ETAPA 1: Initierea implementarii proiectului. Crearea suportului tehnic si stiintific pentru atingerea obiectivelor proiectului.

Transcription

1 RAPORTARE STIINTIFICA RST - Raport stiintific si tehnic in extenso ETAPA 1: Initierea implementarii proiectului. Crearea suportului tehnic si stiintific pentru atingerea obiectivelor proiectului. Perioada de raportare: Participanti Coordonator (CO)- SCUB Partener P1-UPB Partener P2 - INCDFM Obiectivele fazei de executie: Act. 1.1: Documentarea membrilor echipei, in scopul de a defini performantele biofluidelor pe baza de maghemita. Act. 1.2: Documentarea privind metodele de caracterizare ale biofluidelor pe baza de maghemita. Act. 1.3: Documentarea privind principalele caracteristici ale biofluidelor pe baza de maghemita si identificarea tehnicilor de caracterizare aferente. Act. 1.4: Vizite de lucru si stagii de perfectionare in laboratoarele colaboratorilor straini pentru buna desfasurare a proiectului. Act. 1.4: Realizarea site-ului web al proiectului Act. 1.6: Raport de cercetare Act. 1.7: Sinteze preliminare ale nanoparticulelor magnetice. Teste histopatologice preliminare privind comportamentul nanoparticulelor magnetice in vivo. Rezumat: In cadrul acestei etape s-au realizat studii privind performantele biofluidelor pe baza de maghemita. Studii privind cele mai eficiente tehnici de caracterizare si metode de sinteze au fost, de asemenea, realizate. In faza preliminara, nanoparticulele de magehemita in solutie au fost obtinute prin metoda co-precipitarii. Atat nanoparticulele de maghemita obtinute in acest stadiu preparativ cat si biofluidul rezultat au fost caracterizate din punct de vedere morfologic si structural prin microscopie electronica de transmisie (MET). Studii complementare de difuzia dinamica a luminii (DLS) au fost, de asemenea, realizate. Mai mult, toxicitatea nanoparticulelor de oxid de fier injectate intraperitoneal, a fost testata prin investigatii histologice ale diferitelor tesuturi prelevate de la sobolanii masculi

2 Brown Norway. Comportamentul sobolanilor, cat si aspectul histopatologic al tesuturilor prelevate la 48 de ore dupa injectarea intraperitoneala nu au prezentat nici o modificare. La concentratiile testate, nanoparticulele nu au prezentat citotoxicitate asupra tesuturilor analizate. Descrierea Stiintifica si Tehnica I. Caracteristici ale biofluidelor pe baza de maghemita si identificarea tehnicilor de caracterizare Materialele grupate sub numele de "nanomateriale" sunt materialele la scara nanometrica a caror dimensiune este de asteptat sa fie mai mica de 100 nm. Aceste materiale la scara nanometrica au cunoscut o dezvoltare permanenta in ultimii ani iar interesul pentru acest tip de material devine tot mai mare [1-2]. Ca urmare, studii privind toxicitatea lor atat pentru oameni cat si pentru ecosistem sunt necesare pentru a clarifica gradul de toxicitate in cazul expunerii la acest nou tip de materiale. Se stie ca, de-a lungul timpului particulele mici ultrafine rezultate in urma incendiilor, eruptiilor vulcanice, gazelor de esapament ale vehiculelor au fost capabile de a produce daune umane [3-4]. Pe de alta parte, ar trebui sa se faca diferenta intre nanoparticulele rezultate in urma unor procese generate indirect si materialele la scara nanometrica sintetizate in laborator [5-6] cu scopul de a dezolta noi tehnologii in domeniile de varf cum ar fi medicina si farmacia. Aplicatiile nanomaterialelor magnetice (maghemita) au un spectru larg de utilizare