UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

Transcription

1 UIVERZA V LJUBLJAI BITEIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ ŽIVILSKA TELGIJA BISITEZA JAČEVALCEV ARM (Romanca MAČEK, Milica MADŽAREVIČ, Blaž MALVR, Primož MELE) (študentje tretjega letnika študija Živilske tehnologije) asist. Maja Paš, dipl. inž. in prof. dr. Peter Raspor (mentorja) Ljubljana, 2000

2 Biosinteza ojačevalcev arom, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, Seminarska naloga pri predmetu Biotehnologija PVZETEK Japonska je nadvse dejavna v industrijski proizvodnji ribo-nukleotidov in kislin, ki se nahajajo v jedru, kot ojačevalci arom v živilski industriji. Prednost imajo raziskave 5'- nukleotidov. To so: GMP (gvanozin 5'-monofosfat), IMP (inozin 5'-monofosfat) in XMP (xsantozin 5'-monofosfat). 5'-nukleotide največ dodajamo mesu, kot aromo za hrano z obojestranskim delovanjem na njih same ali po sekundarni poti z natrijevim glutamatom. Mutanti Bacillus in Brevibacterium ali različnih kvasovk, (npr. Candida utilis, Candida lipolytica in Saccharomyces rouxii), so najbolj uporabni v fermentativnih produktih 5'-IMP in 5'-GMP. V prihodnosti bo znova uporabljena tehnologija DA za izoblikovanje drugih nukleotidov in več primernih proizvajalcev. SUMMARY Japan is very actively engaged in the industrial production of ribonucleotides and nucleic acids as flavour enchasers for foodstuff industries. Research is preferentially concentrated on the 5'-nucleotid GMP (Guanosin 5'-monophosphate), IMP (Inosine 5'-monophosphate) and XMP (Xanthosine 5'-monophosphate). The 5'-nucleotides mainly add a meat-like aroma to food by either working on their own or in a synergistic way with natrium glutamate. Mutants of Bacillus and Brevibacterium, or of various yeasts (e.g., Candida utilis Candida lipolytica, and Saccharomyces rouxii) are preferably applied in the fermentative production of 5'-IMP and 5'-GMP. In the future recombinant DA techniques will be used to create other nucleotides and more suitable producers.

3 Biosinteza ojačevalcev arom, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, KAZAL 1. UVD Kvasna biomasa '-nukleotidi ZGDVIA Glutaminska kislina Umami MIKRBILŠKE SVE snove bioprocesa za glutaminsko kislino Kontinuirna produkcija 5'-nukleotidov iz RA kvasovk, s hidrolizo imobiliziranih 5 -fosfodiesteraz in 5 -adenilat deaminaz BIKEMIJSKE SVE Biosinteza glutaminske kisline Faktorji, ki vplivajo na anaeroben bioproces Učinkovanje na prepustnost membrane za glutaminsko kislin ačin proizvodnje Regulacija encimov vpletenih v sintezo glutamata BIIŽEIRSKE SVE Produkcija 5 - nukleotidov iz kvasovk z nukleazo P Proizvodnja ojačevalcev okusa iz kvasne biomase Produkcija 5'-nukleotidov UPRABA BIPRIZVDV V PRIZVDJI RAE Uporaba genetike in genetsko-inženirske metode za proizvodnjo hrane in dodatkov hrani aravni ojačevalci arom IMPLIKACIJE DRUGI TELGIJ I IMPLIKACIJE A DRUGE TELGIJE REFERECE... 23

4 Biosinteza ojačevalcev arom, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, UVD Zaradi porasta zahtev potrošnikov po naravno proizvedeni hrani in dodatkov hrani je prehrambena industrija pokazala večji interes za možne dosežke biotehnologije. V Biotehnološki enoti (LFRA), sta bili encimologija in anaeroben bioproces identificirani kot primarni tehnologiji za dosego želenih sprememb in oblik v prehrambeni industriji. Ti dve tehnologiji se uporabljata za delovanje molekularnih struktur: polisaharidov, lipidov in proteinov. Med dodatke za izboljšanje okusa uvrščamo snovi, ki dajejo določenemu živilu sladek, kisel, alkalni ali trpek okus. Te snovi torej ojačijo določen okus. Za povečanje sladkega okusa uporabljamo sladkorje različnih vrst, ki jih običajno ne uvrščamo med dodatke. Kot snovi s kislim okusom, uporabljamo citronsko, vinsko, ocetno, mlečno in fosforjevo(v) kislino. Pri tem naravne kisline ne obravnavamo kot dodatke. Snovi z alkalnim okusom se uporabljajo redkeje, z izjemo natrijevega hidroksida, ki ga uporabljamo za pripravo prest. ajpomembnejši dodatek s slanim okusom je kuhinjska sol. Ta je za mnoga področja živilske industrije nepogrešljiva. Zaradi tisočletne uporabe soli jo danes ne prištevamo k dodatkom. Zelo veliko se uporablja tudi glutaminska kislina. Je najbolj razširjena in najbolj pomembna aminokislina v proteinih in peptidih. Vsa proteinsko bogata hrana npr. meso, ribe, sir, mleko, nekatera zelenjava vsebuje glutamat. Glutaminska kislina se v telesu lahko sama sintetizira in je nujno potrebna pri metabolizmu in delovanju možganov. V začetku stoletja so znanstveniki izolirali glutamat iz rastlin, ki je glavna komponenta, odgovorna za izredno povečanje okusa. V prvi polovici tega stoletja je bil a-glutamat oz. natrijeva sol glutaminske kisline, ekstrahiran iz morske trave in drugih rastlinskih virov. Danes se glutamat v večini držav pridobiva z anaerobnim bioprocesom iz melase, to je lahko iz sladkorja škroba, itd. a-glutamat ima okus po mesu in v kombinaciji z nukleotidi deluje kot ojačevalec okusa. Trenutna svetovna poraba a-glutamata je 800,000 ton. a ta način je to aminokislina z največjo produkcijsko kapaciteto. Kot snov s trpkim okusom je najbolj uporaben kinin in to za določene napitke. Poleg omenjenih snovi, ki izboljšujejo okus živilom uporabljamo tudi 5'-nukleotide, nekatere dodatke s področja rastlin, npr. začimbe, esence in ostale snovi. Aditivi ali dodatki so snovi, katerih uporaba vpliva direktno ali indirektno na sestavo ali karakteristike živila ( Encyclopedia of food science and technology). Sami imajo zelo šibak okus ali pa so celo brez okusa. 1.1 Kvasna biomasa V zadnjem času se vse več pozornosti usmerja k uporabnosti kvasne biomase in njenih derivatov v "druge namene". Proteini, vitamini, encimi, glukan in sposobnost tvorbe specifičnih arom in barve dajejo kvasni biomasi novo vrednost in uporabnost v agroživilski in farmacevtski industriji. Uporaba kvasnih proteinov in vitaminov je še vedno

