, J. (2012). Microbial dynamics and flagellate grazing during transition to winter in Lakes Hoare and Bonney, Antarctica. FEMS Microbiology Ecology, 82, Toro, M., Camacho, A., Rochera, C., Rico, E., Bañón, M., Fernández-Valiente, E., Marco, E., Justel, A., Avendaño, M. C., Ariosa, Y., Vincent, W. F., & Quesada, A. (2007). Limnological characteristics of the freshwater ecosystems of Byers Peninsula, Livingston Island, in maritime Antarctica. Polar Biology, 30, Turner, J., Lachlan Cope, T. A., Marshall, G. J., Morris, E. M., Mulvaney, R., & Winter, W. (2002). Spatial variability of Antarctic Peninsula net surface mass balance. Journal of Geophysical Research: Atmospheres, 107, D Turner, J., Colwell, S. R., Marshall, G. J., Lachlan Cope, T. A., Carleton, A. M., Jones, P. D., Lagun, V., Reid, P. A., & Iagovkina, S. (2005). Antarctic climate change during the last 50 years. International Journal of Climatology, 25, Unrein, F., & Vinocur, A. (1999). Phytoplankton structure and dynamics in a turbid Antarctic lake (Potter Peninsula, King George Island). Polar Biology, 22, Unrein, F., Izaguirre, I., Massana, R., Balagué, V., & Gasol, J. M. (2005). Nanoplankton assemblages in maritime Antarctic lakes: characterisation and molecular fingerprinting comparison. Aquatic Microbial Ecology, 40, Van de Vijver, B., Zidarova, R., & de Haan, M. (2011). Four new Luticola taxa (Bacillariophyta) from the South Shetland Islands and James Ross Island (Maritime Antarctic Region). Nova Hedwigia, 92, Van Lipzig, N. P. M., King, J. C., Lachlan Cope, T. A., & Van den Broeke, M. R. (2004). Precipitation, sublimation, and snow drift in the Antarctic Peninsula region from a regional atmospheric model. Journal of Geophysical Research: Atmospheres, 109, D Verleyen, E., Hodgson, D. A., Gibson, J., Imura, S., Kaup, E., Kudoh, S., Kudoh, S., De Wever, A., Hoshino, T., McMinn, A., Obbels, D., Roberts, D., Roberts, S., Sabbe, K., Souffreau, C., Tavernier, I., van Nieuwenhuyze, S., van Ranst, E., Vindevogel, N., & Vyverman, W. (2012). Chemical limnology in coastal East Antarctic lakes: monitoring future climate change in centres of endemism and biodiversity. Antarctic Science, 24,

63 Vincent, W. F., Hobbie, J. E., & Laybourn-Parry, J. (2008). Introduction to the limnology of high-latitude lake and river ecosystems. In Vincent, W. F. & Laybourn-Parry, J. (Eds.), Polar lakes and rivers: Limnology of Arctic and Antarctic aquatic ecosystems (pp. 1 23). Oxford University Press, Oxford. Wang, C., Harris, W. S., Chung, M., Lichtenstein, A. H., Balk, E. M., Kupelnick, B., Jordan, H. S., & Lau, J. (2006). n 3 Fatty acids from fish or fish-oil supplements, but not α-linolenic acid, benefit cardiovascular disease outcomes in primary-and secondary-prevention studies: a systematic review. The American Journal of Clinical Nutrition, 84, White, T. J., Bruns, T., Lee, S. J. W. T., & Taylor, J. W. (1990). Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: a Guide to Methods and Applications, 18, Wiencke, C., & Fischer, G. (1990). Growth and stable carbon isotope composition of coldwater macroalgae in relation to light and temperature. Marine Ecology Progress Series, 65, Wolf, M., Chen, S., Song, J., Ankenbrand, M., & Müller, T. (2013). Compensatory base changes in ITS2 secondary structures correlate with the biological species concept despite intragenomic variability in ITS2 sequences a proof of concept. PloS One, 8, e Yang, X., Liu, P., Hao, Z., Shi, J., & Zhang, S. (2012). Characterization and identification of freshwater microalgal strains toward biofuel production. BioResources, 7, Yu, X., Zhao, P., He, C., Li, J., Tang, X., Zhou, J., & Huang, Z. (2012). Isolation of a novel strain of Monoraphidium sp. and characterization of its potential application as biodiesel feedstock. Bioresource Technology, 121, Zuker, M. (2003). Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research, 31, Zwickl, D. J. (2006). GARLI: genetic algorithm for rapid likelihood inference. See 56