in domeniul medical si farmaceutic. Nanoparticulele de maghemita in solutie ar putea fi utilizate ca biomarkeri antimicrobieni pentru cercetare si diagnostic, procese de separare biomagnetice, vectori de livrare de medicamente, medii de contrast pentru imagistica prin rezonanta magnetica [7-9]. Pe de alta parte, nanoparticulele de maghemita sub forma fluida ar putea fi utile pentru a imbunatatii medicamentele actuale, in obtinerea unor suprafete biocompatibile pentru implanturi si vaccinuri. Nanoparticulele magnetice ar putea fi folosite in realizarea de mijloace de diagnostic care sa conduca la diagnosticarea precoce a unor maladii. Se stie ca, in realizarea de echipamente de ultima generatie utilizate in interventii chirurgicale, in ingineria genetica, in constructia de dispozitive si sisteme ultraprecise de analiza si pozitionare, de

3 detectare biologica a agentilor patogeni sunt folosite cu succes particule la scara nanometica [10-11]. Dupa cum se poate intui, fluidele sunt solutii coloidale de nanoparticule feromagnetice sau ferimagnetice avand dimensiuni de ordinul zecilor de nanometri intr-un solvent sau apa. Aceste lichide devin magnetice atunci cand este aplicat un camp magnetic exterior dar isi mentin stabilitatea coloidala. O consecinta a acestei proprietati este aceea ca aceste solutii apoase sunt atrase de magneti sau electromagneti in acelasi fel in care este atrasa o bucata de fier. Aceste ferofluide au in componenta lor nanoparticule de magnetita (Fe3O4) sau magnemita (γ-fe2o3). Atat magnetita (Fe3O4) cat maghemita (γ-fe2o3) sunt oxizi magnetici de tip ferita (MFe2O4 unde M este un cation bivalent M = Ni II, CO II, Zn II, Ba II...). Magnetita (Fe3O4) si maghemita (γ-fe2o3) reprezinta cea mai mare parte a particulelor utilizate ca ferofluid. Pe de alta parte, particulele de tip metalic (un metal in stare de oxidare zero) cum ar fi nichel, cobalt, fier, etc. ar putea fi folosite ca fluide magnetice. Particulele de tip metal au avantajul de-a avea magnetizare mai mare dar si dezavantajul enorm ca se oxideaza rapid ceea ce determina reducerea drastica sau chiar pierderea magnetizarii. Aceste nanoparticule pot fi solubilizate in doua tipuri de lichide. Solventii organici (alifatic, diester carboxilix, ulei siliconic,...), spre exemplu, sunt utilizati atunci cand fluidele magnetice rezultate sunt utilizate in aplicatii comerciale intrucat au o mare stabilitate termica la temperaturi ridicate. Pentru aplicatiile medicale sunt utilizati solventii polari (apa, alcooli). Asupra ferofluidelor se pot efectua diferite tipuri de modificari chimice in functie de aplicatiile dorite [12]. Astfel, la suprafata nanoparticulelor de oxid de fier pot fi grefate diferite molecule sau polimeri pentru a imbunatatii stabilitatea coloidala. Moleculele sau polimerii grefati la suprafata le poate conferii nanoparticulelor magnetice proprietati biocompatibile, proprietati de adsorptie sau activitate biologica particlulara [13]. Mai mult, prin depunerea la suprafa a unui strat de siliciu sau a unui alt tip de polimer se formeaza particule tip core-shell care ar putea imbunatatii atat stabilitatea chimica cat si proprietatile magnetice ale nanoparticulelor de oxid de fier initiale [14]. Asadar, este posibil sa se incapsuleze nanoparticule intr-o matrice organica, anorganica sau hibrid, care poate fi un polimer organic, un biopolimer sau un gel de silice. Prin urmare, putem spune ca materialele nanocompozite magnetice pot fi obtinute sub diferite forme cum ar fi, bile, microsfere, filme sau monoliti [15]. In domeniul cercetarii medicale si biologice ferofluidele sunt folosite pentru a selecta grupurile biologice. Astfel, in detectarea tuberculozei ferofluidele se fixaza pe celulele