5 Biosinteza ojačevalcev arom, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, zanimiva tam, kjer so potrebni naravni nadomestki in izboljševalci prehrambenega pomena živila za humano prehrano in krmo za živali. Glede na vsebnost RA in ekonomske zakonitosti je kvasovka optimalni mikroorganizem za proizvodnjo 5'-nukleotidov. snovne gradbene enote RA so nukleotidi, zato s hidrolizo RA lahko dosežemo proizvod bogat s 5'-nukleotidi. Postopek proizvodnje vključuje ekstrakcijo intracelularne RA iz kvasne biomase s segrevanjem suspenzije celic na C za 1-3 ure. Encim 5'-fosfodiesteraza hidrolizira RA na 5'-nukleotide. Za proizvodnjo kvasnega ekstrakta, ki je vir DA, se uporabljajo trije osnovni postopki proizvodnje (agodawitana, 1992): Avtoliza Avtoliza je proces utekočinjanja celičnih komponent z aktivacijo intracelularnih encimov (proteaz, hidrolaz in nukleaz) prisotnih v celici. Poteka v kontroliranih pogojih p, temperature in časa, kjer se lahko dodajajo tudi določeni encimi, ki pospešijo razgradnjo celičnih sestavin. Plazmoliza: Proizvodnja kvasnega ekstrakta po tem postopku se je uveljavila predvsem v Evropi in manj v Združenih državah Amerike. Postopek plazmolize izkorišča efekt soli, ki pri visokih koncentracijah prehajajo v celico, kar povzroči izgubo vode v celici. Posledica je ločevanje citoplazme od celične stene. idroliza: ajbolj učinkovita metoda utekočinjanja kvasne celice je hidroliza pri določeni temperaturi in tlaku. Ta metoda je do sedaj od vseh opisanih najmanj uporabna v komercialne namene. idroliza kvasne biomase s klorovodikovo kislino poteka pri 100 C dokler ne dosežemo zaželene koncentracije amoniakalnega dušika. Pomanjkljivosti tega postopka so: oprema za hidrolizo in nevtralizacijo, ki mora biti odporna na kisline in baze, visoka vsebnost soli in ogljikovih hidratov, slabe karakteristike arome proizvoda in razgradnja določenih aminokislin ter vitaminov med postopkom pridobivanja. Uporabnost kvasne biomase lahko razdelimo na osnovi njene aktivnosti: - Aktivna kvasna biomasa je tista, ki se uporablja za anaeroben bioproces, je izvor hranilnih in aromatičnih komponent v istem procesu in ali v aerobnih bioprocesih za proizvodnjo mikrobnih proteinov. - eaktivna kvasna biomasa je nefermentabilna in imenovana tudi "neaktivna-suha kvasna biomasa". Uporablja se kot hranilni dodatek in izvor oz. ojačevalec arom, barve in encimov v proizvodnji hrane. eaktivna kvasna biomasa se primarno uporablja v prehrambene namene ali kot ojačevalec arome, barvila in zgoščevalec. Lahko je vir encimov in vitaminov, ki jih dodajamo živilom. Aerobno proizvedena kvasna biomasa, ki je rasla na različnih substratih (melasa, škrob, sulfitna lužina, sirotka) je namenjena živilski industriji za proizvodnjo hrane in

6 Biosinteza ojačevalcev arom, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, krme. Proizvodi te skupine so označeni z več termini, kot so: suhi kvas, suhi neaktivni kvas, suhi razgrenčeni pivski kvas in enocelični proteini. Dva najpogosteje uporabljena seva za proizvodnjo enoceličnih proteinov sta iz družine Saccharomycetaceae (Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces marxianus), iz družine Cryptococcaceae pa asporogeni sev Candida utilis. Vsi trije sevi izkoriščajo za rast cenene ogljikohidratne substrate odpadnih vod različnih industrij. Imajo visoko hitrost rasti in izkoristke, ki znižujejo ceno proizvodnji mikrobnih proteinov. Saccharomyces cerevisiae proizvodnja neaktivnega pekovskega kvasa s Saccharomyces cerevisiae na melasi sladkorne repe ali trsa je poznana iz druge svetovne vojne, ko so ga v emčiji uporabljali za hrano in krmo. Kvas vsebuje vitamine B-skupine (tiamin, inositol, piridoksin in pantotenska kislina), ki se nahajajo v melasi. eaktivni pekovski kvas je med prvimi naravnimi aditivi, ki se lahko dodajajo za optimizacijo pekarskih izdelkov, vendar dodana količina aditivov ne sme presegati 2% (w/w) uporabljene moke. Kluyveromyces fragilis je edina dovoljena kvasovka za konverzijo sirotke v kvasne proteine v ZDA. Aroma, ki jo razvije kvasna biomasa v izdelkih v katere se dodaja, je komplementarna aromi mesa za juhe. Proizvod v splošnem vsebuje več kot 50 % proteinov in prispeva k boljšemu okusu hrane. Candida utilis (Torula Yeast) je poznana tudi pod imenom, ki ga je imela ta kvasovka predhodno Torulopsis utilis in je bila uspešno vključena v odstranjevanje onesnaženja odpadnih vod papirne industrije. V osemdesetih je ta kvasovka dobila tudi oznako GRAS-generaly recognised as safe, kar jo uvršča med varne vire naravnih proteinov. V živilstvu se "Torula" kvasna biomasa uporablja kot nosilec arome in v nekaterih primerih tudi kot povezovalec v hrani. V farmacevtski industriji se uporablja kot rastni faktor v biokemijsko sestavljenih kultivacijskih medijih '-nukleotidi Študije so pokazale, da tudi nekateri purinovi nukleozid-5'-monofosfati izboljšajo aromo. ajbolj učinkovit med njimi je gvanozin monofosfat ( 5'-GMP), kateremu sledi inozin monofosfat (5'-IMP) in ksantin monofosfat (5'-XMP). Snovi, ki nimajo nobenega učinka, so: 5'-AMP, 2' in 3' izomere, 5' deoksiribonukleotidi, nukleozidi in pirimidinovi nukleotidi, vendar so pomembni za farmacevtsko industrijo in industrijo kozmetike. V Evropi in Združenih Državah Amerike so priznani kot ojačevalci arom in okusa, na Japonskem pa kot ena od komponent umami okusa. 5'-AMP pa je pomemben tudi, ker lahko iz njega z deaminacijo dobimo 5'-IMP(Crueger, 1989 in agodavithana, 1991).