64 8. Prílohy Príloha 1: Čiastočné sekvencie 18S rdna bez intrónov a sekvencie regiónu ITS2 rdna študovaných kmeňov Monoraphidium A, Monoraphidium B a Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25. Monoraphidium A (18S rdna): CTGCTTATACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATAGTTTATTTGATGGTACTTTTACACGGATAACCGTAGTAA ATCTAGAGCTAATACGTGCGTAAATCCCGACTTCAGGAAGGGACGTATTTATTAGATAAAAGGCCGACCGGACTCTGTCCGA CCCGCGGTGAATCATGATAACTTCACGAATCGCATAGCCTCGTGCTGGCGATGTTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTC GATGGTAGGATAGAGGCCTACCATGGTGGTAACGGGTGACGGAGGATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAAC GGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGATACGGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATA CCGGGCATTCAATGTCTGGTAATTGGAATGAGTACAATCTAAATCCCTTAACGAGGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCA GCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTTAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCGGGTGGGTTC CAGCGGTCCGCCTATGGTGAGTACTGCTGTGGCCCTCCTTTCTGTCGGGGACGGGCTCCTGGGCTTCACTGTCCGGGACTCGG ATTCGACGATGATACTTTGAGTAAATTAGAGTGTTCAAAGCAAGCCTACGCTCTGAATACTTTAGCATGGAATATCGCGATAG GACTCTGGCCTATCTCGTTGGTCTGTAGGACCGGAGTAATGATTAAGAGGGACAGTCGGGGGCATTCGTATTTCATTGTCAGA GGTGAAATTCTTGGATTTATGAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTG GGGGCTCGAAGACGATTAGATACCGTCGTAGTCTCAACCATAAACGATGCCGACTAGGGATTGGAGGATGTTCTTTTGATGA CTTCTCCAGCACCTTATGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGAC GGAAGGGCACCACCCAGGCGTGGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGTCCAGACATAATGAG GATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTTTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGGTTGCCTTGTCAGGTTG ATTCCGGTAACGAACGAGACCTCAGCCTGCTAAATAGTCACTTTCGCTTTTTGCGGATGGCCGACTTCTTAGAGGGACAGATG CTACAAAAGCATCGGAAGTATGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGAC ACGTTCAACAAGCCTATCCTTGACCGAGAGGTCTGGGTAATCTTTGAAACCGTGTCGTGATGGGGATAGATTATTGCAATTAT TAGTCTTCAACGAGGAATGCCTAGTAGGCGCAAGTCATCAGCTTGCGCCGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGT CGCTCCTACCGATTGGGTGTGCTGGTGAAGTGTTCGGATTGGCGAAGCGGGTGGCAACACTTGCTTTTGCCGAGAAGT Monoraphidium A (ITS2 rdna): TTTTAACCCCTCATACCCCCACTCCTTGTCGAATGGTGCCAAGCCCACGTGGCTTGCGGGTGTGGAATTGGCTTCCCCAATCGG CCTTGCTGCTGCTTGGGTTGGCTGAAGTGCAGAGGCTTGAGCAGGGACCCGTTATGGGCATCAACTGGATAGGTACGCGGCC ATACCGGCTGTATACACGAAGTTGTTGCTTGTGGACCCTGCTGGAGGCCTGCAGGAAACGCGGCTTGCCGCGCCCTTAAATT Monoraphidium B (18S rdna): CTGCTTATACTGTGAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATAGTTTATTTGATGGTACTTTTACACGGATAACCGTAGTAAA TCTAGAGCTAATACGTGCGTAAATCCCGACTTCTGGAAGGGACGTATTTATTAGATAAAAGGCCGACCGGACTCTGTCCGACC CGCGGTGAATCATGATAACTTCACGAATCGCATAGCCTCGTGCTGGCGATGTTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGA TGGTAGGATAGAGGCCTACCATGGTGGTAACGGGTGACGGAGGATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGG CTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGATACGGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATACC GGGCATTCAATGTCTGGTAATTGGAATGAGTACAATCTAAATCCCTTAACGAGGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAG CAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTTAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCGGGTGGGTTCC AGCGGTCCGCCTATGGTGAGTACTGCTGTGGCCCTCCTTTCTGTCGGGGACGGGCTCCTGGGCTTCACTGTCCGGGACTCGGA TTCGACGATGATACTTTGAGTAAATTAGAGTGTTCAAAGCAAGCCTACGCTCTGAATACTTTAGCATGGAATATCGCGATAGG