4 bolnave ceea ce permite detectarea acestora si izolarea lor prin centrifugare sau aplicarea unui camp magnetic [16]. In RMI ferofluidele sunt utilizate ca agent de contrast modificand timpul de relaxare [17]. O alta aplicare recenta consta in utilizarea ferofluidelor magnetice in oncologie prin hipertemie magnetica. In acest caz nanoparticulele magnetice in solutie sunt injectate in tesutul canceros dupa care tesutul este supus unui camp magnetic alternativ putand determina o crestere a temperaturii tumorii [18-19]. In cazurile de anevrism arterial, o cantitate mica de fluid magnetic este folosit pentru consolidarea peretilor arteriali slabiti prin fixarea nanoparticulelor magnetice pe acesti pereti ai arterei cu ajutorul unui camp magnetic. Recent oamenii de stiinta de la Universitatea Stanford s-au axat pe studierea posibilitatii de a folosi ferofluidele in crearea de inimi artificiale [20]. In cadrul acestui proiect se va urmari punerea in evidenta a utilitatii biofluidelor de maghemita la scara nanometrica pentru livrarea unor medicamente adaptate unui anumit tip de organ. Proiectul se incrie in dezvoltarea de noi tehnologii pentru tratamentul cancerului. Funtionalizarea ferofluidelor magnetice se va face in functie de organul ce urmeaza a fi supus acestei noi terapii [21]. Medicamentele vor fi usor directionate spre organul bolnav prin intermediul nanoparticulelor magnetice functionalizate. Speram ca rezultatul unei astfel de tehnici de terapie sa conduca la moartea celulelor tumorale printr-un mecanism provocat de nanoparticulele magnetice asupra carora s-a aplica o sursa de energie externa. Nanoparticulele de maghemita folosite in acest proiect sub forma de fluide magnetice vor fi sintetizate prin metoda coprecipitarii. Această metoda consta in amestecarea ionilor ferici si ferosi intr-un raport de 1: 2 molar in solutii puternic bazice, la temperatura camerei sau la temperatură ridicata. Dimensiunea si forma nanoparticulelor de oxid de fier depinde de tipul de sare folosita (cum ar fi cloruri, sulfati, nitrati, perclorati, etc.), raportul dintre ionii ferici si ferosi, temperatura de reactie, valoarea ph-ului, taria ionica, precum si alti parametri de reactie (de exemplu, viteza de agitare). Obtinerea nanoparticulelor de maghemita prin coprecipitare a fost raporatata recent [22]. Sinteza prin copecipitare, studii morfologice si structurale cat si sudii biologice au fost raporatate in literatura de specialitate [22-23]. Dupa cum se stie nanoparticulele de magnetita (Fe3O4) nu sunt foarte stabile in conditii ambiante si sunt usor de oxidat transformansdu-se in maghemita (γ-fe2o3). Pentru a evita oxidarea în aer, sinteza Fe3O4 trebuie să se facă in conditii anaerobe. Sinteza maghemitei se realizeaza prin oxidarea magnetiteti printr-un tratament la temperatura ambianta. Mghemita rezultata este stabila chimic atat in mediul alcalin cat si in cel acid. Ferofluidele utilizate in cadrul acestui proiect vor fi caracterizate prin analiza chimica si spectrometrie de absorptie atomica (ceea ce permite dozarea fierului si determinarea