7 Biosinteza ojačevalcev arom, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, Ugotovljeno je bilo sinergistično delovanje med natrijevim glutamatom in natrijevimi solmi 5'-GMP in 5'-IMP ( Crueger, 1989). Tako je možno z majhnim dodatkom nukleotidov močno znižati količino dodanega natrijevega glutamata. GMP-a 2 in IMP- a 2, kot tudi mešanice natrijevih in kalcijevih soli obeh nukleotidov, so dovoljeni aditivi v hrani in se pogosto uporabljajo v kombinaciji z natrijevim glutamatom, predvsem v proizvodnji pripravljene hrane ( Crueger, 1989 in Macrae, 1993). kus 5 - nukleotidov je drugačen kot okus mononatrijevega L-glutamata, vendar se v okusu lepo dopolnjujejo. Kakorkoli že, v splošnem imamo oba (nukleotide in glutamat) za umami okus, ker se oba razlikujeta od štirih osnovnih okusov: sladko, kislo, slano in grenko. d leta 1961 se na Japonskem industrijsko sintetizirajo 5 - nukleotidi, (IMP in GMP). Danes se 5 - nukleotidi sintetizirajo na štiri neodvisne načine: 1) encimska razgradnja RA 2) kombinacija fermentativne produkcije inozina in gvanozina s kemično fosforilizacijo le teh 3) direktna fermentativna produkcija IMP 4) direktna fermentativna produkcija XMP (ksantozin monofosfat) in njegovih premetank Kot pogosti ojačevalci arom in okusov se pogosto uporabljajo tudi hidrolizirani rastlinski proteini (VP hydrolized vegetable proteins). Čeprav so včasih prevladovali v industriji ojačevalcev arom skupaj z mononatrijevim glutamatom, se je industrija razvijala do te mere, da je začela načrtovati zmanjšanje uporabe VP. Imamo dve obliki VP-jev: - encimsko modificirani (kvalitetnejši in dražji) - hidrolizirani s kislino (cenejši in izven tržne uporabe) idrolizirani rastlinski proteini (VP) so pripravljeni s kislinsko hidrolizo iz soje, pšenice in ostalih rastlin. Koncentracije kvasnega ekstrakta v živilih kot nosilec ali ojačevalec arome so v območju med 0,1-0,5% (w/w). Področje uporabe kvasnega ekstrakta so izdelki: klobase, juhe, mesne omake, hrana za male živali in dodatki pri zamesu testa. Danes so na trgu novejši ojačevalci. Poleg 5 - nukleotidov tudi sojina in tamari omaka, ki sta obe mikrobno hidrolizirana VP-ja. 2. ZGDVIA Uporaba ojačevalcev se je začela na rientu in se kasneje razširila po vsem svetu. V začetku 17. stoletja so Japonci začeli uporabljati različne snovi, s katerimi so jedem ojačali arome in okus. V ta namen so dodajali gobe, posušene ribe, alge idr. Konec 19. stoletja so študije potrdile visoko vsebnost proteinov v kvasni biomasi, ki zadovoljuje tako humane kot animalne prehrambene zahteve. Raziskave v zadnjih letih težijo k pripravi kvasnih derivatov, ki imajo poleg že navedenih lastnosti tudi terapevtsko vrednost. Aerobno namnožena kvasna biomasa se uporablja za pridobivanje kvasnega ekstrakta, encimov, glukana, proteinov in ostalih biokemijskih komponent.

8 Biosinteza ojačevalcev arom, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, Za zahodni svet so nukleotidi v prehrambene namene postali zanimivi takrat, ko se je začel po letu 1968 pojavljati "Sindrom kitajskih restavracij" ( Sano, 1992). Pri nekaterih ljudeh, ki so jedli v kitajskih restavracijah, so se pojavili naslednji simptomi: ekcemi, otrplost, občutek utesnjenosti v zgornjem delu telesa, ter slabo počutje ( Sano, 1992 in Macrae, 1993). Za povzročitelja teh težav je bil osumljen natrijev glutamat, ki se v vseh orientalskih kuhinjah dodaja jedem v velikih količinah (Macrae, 1993 in Sano, 1992). Posebno potrošniki v Združenih državah Amerike so pričeli pritiskati na proizvajalce industrijsko pripravljene in predpripravljene hrane z zahtevo po zamenjavi natrijevega glutamata z drugimi dodatki brez stranskih učinkov. Kot zelo dobri nadomestki so se uveljavili nukleotidi in nukleozidi mikrobnega izvora. 2.1 Glutaminska kislina a začetku 50 let 20. stoletja je proizvodnja mononatrijevega L -glutamata temeljila na kislinski hidrolizi proteinov. Ta kemični postopek je bil zelo drag, zaradi potrebne izolacije glutamata od ostalih aminokislin v hidrolizatu. Pomembno odkritje je bila kemična sinteza mononatrijevega L-glutamata (MSG). Vendar je tudi ta proces predstavljal velik strošek, zaradi proizvodnje mešanice D- in L- glutamata, ki sta morala biti raztopljena, da so lahko izločili D-izomero. Leta 1957 je bila predstavljena revolucionarna sprememba, ko je znanstvenik Kyowa akko Co. odkril bakterijo, ki izloča velike količine L-glutamata v gojišče. Kmalu za tem so podobno bakterijo izolirali tudi druge družbe in so jo uporabljali v novi industrijski tehnologiji: aminokislinski anaeroben bioproces, proizvodnji aminokislin z mikroorganizmi. Razen etanola in nekaterih drugih organskih topil ter nekaterih vitaminov je glutamat prva organska komponenta proizvedena na industrijski način s tehniko mikrobnega bioprocesa(anaerobnega). Poraba glutamata je v velikem porastu; iz ton MSG v letu 1970 je proizvodnja do leta 1980 narasla do približno ton. Glutamat ima mesni priokus in prispeva k večjemu izražanju že prisotnih arom živila; ta učinek je znatnejši pri L-enantiomeri kot pri D-enantiomeri. Le tega pripisujejo stimulativnemu delovanju na okušalne receptorje in se sinergistično poveča ob dodatku 5-inozinata ali 5-gvanilata. Tako ima mešanica iz 88 % MSG in 12 % inozinata 6 krat večji učinek kot enaka količina samega glutamata. Že dolgo časa je poznano, da nekateri mikroorganizmi v času rasti izločajo majhne količine aminokislin. Ker se je potreba po aminokislinah s časom zelo povečevala, je raziskovalce silila v nek novi vir pridobivanja; tako je leta 1958 japonski avtor Kinoshita s sod., prvič opazil mikroorganizem, pod nazivom Micrococcus glutamicus ki je neposredno tvoril L- glutaminsko kislino. Pred tem pa je proizvodnja glutamata potekala s pomočjo hidrolize proteinov. Problem hidrolize je vir in količina izhodnega materiala. ajveč glutaminske kisline vsebuje čisti pšenični gluten, okrog 35%. Vendar pa je vsebnost glutena v pšenici od 8,6 do 17,2 %. Drugi vir je bil koruzni gluten, le da ta vsebuje manjši % glutena. V glavnem sta se

9 Biosinteza ojačevalcev arom, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, uporabljala dva tipa proizvodnje glutaminske kisline, odvisno pač ali je bila glutaminska kislina pridobljena najprej kot hidroklorid ali kot kislina sama. V obeh primerih pa je hidroliza potekala v avtoklavu v prisotnosti 34% CL, visoke temperature in tlaka. Sledila je kristalizacija, filtracija in koncentriranje. Kinoshita je torej prvi opazil, da je večina celic zraslih na agarju okroglaste ali jajčaste oblike in so zelo blizu rodu Micrococcus, od tod so ti mikroorganizmi dobili tudi ime. Ugotovil je, da so celice teh sevov včasih podaljšane oblike in vsebujejo metakromatska zrnca ter diaminopikolinsko kislino. Vse te lastnosti pa so značilne tudi za rodova Corynebacterium in Brevibacterium. Kinoshita je istega leta na Mednarodnem mikrobiološkem kongresu v Montrealu utemeljeval, da so celice teh bakterij lahko dalj časa v prisotnosti majhnih količin vitaminov, a manj časa, če gojišče vsebuje več teh vitaminov in poudarja, da je bolje imenovati ta organizem Corynebacterium glutaminicum. Takayana s sod. je nato dokazal, da te bakterije bližje predstavnikom rodu Corynebacterium, Brevibacterium in Arthrobacter. 2.2 Umami Umami ali umami okus je na Japonskem izraz, ki pomeni slastno, okusno. Komponente odgovorne za potenciranje okusa so bile kasneje odkrite kot a-glutamat, dinatrijev 5'- inozat in dinatrijev 5'-gvanolat. dkritje MSG, IMP, in GMP je temeljilo na proučevanju umami komponent treh tradicionalnih jedi na Japonskem, iz katerih so pripravili vodne ekstrakte. MSG, IMP in GMP so bili izolirani iz posušenih morskih alg (KMBU), posušenega bonita (KATSUBUSI) in posušenih japonskih gob (SITAKE). Raziskave so pokazale, da se z dodatkom nukleotidov doseže celo boljše učinke ojačanja arome in okusa, kot je to v primeru natrijevega glutamata. Pri dodajanju natrijevega glutamata jedem, dobimo enodimenzionalni učinek ojačanja. To pomeni, da ob njegovem dodatku dobimo vedno umami okus. Dodatek 5'-nukleotidov pa nam služi kot ojačevalec in tudi nosilec arome in okusa. Z njimi hrano obogatimo tudi z drugimi profili arom in okusov. Z izborom ustrezne mešanice nukleotidov, lahko jedem dodamo aromo govejega ali piščančjega mesa, pečenega kruha ali sira, itd. Zaradi vseh naštetih lastnosti pravimo, da dajo jedem večdimenzionalni efekt arome ( Van Damme s sod., 1994 in agodavithana, 1991). Za ojačanje arom, juh in omak zadovoljuje dodatek 0,005-0,01% 5'- ribonukleotidov. Poleg tega, pa nam dodatek teh aditivov pomaga tudi pri odpravi neželjenih priokusov, kot je kovinski okus pri pločevinkah ( Crueger, 1989). Japonske kulture so za izboljšavo kvalitete okusa uporabljale tudi naravno prisotne vire, kot so npr. morske haloge (Laminaria japonica) in t.i. črne gobe (Lentinus edodus), ki so hrani dali slasten priokus znan kot umami. 3. MIKRBILŠKE SVE BIPRCESA