ACTCTGGCCTATCTCGTTGGTCTGTAGGACCGGAGTAATGATTAAGAGGGACAGTCGGGGGCATTCGTATTTCATTGTCAGAG GTGAAATTCTTGGATTTATGAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTGG GGGCTCGAAGACGATTAGATACCGTCGTAGTCTCAACCATAAACGATGCCGACTAGGGATTGGAGGATGTTCTTTTGATGACT TCTCCAGCACCTTATGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACG GAAGGGCACCACCAGGCGTGGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGTCCAGACATAATGAGGA TTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTTTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGGTTGCCTTGTCAGGTTGAT TCCGGTAACGAACGAGACCTCAGCCTGCTAAATAGTCACTTTCGCTTTTTGCGGATGGCCGACTTCTTAGAGGGACAGATGCT ACAAAAGCATCGGAAGTATGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACAC GTTCAACAAGCCTATCCTTGACCGAGAGGTCTGGGTAATCTTTGAAACCGTGTCGTGATGGGGATAGATTATTGCAATTATTA GTCTTCAACGAGGAATGCCTAGTAGGCGCAAGTCATCAGCTTGCGCCGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCG CTCCTACCGATTGGGTGTGCTGGTGAAGTGTTCGGATTGGCGAAGCGGGTGGCAACACTTGCTTTTGCCGAGAAGT Monoraphidium B (ITS2 rdna): TTTTAACCCCTCATACCCCCATTCCTTGTCGAATGGTGCCAAGCCCACGTGGCTTGCGGGTGTGGAATTGGCTTCCCCAATCGG CCTTGCTGCCGCTTGGGTTGGCTGAAGTGCAGAGGCTTGAGCAGGGACCCGTTATGGGCATCAACTGGATAGGTACGCGGCC ATACCGGCTGTATACACGAAGTTGTTGCTTGTGGACCCTGCTGGAGGCCTGCAGGAAACGCGGCTTGCCGCGCCCTTAAATT 57

65 Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 (18S rdna): CTGCTTATACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATAGTTTATTTGATGGTACCTCTACACGGATAACCGTAGTA ATTCTAGAGCTAATACGTGCGTAAATCCCGACTTCTGGAAGGGACGTATTTATTAGATAAAAGGCCGACCGAGCTTTGCTCGA CCCGCGGTGAATCATGATAACTTCACGAATCGCATGGCCTTGTGCCGGCGATGTTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTC GATGGTAGGATAGAGGCCTACCATGGTGGTAACGGGTGACGGAGGATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAAC GGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGATACGGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATG CCGGGCATTTAATGTCTGGCAATTGGAATGAGTACAATCTAAATCCCTTAACGAGGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCA GCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTTAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCGGGTGGGTTC CAGCGGTCCGCCTATGGTGAGTACTGCTGTGGCCCTCCTTTTTGCCGGGGACGGTCTCCTGGGCTTCACTGTCCGGGAATCGG AGTCGGCGATGATACTTTGAGTAAATTAGAGTGTTCAAAGCAAGCCTACGCTCTGAATACTTTAGCATGGAATATCGCGATAG GACTCTGGCCTATCTCGTTGGTCTGTAGGACCGGAGTAATGATTAAGAGGGACAGTCGGGGGCATTCGTATTTCATTGTCAGA GGTGAAATTCTTGGATTTATGAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTG GGGGCTCGAAGACGATTAGATACCGTCGTAGTCTCAACCATAAACGATGCCGACTAGGGATTGGAGGATGTTCTTTTGATGA CTTCTCCAGCACCTTATGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGAC GGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGTCCAGACATAGTGAGGA TTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTCTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGGTTGCCTTGTCAGGTTGAT TCCGGTAACGAACGAGACCTCAGCCTGCTAAATAGTCACGTTCGCTTTTTGCGGATGGCCGACTTCTTAGAGGGACTATTGGC GTTTAGTCAATGGAAGTATGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACGCA TTCAACAAGCCTATCCTTGACCGAGAGGTCCGGGTAATCTTTGAAACTGCGTCGTGATGGGGATAGATTATTGCAATTATTAG TCTTCAACGAGGAATGCCTAGTAAGCGCCAGTCATCAGCTGGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGC TCCTACCGATTGGGTGTGCTGGTGAAGTGTTCGGATTGGCGAAGCGGGTGGCAACACTTGCTTTTGCCGAGAAGTTCATAAAC CCTCCCACTAAGA Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 (ITS2 rdna): TTTACACCCTCACACCCCTATCATTTATGATGGTGCCAAACCCAAGTGGTTTGCGGGCGTGGATTTGGCTTCCCCAATCGGCCT TGCTGCCGATTGGGTTGGCTGAAGTATAGAGGCTTGAGCAAGGACCCGTTATGGGCATCAACTGGATAGGTAGTGTCGGCCA TCCGGTCGTCTACACGAAGTTGTTGCTTGTGGACCTTGCTGGGGGCCAGCAGGAAACACGCTTTGCGTGACCTAAACCT 58