5 concentratiei de fier din nanoparticule), prin difractie de raze X (permite determinarea naturii fazei cristaline ce constituie nanoparticulele dar si determinarea diametrului mediu al acestora), SQUID (permite studiul proprietatilor magnetice, determinarea diamentrului mediu cat si polidispersitatea nanoparticulelor), potential Zeta (natura suprafetei nanoparticulelor), difuzia dinamica a luminii (DLS) (determinarea diametrului dinamic al nanoparticulelor cat si polidispersitatea acestora) si microscopie electronica in transmisie MET) (accesul direct la o imagine a nanoparticulelor, determinarea formei nanoparticulei, structurii, diametrului mediu si a dispersiei). Microscopul electronic in transmisie a fost inventat si construit de catre Max Knoll si Ernst Ruska în Germania în 1932 [24].La acel moment (1932), fusese deja realizat un microscop care folosea undele luminoase pentru a observa imaginea obiectelor iar pentru comunitatea stiintifica era necesar un microscop cu o rezolutie mult mai mare pentru o buna desfasurare a cercatarilor. A fost nevoie de doar aproximativ patru ani inainte ca primul aparat TEM comercial sa apara pe piata in anul Puterea de rezolutie a unui instrument optic este data de capacitatea sa de a separa două obiecte care sunt foarte apropiate unul de altul. Rezolutia microscopului traditional depinde de lungimea de undă a tipului razei de lumina utilizate conform principiului clasic al lui Rayleigh [25-26]. = 0.61 / sin unde: δ este distanta dintre două obiecte λ este lungimea de undă a fasciculului de lumina μ este indicele de refractie al mediului (de obicei aer, apa sau ulei) β este jumătate din deschiderea unghiulara a lentilei Tinand cont de faptul ca indicele de refractie al anumitor medii si deschiderea unghiulara a lentile microscopului nu se schimba in timpul unui experiment, rezolutia maxima a unui microscop este determinata in principal de lungimea de unda in sensul ca rezolutia creste cu scaderea lungimii de unda a luminii. Astfel, dupa cum corect a aratat Ernst Abbe [27-29] în 1870, in conformitate cu relatia de mai sus, cea mai mare rezolutie teoretica posibila pe care o poate avea un microscop optic este de aproximativ 0,2 mm [30-31]. In cazul microscopului electronic in transmisie, fasciculul de electroni este accelerat intr-un mediu cu indice de refracție egal cu 1 (vid), permitand observarea imaginii obiectului. Deschiderea unghiulara este atat de mica incat valoarea lui sinβ poate fi aproximata ca fiind egala cu marimea unghiului β. Cu aceste două ipoteze valabile pentru TEM, in acord cu Willams si Carter [32] rezolutia poate fi aproximata cu:

6 = 0.61 / Lungimea de unda a unui fascicul de electroni este invers proportionala cu viteza cauzata de diferenta de potential aplicata. În 1925 Louis-Victor-Pierre-Raymond, duc De Broglie a aratat ca relatia: λ = 1.22/E 1/2 poate fi folosita pentru a calcula lungimea de unda a fasciculului de electroni accelerati intrun anumit camp electric. In relatia lui De Broglie, λ este lungimea de unda a luminii, iar E este intensitatea campului. Tanand cont de valoarea λ din relatia lui De Broglie se poate calcula rezolutia teoretica MET. Repezentarea schematica a microscopului electronic in transmisie (MET) este prezentata mai jos. Figura 1: Reprezentarea schematica a microscopului electronic in transmisie (Archives, Grande Encyclopédie Larouse, Éd , page 8957) Difuzia dinamica a luminii (DLS), cunoscuta si ca imprastierea dinamica a luminii (DLS) ori sub numele de spectroscopie prin corelare de fotoni (PCS) este una dintre tehnicile cele mai utilizate pentru determinarea dimensiunii nanoparticulelor in mediu lichid [33].