10 Biosinteza ojačevalcev arom, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, Pri sintezi spojin, ki vplivajo na aromo in okus lahko uporabljamo bakterijske kulture. Gre za proizvodnjo ojačevalcev arom, spojin, ki same po sebi nimajo komponent, ki sestavljajo okus ali aromo, pač pa imajo sposobnost ojačanja in izboljšanja že obstoječega okusa. Tipični predstavniki ojačevalca okusa vsebujejo a-glutamat in 5'-nukleotide (GMPgvanozin monofosfat in IMP-inozin monofosfat). L-glutamat proizvaja Corynebacterium glutamicum, ki ima spremenjen encim TCA cikla (α-ketoglutarat dehidrogenazo), kar povzroča akumuliranje presežka α-ketoglutarata v mediju in olajšuje izolacijo (Cheetman, 1991). 5'-nukleotide proizvajata B. subtilis in Bacillus ammoniogenesis na katerih je bilo opravljenih veliko raziskav sinteze purinskih nukleotidov. Čeprav je ta pristop tehnično možen, pa se v komercialne namene še vedno uporablja kemijska fosforilacija.v primeru DA tehnik je Miygawa (1986) dokazal pridobivanje gvanozina (za a-gvanilat) s postopkom kloniranja genov mikroorganizma B. subtilis. Gen za IMP-dehidrogenazo je bil najprej kloniran v E.Coli in nato vstavljen v B.Subtilis, kjer so še povečali število genskih kopij. Rezultat je bil zelo porasla produkcija gvanozina. 3.1 snove bioprocesa za glutaminsko kislino d leta 1958 so znanstveniki izolirali veliko bakterij, katerih značilnost je velika proizvodnja glutaminske kisline iz dostopnih virov ogljika in anorganskega dušika. V glavnem so to bakterije rodov Micrococcus, Brevibacterium in Arthrobacter. Skupna lastnost vseh teh bakterij pa je: so gram pozitivne, ne mobilne, nesporogene, aerobne, katalaza pozitivne, elipsoidno okrogle. V naravi se redko nahajajo visokoaktivni sevi takih bakterij. Predvideva se, da so te vrste bakterij - producenti, v resnici nastali v naravi, ker so bili izpostavljeni mutagenim dejavnikom, kot so radiacija, prisotnost inhibitornih sestavin itd. Danes se predpostavlja, da je proces mutacije smer, za ustvarjanje ugodnega seva (producenta). Zaradi tega je zelo važno proučevanje pogojev gojenja in hranjenja takih sevov. snove za pridobivanje glutaminske kisline, so lahko dokaj enostavne. Kot izvor ogljika se na splošno rabi glukoza, ki se dobiva s kislo hidrolizo škroba, saharoza iz melase ali sladkorne pese. V novih postopkih za pridobivanje L-glutaminske kisline, se lahko uporablja različne ogljikovodike, od naravnega plina (metan, etan), parafina ali aromatičnih ogljikovodikov (benzilalkohol, pirokatehin). Tabela 1: Mikroorganizmi uporabljeni pri pridobivanju L-glutaminske kisline (Vučetić, 1982) VRSTA dkritelj 1. Micrococcus glutamicus Kinoshita s sod. 2. Brevibacterium aminogenes ta in Tanaka 3. Micrococcus glutamicus Chen, Tu in Chem 4. Bacillus megaterium-cereus Chao in Foster 5. Brevibacterium sp. Kobayashu in sod. 6. Brevibacterium flavum kumura in sod. 7. Brevibacterium divaricatum Su in Yamada

11 Biosinteza ojačevalcev arom, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, Microbacterium salicinovorum Doi in Kaneko 9. Brevibacterium sp. ashida in sod. 10. Brevibacterium thiogenitalis Kanzaki in sod. 11. Microbacterium ammoniaphilum Miyai in sod. Vse navedene kulture pretvarjajo 40% raztopino sladkorja v L-glutaminsko kislino in dajejo več kot 30 g/dm 3 glutaminske kisline. Vsekakor najzanimivejši rezultat teh raziskav pa je bil, da vse bakterije vključno z Bacillius in Arthrobacter, zahtevajo biotin in da je količina biotina ključni dejavnik pri kontroli pridobivanja L-glutaminske kisline. Veldkam in sod. so ugotovili, da obstaja izrazit odnos med pomanjkanjem biotina in sposobnosti akumulacije L-glutaminske kisline. Poudariti je treba, da auksotrofni mutant E. coli, za katero je ugotovljeno, da ne potrebuje biotina, daje znatne količine L- glutaminske kisline v gojišču. 3.2 Kontinuirna produkcija 5'-nukleotidov iz RA kvasovk, s hidrolizo imobiliziranih 5 -fosfodiesteraz in 5 -adenilat deaminaz Sinteza 5 - IMP in 5 - GMP z encimsko konverzijo RA poteka tu v kontinuirnih TW PACKED-BED reaktorjih. 5 - nukleotidi se pridobijo na več načinov. Dva izmed teh sta: - direktna ekstrakcija iz hrane z anaerobnim bioprocesom - encimsko oz. kemijsko s hidrolizo RA Encimska hidroliza RA za sintezo ribonukleotidov kot ojačevalcev arom in okusa je bila dolga leta predmet raziskav. Pri tej hidrolizi je potreben encim 5 - fosfodiesteraza, ki je brez nukleaznih aktivnosti. Za pridobitev 5 -IMP potrebujemo tudi primerne deaminaze, da deaminirajo 5 - AMP. Encim se lahko uporablja v obliki raztopine kot imobiliziran derivat, ali pa se pa se direktno doda hrani v "trdni" obliki. Za produkcijo 5 - nukleotidov kot sestavina hrane, se lahko kontinuirno uporabita oba encima. Imobilizirana sta na porozni keramiki s kovalentnimi vezmi, na derivate alkilamidov iz glutaraldehida. To se uporabi v MIXED-BED reaktorski koloni, ki vsebuje dva volumna 5 -fosfodiesteraze in en volumen 5 - AMP deaminaze. Seveda se oba encima razlikujeta tudi po stabilnosti pri določeni temperaturi, tako, da reakcija poteka pri temperaturi tistega encima, ki ima slabšo temperaturno odpornost. Izolacija encimov nam je prinesla veliko prednosti, saj imajo encimi večjo stabilnost, višjo produktivnost in možnost kontinuirnega procesa. 4. BIKEMIJSKE SVE BIPRCESA