66 Príloha 2: Grafické znázornenie sekundárnej štruktúry ITS2 kmeňa Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25. Červenou farbou sú vyznačené zmeny na helixoch sekundárnej štruktúry ITS2 u kmeňov Monoraphidium A a Monoraphidium B, čiernou farbou zmena na viac u Monoraphidium A. Obdĺžnikom je označené CBC na tretom helixe a oválom hcbc na prvom helixe. Štyri hlavné helixy sú označené rímskymi číslicami I IV. Šípkami je vyznačená pyrimidín-pyrimidín nezhoda. Model obsahuje 3 koniec 5.8S rrna a 5 koniec 28S rrna. 59

67 Príloha 3: Štatistické vyhodnotenie závislosti rýchlosti rastu študovaných kmeňov na teplote (Tabuľka A) a intenzite žiarenia (Tabuľka B) pomocou analýzy rozptylu (ANOVA) a Tukeyovou metódou mnohonásobného porovnania. Testovaná nulová hypotéza bola, že teplota a intenzita žiarenia neovplyvňuje rýchlosť rastu. Výsledky boli považované za signifikantné pre p < 0,05. T teplota ( C), I intenzita žiarenia (µmol m 2 s 1 ). Tabuľka A Monoraphidium A Monoraphidium B Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 T / I ANOVA Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes 30 vs 25 Yes Yes Yes Yes Yes No Yes Yes Yes No Yes Yes Yes Yes Yes 30 vs 20 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes 30 vs 15 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes 30 vs 10 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes 30 vs 6 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes 30 vs 1 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes 25 vs 20 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No No Yes No 25 vs 15 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No Yes Yes Yes 25 vs 10 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No No Yes No 25 vs 6 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No No Yes No 25 vs 1 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes 20 vs 15 Yes No Yes Yes No Yes No No Yes No Yes Yes Yes No Yes 20 vs 10 No No No Yes Yes No No No Yes No No No Yes No No 20 vs 6 Yes No Yes Yes Yes Yes No No No Yes No No Yes No No 20 vs 1 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes 15 vs 10 Yes No No No Yes No No No Yes No Yes Yes No No Yes 15 vs 6 Yes No No No Yes Yes No No Yes Yes No No No No Yes 15 vs 1 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No No Yes Yes Yes Yes Yes Yes 10 vs 6 Yes No No No Yes Yes Yes No No No Yes No No No No 10 vs 1 Yes Yes Yes Yes Yes Yes No No Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes 6 vs 1 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No Yes No Yes Yes Yes Yes Yes Tabuľka B Monoraphidium A Monoraphidium B Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 I / T ANOVA Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes 69 vs 42 No Yes No Yes Yes No No Yes Yes No Yes Yes No No No No Yes 69 vs 26 Yes Yes Yes Yes Yes No No No Yes Yes Yes Yes Yes Yes No Yes No 69 vs 16 Yes Yes Yes No Yes Yes No Yes No Yes No Yes Yes Yes No Yes Yes 69 vs 9 Yes Yes No Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No Yes Yes Yes Yes Yes Yes 42 vs 26 Yes No Yes No No No No Yes No Yes No Yes Yes Yes No No No 42 vs 16 Yes No Yes No No Yes No Yes Yes No Yes Yes No Yes No Yes Yes 42 vs 9 Yes Yes No Yes Yes Yes Yes Yes No Yes Yes Yes Yes No Yes Yes Yes 26 vs 16 Yes No No No No Yes No Yes No No No No No No No No Yes 26 vs 9 No Yes No Yes Yes Yes Yes Yes No No Yes No No No Yes Yes Yes 16 vs 9 No Yes Yes Yes Yes No Yes Yes No Yes Yes No No Yes No Yes Yes 60

68 Príloha 4: Vrstevnicové grafy zobrazujúce rýchlosť rastu (µ) študovaných kmeňov vzhľadom na teplotu (T) a intenzitu žiarenia (I) pri ich kultivácií. Dáta boli vyhladené metódou váženej vzdialenosti najmenších štvorcov. Monoraphidium A (A), Monoraphidium B (B) a Ankistrodesmus antarcticus CCAP 202/25 (C). A B C 61