7 Figura 2: Reprezentarea schematica a difuziei dinamice a luminii (ipotetica) pentru doua probe: particule mai mari (sus) si particule mai mici (jos). Aceasta tehnica consta in propagarea unui fascicul de lumina intr-o solutie cu particule sferice in miscare browniana. Atunci cand lumina intra in contact cu particula in miscare se produce un Efect Doppler ceea ce conduce la modificarea lungimii de unda a luminii incidente. Modificarea lungimii de unde depinde de dimensiunea particulei. Astfel, masurand coeficientul de difuzie al particulei si folosind functia de auto-corelare este posibila calcularea dimensiunii particulei cat si descrierea miscarii acesteia in mediu lichid. Potențialul Zeta este un bun indicator al interacțiunilor dintre particule si, prin urmare, un bun indicator al stabilitatii coloizilor, cum ar fi emulsiile (conform teoriei DLVO dezvoltate de Derjaguin, Verwey, Overbeek și Landau în 1940). Figura 3: Potentialul zeta este diferenta dintre sarcina la marginea stratului Stern și cea mai mare parte a lichidului de suspensie (Wu Chen, Conform teoriei DLVO stabilitatea particulelor in suspensie depinde de un potential de interactiune total. Masurarea potentialului Zeta face posibila predictia comportamentului emulsiilor si suspensiilor (stabilitate, omogenitate, agregare...) și, astfel, rezolva unele probleme de formulare. Principala sursa de informatie privind structura cristalina a materialului este difractia de raze X. Metoda Debye Scherrer (Figura 4) este metoda cea mai utilizata in studiile de difractie de raze X (DRX). Pentru determinarea structurii materialului prin metoda Debye Scherrer se foloseste o cantitate mica de pulbere care este depusa intr-o port-proba. Port-proba

8 este situata in centrul camerei de difractie. Pe filmul fotografic care este fixat pe peretele lateral al camerei de difractie este inregistrata figura de interferenta. Intersectia conurilor de difractie cu filmul duce la aparitia unor cercuri concentrice corespunzătoare diferitelor distante interplanare. Figura 4: Reprezentarea schematica a metodei Debye Scherrer ( dublul unghiului Bragg (2 )). Biocampatibilitatea nanoparticulelor de oxid de fier a fost investigata cu ajutorul testelor histopatologice. Pentru analiza toxicitatii oxidului de fier, in vivo, sobolanii (n = 4 per grup) au fost tratati cu ser fiziologic si oxid de fier prin injectare intraperitoneala. Pentru examenele histopatologice, organe selectate (ficat, rinichi, plaman și splina) au fost fixate in formol 10%. Tesuturile au fost puse în blocuri de parafina si colorate cu hematoxilina și eozina. Modificarile morfologice au fost observate prin examinare la microscop [34]. Sobolanii masculi Brown Norway (cu o greutate ~ 300 ± 10 g) au fost achizitionati de la Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie și Imunologie "Cantacuzino", Bucuresti. Sobolanii au fost tinuti într-un mediu controlat de temperatura (22 ± 2 C), lumina (12 h lumina/intuneric) si umiditate (60 ± 10%). Animalele au fost mentinute in conditii specifice fara agenti patogeni, in conformitate cu NIH Ghidul pentru ingrijirea si utilizarea animalelor de laborator. II. Rezultate preliminare Nanoparticulele de maghemita au fost obtinute prin coprecipitare [35-38], prin oxidarea magnetitei. Magnetita coloidala se formeaza direct in mediu alcalin prin coprecipitarea ionilor Fe 2+ si Fe 3+. Clorura feroasa (FeCl2 4H2O), 2M HCl si clorura ferica (FeCl3 6H2O), s-au amestecat la C (Fe 2 + /Fe 3+ =½). Amestecul a fost precipitat in 200 ml de solutie de NaOH (2 mol L -1 si 2 mol L -1 ) sub agitare puternica timp de aproximativ 30 min. Precipitatul de magnetita a fost transformat in γ-fe2o3 prin tratament repetat cu solutii de