12 Biosinteza ojačevalcev arom, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, ukleotidi, ki povzročajo umami okus, so sestavljeni iz purinskega obroča s hidroksilno skupino (ali keto skupino) na 6-C atomu in ribozo zaestreno s fosforno kislino na 5-C atomu.vodik na 2. položaju se lahko zamenja s hidroksilno ali amino skupino, ne da bi neugodno spremenil sposobnost ojačevanja okusa (shema 1.) mesto B mesto A x mesto X P - C 2 Shema 1. Strukturna formula 5'-purinskega nukleotida. Prikazuje skupine, ki so komplementarne s tremi mesti na receptorsken področju (KUIAKA,1981). Vsak 5'-nukleotid kot ojačevalec okusa ima najmanj tri receptorska mesta za povezovanje (Kuninaka, 1981). Med aktivacijo se mesto A veže z dvema kisikoma fosfatnega estra, med tem, ko se mesto B, ki je 8 angstrenov oddaljen od A, veže s kisikom na 6-C atomu purinskega obroča. Začasna adsorpcija kemičnega stimulanta je končana z vezavo substituent X (, 2, ) na akceptorsko mesto X (shema 1.). Čeprav je a-glutamat znan po ojačevanju okusov, vsebuje strukturne oblike, ki bi lahko omogočile pojav vseh osnovnih okusov; sladko, kislo, slano, grenko. Pomembni deli za povezovanje molekul so: plananarna struktura α (alfa) in δ (delta) karboksilne skupine z obema skupinama v ionski obliki in α-vodikov atom. Glej shemo 2. GREKST? IMP: X - predstavlja GMP: X - predstavlja XMP: X - predstavlja 2 KISLST? - C + C - 3

13 Biosinteza ojačevalcev arom, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, Shema 2. Struktura L glutamata prikazuje pomembne oblike za povezovanje na receptorsko področje (KUIAKA 1981). 4.1 Biosinteza glutaminske kisline Glukoza kot vir ogljika, se razgradi na fragmente s C3 in C2 atomi, z mikroorganizmi, ki proizvajajo glutaminsko kislino z Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) reakcijsko potjo, ali s pentoza fosfatnim ciklom. Ti fragmenti vstopajo v cikel trikarboksilne kisline (TCA). Za proizvodnjo glutaminske kisline je bolj običajna EMP pot. Glavni prekurzor glutaminske kisline je α-ketoglutarat, ki nastane v TCA ciklu preko citrata in izocitrata in se nato spremeni v L-glutaminsko kislino z aminacijo s prostimi 4 ioni (katalizator je ADP glutamat dehidrogenaza). Kot vir ogljika se lahko uporablja tudi acetat. Sproščena energija in oblikovanje intermediatov nastajajo v glavnem v glioksilatnem ciklu (shema 3) Acetat Acetil-P Acetil-CoA ksalacetat Citrat Acetil-CoA Malat cis-akonitat Glioksilat

14 Biosinteza ojačevalcev arom, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, Fumarat Izocitrat Sukcinat α-ketoglutarat Shema 3. Glioksilatni cikel Glutamat Med procesom poteka kompeticija med reakcijo izocitrat liaze, kjer se oblikuje sukcinat in glioksilat (potrebna za optimalno rast) in reakcijo izocitrat dehidrogenaze, ki vodi v nastanek glavnega prekurzorja α-ketoglutatarata. Stehiometrija nastanka glutaminske kisline iz glukoze oz. acetata: C C C C C C mol glutaminske kisline nastane iz 1 mol glukoze oz. 3 mol acetata. Eksperimentalno je dokazana konverzijska stopnja mol%. 4.2 Faktorji, ki vplivajo na anaeroben bioproces: Vir ogljika: širok spekter ogljikovih hidratov se lahko uporablja kot vir ogljika. Med monosahridi se večinoma uporablja glukoza, včasih tudi fruktoza, maltoza in ksiloza. Kot nerafiniran vir ogljikovih hidratov se uporabljata melasa sladkornega trsa, ter melasa rdeče pese. Velikokrat se uporabljajo tudi hidrolizati škroba. Melasa vsebuje veliko biotina ( mg/ kg trsne melase; mg/kg pesine melase), zato je potrebno pri uporabi cenejših virov ogljika (melasa) anaerobnemu bioprocesu dodajati penicilin ali derivate maščobnih kislin. V Evropi se kot cenejši vir ogljika smatra le pesina melasa, drugod po svetu pa se večinoma uporablja trsna melasa. a Japonskem se kot poceni vir ogljika pojavlja acetat, ki je tudi dostopen v večjih količinah in se zato uporablja kot glavni vir ogljika sam ali pa v kombinaciji z melaso sladkornega trsa. Poskusno so se uporabljali tudi viri, kot so metanol, etanol, acetaldehid ali -alkani, vendar se zaradi neugodnega razmerja med stroški in učinkovitostjo ti postopki niso uveljavili Vir dušika: večinoma se uporabljajo amonijeve soli, kot dodatek tem pa se uporablja amoniak v plinastem stanju ali v obliki vodne raztopine. V industrijski proizvodnji glutaminske kisline dodajanje amoniaka omogoča vzdrževanje optimalne p vrednosti, hkrati pa ne pride do presežka amoniaka... Večina bakterij, ki proizvajajo glutaminsko kislino, je t.i. ureazno aktivnih, kar pomeni da lahko kot vir dušika dodajamo ureo. V

15 Biosinteza ojačevalcev arom, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, p območju, ki se pojavi pri presežku amoniaka, se prične proizvajati glutamin namesto glutaminske kisline. Rastni faktorji: optimalna koncentracija biotina je odvisna od uporabljenega vira ogljika; pri mediju, ki vsebuje 10% glukoze znaša 5µg/L, v mediju z manjšo konc. glukoze je konc. biotina opazno manjša; pri uporabi acetata je konc. med µg/l. ekateri načini proizvodnje zahtevajo L-cistein kot dodaten rastni faktor; v mediju, kjer so vir ogljika -alkani pa je potreben dodatek tiamina. Preskrba s kisikom: optimalna proizvodnja glutaminske kisline je podana s t.i. K d vrednostjo, ki znaša 3.5x10-6 mol 2 / atm min ml. Koncentracija kisika mora biti ravno pravšnja; pri pomanjkanju kisika se pojavi izločanje laktata in sukcinata; previsoka konc. pa inhibira rast, izločati pa se začne tudi α-ketoglutarat. V obeh primerih se zmanjša produkcija glutaminske kisline. Tabela 2. Proizvodnja glutaminske kisline z različnimi viri ogljika: vir ogljika m.organizem proizvodnja gl. ksl. (g/l) pesina melasa Corynebacterium > 100 glutamicum glukoza +amonijev Brevibacterium 100 acetat divaricatum acetat Brevibacterium flavum 98 etanol Brevibacterium sp alkan Arthrobacter paraffineus 62 Corynebacterium hidrocarboclastus 84 C.alkanolyticum 72 benzojska kislina Brevibacterium sp. 80 eorganski elementi gojišča so razne soli K 2 P 4, K 2 P 4, kot izvori fosforja, ki igra zelo pomembno vlogo v celičnem metabolizmu in kot K + ion. Pomembni mikroelementi so še: Mg 2+. Zn 2+, Fe 2+, Mn 2+, ki služijo v glavnem kot aktivatorji različnih encimov. Kot stimulatorji rasti služijo ekstrakti žitaric, kvasa in biotin.

16 Biosinteza ojačevalcev arom, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, gawa je s sod. dokazal, da večina vrst Brevibacterium proizvaja L-glutaminsko kislino in alanin. Ali prevladuje L-glutaminska kislina ali alanin pa je v veliki meri odvisna od vrste uporabljenega gojišča. 4.3 Učinkovanje na prepustnost membrane za glutaminsko kislino. Povečana prepustnost membrane za glutaminsko kislino je lahko dosežena na več načinov: - s pomanjkanjem biotina - s pomanjkanjem oleinske kisline - z adicijo nasičenih maščobnih kislin oz. derivatov mašč. kislin - z dodajanjem penicilina - s pomanjkanjem glicerola Vsi načini proizvajanja glutaminske kisline imajo rastno potrebo po biotinu, to je, po esencialnem koencimu sinteze mašč. kislin. b prisotnosti biotina v konc. večji od 5µg/L se povečan nastanek oleinske kisline kaže kot visoka vsebnost fosfolipidov v celični membrani. To pa preprečuje izločanje glutaminske kisline, ki se začne akumulirati v celici do konc µg/mg suhe teže, tako je biosinteza ustavljena zaradi t.i. feedback inhibicije. V nasprotnem primeru pomanjkanje biotina povzroča spremembo nasičenih mašč. kislin v nenasičene in s tem se intracelularna glutaminska kislina lahko izloči. Dodatek penicilina v logaritemski fazi rasti celic povzroča znatno povečanje izločanja L- glutaminske kisline, kljub prisotnosti biotina. Penicilin se doda anaerobnemu bioprocesu v mediju, ki vsebuje visoke konc. biotina 8-12 h po inokulaciji v fermentor. Količina penicilina je med enot/ml brozge, tako da je bakterijska rast zmanjšana na enak nivo, kot pri mediju, ki mu primanjkuje biotina. Uporaba penicilina oz. nasičenih mašč. kislin omogoča komercialno uporabo cenejših medijev, kot sta melasa sladkornega trsa in rdeče pese, ki se drugače ne bi mogla uporabljati zaradi visoke vsebnosti biotina. dkritje vpliva prepustnosti membrane je omogočila racionalne pristope k industrijski proizvodnji te pomembne aminokisline. 4.4 ačin proizvodnje Pod optimalnimi pogoji bakterije spremenijo 50-60% dodanega ogljika v L-glutaminsko kislino. Pri neoptimalnih pogojih, kjer gre za manjšo prozvodnjo glutaminske kisline, se pojavlja porast celične mase in izločanje laktata, sukcinata, α-ketoglutarata, glutamina in -acetilglutamina. 4.5 Regulacija encimov vpletenih v sintezo glutamata Pri biosintezi L-glutaminske kisline igrata glavno vlogo naslednja dva encima:

17 Biosinteza ojačevalcev arom, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, fosfoenolpiruvat karboksilaza (PEPC): katalizira karboksilacijo fosfoenolpiruvata do oksalacetata inhibira jo L-asparaginska kislina, represirata pa jo oba, tako L-asparaginska kislina kot L-glutaminska kislina α-ketoglutarat dehidrogenaza (KD): pretvarja α-ketoglutarat v sukcinil-coa. Pri mikroorganizmih s povečano tvorbo L-glutaminske kisline, pa je nadaljnja oksidacija α- ketoglutarata v sukcinat omejena, kar povzroča nastanek L-glutaminske kisline 1.V večini mikroorganizmov je glavna pot za sintezo glutamata GS-GGAT pot: (1) L-Glutamat ATP L-glutamin +ADP + P i (GS: glutamin sintetaza) (2) L-Glutamin + α-ketoglutarat + ADP L-glutamat + ADP + (GGAT: glutamin: oksoglutarat aminotransferaza) Sum (1) + (2): α-ketoglutarat ATP + ADP + + L-glutamat + ADP + + ADP + P i Čeprav ta biokemijska pot porablja en ATP za vsako sintetizirano molekulo L-glutamata, je bolj zaželena kot naslednja, spodaj opisana pot, saj ima nižjo K m vrednost (veliko nižja kot 1mM) za 3 in na ta način lažje izrablja amoniak. 2. aslednja biokemijska pot je pot glutamat dehidrogenaze: α-ketoglutarat AD(P) + + L-glutamat + AD(P) (GD: glutamat dehidrogenaza) Ker je K m vrednost za 3 višja (ponavadi okrog 1mM), postane ta pot pomembna samo ob visoki koncentraciji BIIŽEIRSKE SVE BIPRCESA 5.1 Produkcija 5 - nukleotidov iz kvasovk z nukleazo P 1 V letu 1955 je bilo odkrito, da ima izmed treh izomer inozinskih kislin, samo 5 - IMP lastnosti ojačevalca arom in okusa. iti 2 - IMP niti 3 - IMP nimata te lastnosti. P P P 2'- IMP 3'- IMP 5'- IMP

18 Biosinteza ojačevalcev arom, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, Shema 4. Izomere inozin monofosfatov. Samo 5 - IMP ima lastnosti ojačevalca arom. bdelana nukleaza P 1 je pridobljena iz Penicillium citrinum, ki je zrasel na pšeničnih otrobih. Ta nukleaza je mutant nukleaze P 1. Vodni ekstrakt te kulture ne vsebuje samo termostabilnih nukleaz P 1, ampak tudi termolabilne fosfomonoesteraze, ki so sposobne hidrolizirat 5 - nukleotide. Če vodno raztopino kvasne RA inkubiramo z vodnim ekstraktom tega toplotno obdelanega encima, dobimo popolnoma razgrajeno RA, oz. 5 - nukleotide (AMP, GMP, CMP in UMP), ki jih lahko ločimo z anionsko kolonsko kromatografijo in čiščenjem. AMP se zelo lahko invertira v IMP z aspergillus adenil deaminazo. Za produkcijo 5'-nukleotidov, so odkrili oz. razvili tudi mutante različnih sevov (glej tabela 2). Rezultati vseh raziskav namigujejo na to, da sta morfologija celic in sinteza IMP v povezavi. Sinteza IMP-ja je najvišja ob prisotnosti adenina v zelo majhnih koncentracijah in je močno znižana s prekomernim dodatkom adenina. Adenin in Mn 2+ vplivata na sintezo IMP-ja neodvisno: adenin deluje kot regeneratorski regulator na purinove nukleotide, Mn 2+ pa povzroči morfološke spremembe in spremeni permeabilnost membrane za IMP. MUTAT IMP (mg/ml) yp (mg/ml) KY3454 / / / KY IMP+yp (mg/ml) KY KY KY KY KY V sledovih KY V sledovih Tabela 2. Pregled mutantov in rezultati njihovih sintez IMP in yp.