9 HNO3 (2 mol L -1 ) si FeNO3 (0,3 mol L -1 ) [39]. Precipitatul acid se izoleaza prin decantare pe un magnet. Particulele sunt separate prin centrifugare (6000 rpm), apoi sunt spalate in acetona si dispersate in apa deionizata la ph=2,5. Concentratia finala de ioni a fost 0,38 mol L -1. Intrucat rezultatele privind caracterizarea fizico-chimica si biologica a materialelor fac obiectul unui articol ce urmeaza a fi trimis spre publicare, aceste rezultate nu pot fi facute publice.aceste rezulate se gasesc pe platforma UEFISCDI. III.Concluzii In cadrul acestei prime etape de cercetare a proiectului au fost realizate studii documentare in scopul definirii performantele biofluidelor pe baza de maghemita. O ampla documentare privind cele mai eficiente metode de caracterizare ale biofluidelor pe baza de maghemita a fost, de asemenea, realizata. Sinteza preliminara a nanoparticulelor magnetice a fost realizata prin coprecipitare. Mai mult, s-a reusit a se realiza fluide magnetice pe baza de maghemita cu o buna distributie de dimensiune (dupa cum se poate din analiza DLS). Studiile structurale prin difractie de raze X au pus in evidenta formare maghemitei la scara nanometrica bine cristalizata. Teste histopatologice preliminare privind comportamentul nanoparticulelor magnetice in vivo au aratat ca tesuturile organelor analizate (ficat, rinichi, plăman si splina) nu au prezentat modificari in raport cu etalonul. Rezultatele cercetarilor preliminare prezentate demonstreaza ca nanoparticule de γ-fe2o3 vor putea fi folosite in studiile ce fac obiectul proiectului nostru. Un alt obiectiv atins a fost acela de a realiza si actualiza site-ul web al proiectului: Pentru o caracterizare complexa a materialelor sintetizate in cadrul acestei etape, s-au realizat studii comlementare preliminare de difuzia dinamica a luminii (DLS) in cadul stagiului de cercetare realizat in laboratoarele colaboratorilor europeni. Rezultatele obtinute in cadrul stagiului de lucru vor fi valorificate prin publicarea unui articol intr-un jurnal cotat ISI impreuna cu colaboratorii straini. Gradul de realizare al obiectivelor fazei 2014 Se apreciaza ca au fost indeplinite in totalitate obiectivele fazei (Etapa 1) din 2014 Referinte

10 [1]. S. Laurent, D. Forge, M.P. Roch, C. Robic, L Vander Elst, R.N. Muller, Magnetic iron oxide nanoparticles:synthesis, stabilization, vectorization, physicochemical characterizations and biological applications, Chemical Reviews, 2008, 108(6): [2]. S. Mornet, S. Vasseur, F. Grasset, E. Duguet, Magnetic nanoparticle design for medical diagnosis and therapy, Journal of Materials Chemistry, 2004, 14(14): [3]. Y. Baratli, A. L. Charles, V. Wolff, L.B. Tahar, L. Smiri, J. Bouitbir, J. Zoll, F. Piquard, O. Tebourbi, M. Sakly, H. Abdelelek, B. Geny, Impact of iron oxide nanoparticles on brain, heart, lung, liver and kidneys mitochondrial respiratory chain complexes activities and coupling, Toxicology in Vitro, 2013, 27(8): [4]. A. J. Ferreira, J. Cemlyn-Jones, C. Robalo