19 Biosinteza ojačevalcev arom, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, Proizvodnja ojačevalcev okusa iz kvasne biomase Produkcija 5'-nukleotidov Prva objavljena metoda za produkcijo 5'-nukleotidov je bila encimska razgradnja RA, nekaj let kasneje, pa so bile objavljene še ostale tri metode: a) RA mikrobni encim 5 - nukleotidi b) RA mikroorganizem inozin ali gvanozin kem. konverzija IMP ali GMP c) RA mikroorganizem IMP d) RA mikroorganizem XMP mikrobni encim GMP Tako so začeli raziskovati in proučevati tiste mikroorganizme, ki so sposobni razgraditi RA v 5 - nukleotide in izolirali Penicillium citrinum, l Penicillinski encim so poimenovali nukleaza P 1 in je podoben endonukleazi S 1, (iz Aspergillusa). Izmed 5 - nukleotidov pridobljenih iz RA Penicillium citrinum, so imeli lastnosti ojačanja arom samo GMP, XMP in IMP. GMP je imel nekajkrat višjo zmožnost ojačanja arom kot IMP, vendar sta se dobro dopolnjevala kot ojačevalca (imata sinergističen odnos). Tako se je leta 1961 začela industrijska proizvodnja IMP in GMP, ter izolacija encimov iz Penicillina. Vzporedno so začeli pridobivati IMP in GMP tudi z encimi streptomycet, vendar se to ni dobro obneslo in se ni ohranilo. ukleotidi in z njimi povezane komponente se danes ne uporabljajo samo kot ojačevalci arom, ampak se uporabljajo tudi v biokemiji in farmaciji. Zadnje raziskave so pokazale, da imajo nekateri nukleotidi zelo pomembno vlogo tudi v prehrani, npr.: v otroški oziroma dojenčkovi, dietni, vplivajo tudi na imunski sistem celic, povečajo delovanje epitelnih celic črevesja. ukleotidi so sestavni deli RA in jih zato lahko pridobivamo z degradacijo RA. V kvasovkah je nukleinska frakcija v glavnem sestavljena iz RA in majhnega dela DA. pr. Candida utilis vsebuje % RA (Akijama, 1975), pekovski kvas pa okoli 8-10 % RA. Dokaj ekonomična proizvodnja kvasovk v primerjavi z drugimi m.organizmi je kvasovke postavila za izbran mikroorganizem za proizvodnjo 5'-nukleotidov. Kot dodatek hrani dovolj čista gvanozin monofosfat (5'-GMP) in inozin monofosfat (5'- IMP) se komercialno pridobivata direktno z anaerobnim bioprocesom.

20 Biosinteza ojačevalcev arom, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, P RA C 2 GVAI P C 2 5'- UKLETIDI GVAI PDE P C 2 ADEI P C 2 CITZI P C 2 URACIL PDE PDE P C 2 ADEI P C 2 CITZI

21 Biosinteza ojačevalcev arom, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, Shema 5. Prikaz pridobivanja 5'-nukleotidov iz RA s pomočjo encima 5'-fosfodiesteraze (PDE) Kot že vemo ima le 5'GMP sposobnost ojačanja okusa.v teh pogojih ga nastane 1,5-3 %. 5'-AMP nima možnosti ojačanja okusa, lahko pa služi kot predhodnik za 5'- IMP.Sprememba 5'-AMP v 5'- IMP je mogoča ob encimu adenil deaminaza (shema 7.) 2 ADEIL DEAMIAZA P C 2 P C 2 Shema 6. Prikaz pretvorbe 5'-AMP v 5'-IMP s pomočjo adenil deaminaze. Med hidrolizo nastajajo manjše količine glutaminske kisline ki s svojim sinergističnim delovanjem s 5'-GMP in 5'-IMP še povečujejo funkcijo ojačevalca okusa. 6. UPRABA BIPRIZVDV V PRIZVDJI RAE

22 Biosinteza ojačevalcev arom, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, Uporaba genetike in genetsko-inženirske metode za proizvodnjo hrane in dodatkov hrani Zadnje desetletje je pokazalo presenetljiv napredek v kvantitativnem in kvalitativnem izboljšanju uporabnosti mikroorganizmov zaradi uporabe metod genetskega inženiringa v živilski industriji. V primerjavi s klasično metodo mutageneze in hibridizacije, genski inženiring pospeši izmenjavo genskih kodov za določene produkte ali določene kvalitete in njihove nove kombinacije z drugimi geni v kateremkoli darovalcu ali gostitelju celice. Tovrstni dosežki v spreminjanju mikroorganizmov z mutacijo, hibridizacijo in genskim inženiringom se nanašajo na uporabo mikroorganizmov v proizvodnji encimov, aminokislin, užitnih organskih kislinah, aromatskih in podobnih produktih. bičajne genetske metode še vedno igrajo pomembno vlogo pri izboljšanju mikrobnih produktov. Vendar genetski inženiring ponuja daleč boljše alternative glede specifičnih sprememb kvalitativnih in kvantitativnih lastnosti mikroorganizmov. To se posebej nanaša na manipulativnost tovrstnih genov, ki dajo nove karakteristike njihovim gostiteljskim organizmom (npr. izkoriščanje drugih substanc in odpornost proti različnim okoliškim influencam) ali pospešijo sintezo ojačevalcev produktov (npr, encimov, aminokislin in organskih kislin). V začetku ima bakterija prednost zaradi njene preproste strukture, uporabe in hitre rasti. Ponavadi niso primerne za izražanje rastočega števila genov evkariontov ali uporabljenih modelov. Toksično neškodljivi mikroorganizmi so vsebovani v GRAS-registru FDA (Bacillus subtilis, Streptococcus lactis, Saccharomyces cerevisiae in Aspergillus niger). Tri možnosti za uporabo metod genskega inženiringa v živilski proizvodnji: 1. Izboljšanje koristi in kvalitete tradicionalnega mikrobnega anaerobnega biprocesa (npr. v proizvodnji piva, sira in kruh). 2. Vplivanje na kvaliteto surovih materialov uporabljenih v živilski industriji z genskim inženiringom v rastlinski in živalski pridelavi. 3. Izboljšanje kvalitete in kvantitete živali, rastlin in mikrobnih produktov z uporabo ustreznih organizmov, spremenjenih z genskim inženiringom (npr. mikrobno sirišče). 6.2 aravni ojačevalci arom ov tip ojačevalcev arom prinaša nove kombinacije in dvig rastlinskih in dišavnih mešanic. Lahko je uporabljen v solatnih prelivih, omakah in juhah za dosego okusnih arom ter pomaga k uravnoteženosti arom pri nekaterih manj mastnih sredstvih. jačevalec sojine arome je osnovan na anaerobnem bioprocesu sojine moke in je označen kot tak. To je bil rezultat ključnih raziskav pri odkrivanju in izdelovanju novih tipov ojačevalcev arom. To delo so opravili na izozemskem. Za nameček so raziskovalci odkrili tudi, da ojačevalec arom podaljšuje trajanje teh arom zaznanih na jeziku. V poizkusih se uporabljajo različni eksperimentalni vzorci in kontrole. Sestavine podaljšajo zaznavo arome do trikrat dlje. Ta efekt je zaščiten s strani proizvajalca kot Linger Longer TM.