Cordeiro, Nanoparticles, nanotechnology and pulmonary nanotoxicology, Revista Portuguesa de Pneumologia, 2012, 19(1): [5]. R. Massart, J. Roger, V. Cabuil, New trends in chemistry of magnetic colloids: polar and non polar magnetic fluids, emulsions, capsules and vesicles, Brazilian Journal of Physics, 1995, 25(2): [6]. D. Predoi, C. Valsangiacom, Thermal studies of magnetic spinel iron oxide in solution, Journal of Optoelectronics and Advanced Materials, 2007, 9(6): [7]. S. Laurent, S. Dutz,U.O.H afeli, M.Mahmoudi, Magnetic fluid hyperthermia: focus on superparamagnetic iron oxidenanoparticles, Advances in Colloid and Interface Science, 2011, 166(1-2):8 23. [8]. C. H. Cunningham, T. Arai, P. C. Yang, M. V. McConnell, J. M. Pauly, S.M. Conolly, Positive contrast magnetic resonanceimaging of cells labeled withmagnetic nanoparticles, Magnetic Resonance in Medicine, 2005, 53(5): [9]. S.A. Anderson, R.K. Rader, W.F. Westlin, C. Null, D. Jackson, G.M. Lanza, S.A. Wickline, J.J. Kotyk, Magnetic resonance contrast enhancement of neovasculature withalpha(v)beta(3)-targeted nanoparticles, Magnetic Resonance in Medicine, 2000, 44(3): [10]. M. Mahmoudi, S. Sant, B.Wang, S. Laurent, T. Sen, Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs): development, surface modification and applications in chemotherapy, Advanced Drug Delivery Reviews, 2011, 63(1-2): [11]. M. Brähler, R. Georgieva, N. Buske, A. Müller, S. Müller, J. Pinkernelle, U. Teichgräber, A. Voigt, H. Bäumler, Magnetite-loaded carrier erythrocytes as contrast agents for magnetic resonance imaging, Nano Letters, 2006, 6(11 ): [12]. D. Zins, V. Cabuil, R. Massart, New aqueous magnetic fluids, Journal of Molecular Liquids, 1999, 83(1 3):

11 [13]. M.F. Casula, P. Floris, C. Innocenti, A. Lascialfari, M. Marinone, M. Corti, R. A. Sperling, W. J. Parak, C. Sangregorio, Magnetic resonance imaging contrast agents based on iron oxide superparamagnetic ferrofluids, Chemistry of Materials, 2010, 22(5): [14]. D. Predoi, A study on iron oxide nanoparticles coated with dextrin obtained by coprecipitation, Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures, 2007, 2(1): [15]. S. Mornet, F. Grasset, J. Portier, E. Duguet, Maghemite@ silica nanoparticles for biological applications, European Cells and Materials, 2002, 3S2:110. [16]. M. Brähler, R. Georgieva, N. Buske, A. Müller, S. Müller, J. Pinkernelle, U. Teichgräber, A. Voigt, H. Bäumler, Magnetite-loaded carrier erythrocytes as contrast agents for magnetic resonance imaging, Nano Letters,.2006, 6(11): [17]. J.-C. Bacri, R. Perzynski, D. Salin, V. Cabuil et R. Massart, Ionic ferrofluids: A crossing of chemistry and physics, Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 1990, 85: [18]. C. Bartolozzi, R. Lencioni, F. Donati, D. Cioni, Abdominal MR: liver and pancreas, European Radiology, 1999, 9(8): [19].J. Menga, J. Fana, G. Galianab, R.T. Brancac, P.L. Clasend, S. Mad, J. Zhoua, C. Leuschnere,, C.S.S.R. Kumarf, J. Hormesf, T. Otitig, A.C. Beyeh, M.P. Harmerd, C.J. Kielyd, W. Warrenc,, M.P. Haatajaa, W.O. Soboyejoa, LHRH-functionalized superparamagneticiron oxide nanoparticles for breast cancer targetingand contrast enhancement in MRI, Materials Science and Engineering C, 2009, 29(4): [20]. R. FREE, Popular Science, février 1972, 200(2): [21]. M. Mahmoudi, H. Hosseinkhani, M. Hosseinkhani, S Boutry, A. Simchi, W.S. Journeay, K. Subramani, S. Laurent, Magnetic