23 Biosinteza ojačevalcev arom, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, ekateri vrste sirov se lahko uporabljajo kot ojačevalci arom. Podjetja kombinirajo te snovi s kvasnim ekstratom pri oblikovanju sestavin, ki jim pravimo»gb Select Cheese Booster«. Dve komponenti delujeta pri poostritvi arome trdega sira, ter povečujeta masleno in motno rumeno barvo in dodatek sirovega znaka. To so testirali na sirovih omakah in sirovih keksih. Sir veliko bolj vpliva na kekse, manjša pa je uporaba sirovega praška. Sojin ojačevalec arome povrne siru, parmezanu in drugim prelivom motno rumeno barvo in okus po sirarni. Vedno pomaga zaokrožiti in izenačiti ustrezno aromo. Sojina aroma ojači tudi okus juhe zlasti takrat, kadar so prisotne določene rastlinske komponente. Sestavine ne vplivajo na sočnost arome piščanca ali drugih mesnih juh, kot kvasnemu ekstraktu. Sojina aroma nima tudi nič glutaminske kisline in nobenih 5 glavnih nukleotidov, ki jih pogosto najdemo v šatrajevem ojačevalcu arom. Za ljubitelje sladic, sojina aroma naredi sladoledom in kremnim pudingom bogatejši okus. Firma razvija prototip za zmešan suh rižev puding, tako da poteka kuhanje hitro in ima bogat, kremast okus in teksturo ohlajenega riževega pudinga. jačevalci arom dvigujejo dišavne note. Ko je dodan v egg nog, naraščajo izbrani znaki in muškatni orešek kot praizvor. ajdeni formulatorji lahko naredijo bogat egg nog z manj motno rumeno barvo. jačevalec rahlo povečuje zaznavanje soli, vendar ne zadosti da bi služil kot nadomestilo za sol. 7. IMPLIKACIJE DRUGI TELGIJ I IMPLIKACIJE A DRUGE TELGIJE Kot je že bilo omenjeno, je glutaminska kislina količinsko največja proizvedena aminokislina in se uporablja kot ojačevalec okusa pri mesu, perutnini, morskih sadežih, juhah, enolončnicah itd. Vendar pa ima vlogo ojačevalca samo L oblika glutaminske kisline, D oblika te vloge nima. ajveč pa se uporablja mono natrijeva sol glutaminske kisline, ki daje svojstven "umami" okus. a-glutamata: v Veliki Britaniji je trenutna poraba na osebo 4g a-glutamata na teden. Tudi podatki za ZDA se približno sovpadajo s tem in znašajo 0,55 g na osebo na dan. a Tajvanu pa je poraba na prebivalca veliko večja in znaša povprečno 3 g a-glutamata na dan. Čeprav je metabolizem dodanega a-glutamata v človeškem telesu popolnoma enak naravno sintetiziranemu, se pojavljajo razna gibanja, ki nasprotujejo uporabi dodanega aglutamata. a drugi strani pa se pojavljajo težnje v prid a-glutamatu. Tako naj bi prav ta znižal porabo natrija dobljenega iz kuhinjske soli za 30 do 40%. FDA (Food and Drug Administration) je že leta 1958 priznala mono a-glutamat kot "GRAS(Generally Recognized As Safe)" sestavino začimb. d takrat naprej je bilo narejenih še ogromno dodatnih biokemičnih, toksikoloških in medicinskih študij, ki so potrdile mono a-glutamat kot varen proizvod za splošno populacijo, vključujoč nosečnice in otroke. Poleg tega pa se glutaminsko kislino lahko uporablja tudi kot vlažilec v kozmetiki, želatinski agent v rastlinskem olju in za oljne disperzije. Stopnjevanje arome v obdelanem mlečnem izdelku:

24 Biosinteza ojačevalcev arom, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, Metode in delo sta namenjena za stopnjevanje in izboljšanje arome v fermentiranih mlečnih izdelkih. Identificirati in odstraniti moramo mastno frakcijo iz mastnega mleka (masla) za uporabo v obliki aromnih prekurzorjev. dstranjena frakcija je dodana produktom med proizvodnim procesom tam kjer so primerni za izboljšanje arome z nepomembnimi karakteristikami produktov. dstranjena frakcija bolj stopnjuje aromo, zaradi maščobnih kislin in ima nizko točko tališča. Aromni prekurzorji so ponavadi dodani v kombinaciji z maščobnimi nadomestki za zmanjšanje maščobnih produktov. omogenizacija vseh v vodi raztopljenih proteinski komponent je v tem tipu produktov oplemenitenih samo del teh komponent. Metoda je posebno primerna za proizvodnjo fermentiranih mlečnih izdelkov z manj maščobami. jačena krema za izboljšanje okusa rakov: Aroma za rake je osnovana na presejanem pireju iz leče. Izboljša okus rakov, še posebno jastogov. Živila, ki vsebujejo aldehidne generatorje: Generatorski acetat se uporablja za ojačene aromne karakteristike, ki jo ima živilo. Karakteristike acetata vključujejo: stabilno vlažnost, toploto in oksidacijo med skladiščenjem. Vključene so v suho aromo in trdni preostanek in ne smejo ovirati pri želeni aromi in priskrbeti morajo višji odstotek trdnosti, zaradi tega je lahko fiksiran acetaldehid v suhi aromi potem prej aktiviran. Acetal je lahko uporabljen v pijačah, kompotih, desertih in v gotovih in zmrznjenih jedeh. Acetatni dodatek je med 5 in 1000 (ločitev na milijon)odvisno od vrste hrane. jačevalec arome pridobljen iz krompirja: Vsebuje kombinacijo neeteričnih sladkorjev, kislinske in kovinske aromne komponente skupaj z krompirjevo osnovo in nato vse sestavine segrevamo pri visoki temperaturi za proizvodnjo boljših aromnih komponent, kot jih ima karakteristična krompirjeva aroma.ta kombinacija komponent ojačevalcev arom je dodana v krompirjevo osnovo pri živilski proizvodnji. Končni proizvod tako vsebuje naravno krompirjevo aromo. 8. REFERECE Batič, M. in Raspor, P Kvasna biomasa kot aditiv. 16. Bitenčevi živilski dnevi 94: Aditivi, Bled 9. In 10. Junij Ljubljana, BF ddelek za živilstvo, str BEST, D. 1989, Spices flavors and oleoresins. Prepared-Foods, str , 150. Eber, M Mueller, WD Spray dryed soy souce as flavour enchancer-alternative or competition to glutamate? Fleischwirtschaft, 78 (12). str FIS, WW. 1991, A method for the quantitation of 5'-mononukleotides in foods and food ingredients. Journal of Agicultural and Food-Chemistry. Str

25 Biosinteza ojačevalcev arom, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, yoky, G. Sarkki, M.L. Tylli, M. Method of producing a yeast extract useable in foodstuffs, where undesirable flavouring agents in the extract have been removed, PCT-international-patent-application, W 96/38057 (W96/38057) Klofutar, C Pregled dodatkov v živilstvu-definicija in uporaba. 16. Bitenčevi živilski dnevi 94: Aditivi, Bled 9. In 10. Junij Ljubljana, BF ddelek za živilstvo. str. 8. Likar, P Aerobni bioproces rasti kvasovke Saccharomyces cerevisiae in akumulacija RK. Dipl. al., Ljubljana, Biotehniška fakulteta, ddelek za živilstvo, Str. 2-4 Mermelstein,. 1989, Continious fermentor produces natural flavor enchancers for foods and pet foods. Food Technology. Str agodawithana, T. 1992, Yeast derived flavours and flavour enchancers and their probable mode of action. Food Technology. Str. 138, , 144. lmedo, S. Iturbe, F. Gomez-ernandez, J. Lopez-Munguia, A. 1994, Continious production of 5'-ribonucleotides from yeast RA by hydrolysis with immobilized 5'- phosphodiesterase and 5'-adenylate deaminase. World-Journal of Microbiology & Biotechnology, 10 (1), str Romero, D.A. 1992, Bacteria as Potential sources of flavour metabolites. Food- Technology, str. 122,