resonance imaging tracking of stemcells in vivo using iron oxide nanoparticles as a tool for the advancement of clinical regenerative medicine, Chemical Reviews, 2011, 111(2): [22]. A.M. Prodan, S. L. Iconaru, C.S. Ciobanu, M. C. Chifiriuc, M. Stoicea, D. Predoi, Iron Oxide Magnetic Nanoparticles: Characterization and Toxicity Evaluation by In Vitro and In Vivo Assays, Journal of Nanomaterials, 2013, Article ID [23]. C.L. Popa, E. Andronescu, M. Stoicea, P. Le Coustumer, S. Galaup, M. Beuran, F. M. Iordache, A. Telcian, C. Bleotu, A. M. Prodan, Fabrication, Characterization, Toxicity and Biocompatibility Evaluation of Iron Oxide Nanoparticles, Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures, 2014, 9(1): [24]. M. Knoll, E. Ruska, Electron Microscope, Zeitschrift für Physik, 1932, 78:

12 [25]. S. Inoue, K.R. Spring, Video Microscopy the fundamentals, New york, Plenium press, [26]. H.G. Kapitza, Microscopy From The Very Beginning, Oberkochen, Germany, Carl Zeiss, [27]. A. Ernst, "Über einen neuen Beleuchtungsapparat am Mikroskop", Archiv für mikroskopische Anatomie, 1873, 9: [28]. A. Ernst, "Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung", Archiv für Mikroskopische Anatomie, 1873, 9(1): [29]. A. Ernst, "A Contribution to the Theory of the Microscope and the Nature of Microscopic Vision". Proceedings of the Bristol Naturalists' Society 1: , [30]. J.A. O'Keefe, Resolving Power of Visible Light, Journal of the Optical Society of America, 1956, 46: [31]. M. Born, E. Wolf, Principles of optics, Oxford UK, Pergamon, [32]. D.B. Williams, C.B. Carter, Transmission electron microscopy- a text book for material science, New York, USA. Plenum Press, [33]. B.J. Berne, R. Pecora, Dynamic Light Scattering, New York, USA, Dover Publications, [34]. B. Su, S. L.Xiang, J. Su, H.L. Tang, Q. J. Liao, Y. J. Zhou, S. Qi, Diallyl Disulfide Increases Histone Acetylation and P21 WAF1 Expression in Human Gastric Cancer Cells In vivo and In vitro, Biochemical Pharmacology, 2012, 1(7):1-10. [35]. T.W. Swaddle, P. Oltmann, Kinetics of the magnetite maghemite hematite transformation, with special reference to hydrothermal systems, Canadian Journal of Chemistry, 1980, 58(17): [36]. M. Van Meerssche, J. Feneau-Dupont, "Introduction à la cristallographie et à la chimie structurale", 3 èmè Ed., Ed. Peetrs, Paris, [37]. E. Tronc, P. Prene, J. P. Jolivet, F. d'orazio, F. Lucari, D. Fiorani, G. Godinho, R. Cherkaoui, M. Nogues, J. L. Dormann, Magnetic behaviour of γ-fe2o3 nanoparticles by mössbauer spectroscopy and magnetic measurements, Hyperfine Interactions, 1995, 95: [38]. A. Rouset, G. Boissier, J. P. Caffin, F. Chassgneux, C. R. Acad. Sci. Paris, 299 II [39]. M. Macias, J. Morales, J. Tirado, C. Valera, Effect of crystallinity on the thermal evolution of γ-fe2o3, Thermochimica Acta, 1988, 133: [40]. B. Wang, W.Feng, M. Wang, T. Wang, Y. Gu, M. Zhu, H. Ouyang, J. Shi, F. Zhang, Y. Zhao, Z. Chai, H. Wang, J. Wang, Acute toxicological impact of nano- and submicro-scaled

13 zinc oxide powder on healthy adult mice, Journal of Nanoparticle Research, 2008, 10: [41]. W. Wang, S. Zhang, P. Chinwangso, R.C. Advincula, T.R. Lee, Electric potential stability and ionic permeability of SAMs on gold derived from bidentate and tridentate chelating alkanethiols, The Journal of Physical Chemistry C, 2009, 113: