NGHIÊN CỨU VÀ NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM TỪ CHỦNG Serratia marcescens DT3

¹i häc quèc gia hµ néi Tr êng ¹i häc khoa häc tù nhiªn ------------***------------ TRẦN THỊ THÙY LINH NGHIÊN CỨU VÀ NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM TỪ CHỦNG Serratia marcescens DT3 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội 2016

MỞ ĐẦU Hàng năm trên thế giới, bệnh cây gây ra những tổn thất to lớn cho sản xuất nông nghiệp. Chúng phá hủy đến 537,3 triệu tấn các loại nông sản chủ yếu, chiếm 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp trên thế giới. Trong các loại bệnh cây thì bệnh do nấm gây ra chiếm khoảng 83%, trong đó bệnh do nấm Fusarium và Rhizoctonia chiếm tỉ lệ tương đối lớn. Nấm bệnh Fusarium và Rhizoctonia gây bệnh trên nhiều loại cây rau quả và cây lương thực như lạc cà chua, khoai tây, cà phê, tiêu. Chúng có khả năng tồn tại trong đất trong một thời gian dài, phát sinh và gây hại ngay từ giai đoạn cây con và kéo dài cho tới khi thu hoạch nếu không áp dụng các biện pháp phòng trừ triệt để. Biện pháp phòng trừ các bệnh hại cây trồng phổ biến nhất cho đến nay vẫn là sử dụng các loại thuốc hóa học.mặc dù có ưu điểm là phổ tác dụng rộng, hiệu quả và tác dụng nhanh nhưng thuốc hóa học ngày càng bộc lộ rõ những nhược điểm như hiệu quả ngày càng kém và gây ra ô nhiễm môi trường. Chính vì thế việc sử dụng các chế phẩm sinh học để phòng trừ các bệnh cây trồng do vi sinh vật gây ra đang là xu hướng chủ yếu. Các chế phẩm này đang được sử dụng rộng rãi nhằm tạo ra một nền nông nghiệp hữu cơ an toàn và bền vững. Serratia là một giống trực khuẩn Gram âm, kị khí tùy nghi, họ Enterobacteriaceae.Chúng có khả năng sinh ra các chất có hoạt tính kháng nấm đã được sử trong kiểm soát nhiều bệnh hại cây trồng khác nhau.trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng Serratia để phòng trừ nấm để bảo vệ cây trồng, nhiều sản phẩm được sản xuất và thương mại hóa.tuy nhiên, kết quả đạt được trong nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm sinh học vẫn còn hạn chế. Chi phí thuốc bảo vệ thực vật trên thế giới chỉ chiếm 1,9% tổng giá trị của các loại thuốc bảo vệ thực vật. Vì vậy, việc tăng cường nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học diệt nấm là cần thiết. Xuất phát từ nhu cầu thực tế chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu và nâng cao khả năng sinh tổng hợp các chất có hoạt tính kháng nấm từ chủng Serratiamarcescens DT3 nhằm thực hiện các nội dung nghiên cứu: Trần Thị Thùy Linh 1 K22

1. Chọn lọc được môi trường nuôi cấy chủng Serratia marcescensdt3 có khả năng sinh tổng hợp các chất có hoạt tính kháng nấm cao nhất. 2. Tối ưu môi trường và các điều kiện nuôi cấy làm tăng khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất kháng nấm. 3. Tách chiết, tinh sạch hoạt chất có hoạt tính kháng nấm từ chủng Serratia marcescen DT3. Trần Thị Thùy Linh 2 K22

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn Serratia 1.1.1 Khái quát về chủng Serratia marcescens Serratia marcescens là một trong mười bốn loài đã được công nhận của chi Serratia. Serratia marcescens được phát hiện vào năm 1819 tại Ý. Các chủng vi khuẩn Serratia marcescens phân bố trong đất, nước, thực vật. Chúng phát triển ở nhiệt độ từ 5-40 0 C, ph từ 5-9. Chúng là tác nhân gây bệnh cho người và động vật tuy nhiên bên cạnh đó thì một số chủng Serratia marcescens lại được sử dụng trong các nghiên cứu về y học, quân sự, nông nghiệp [31]. Serratia marcescenslà các vi khuẩn hình que. Màng có cấu trúc đặc trưng của vi khuẩn Gram âm, di động sinh bào tử. có thành tế bào mỏng được cấu tạo từ một lớp peptidoglycan được bao bọc bởi một lớp màng bên ngoài. Các màng ngoài có lipopolysaccharides là một loại phospholipid đặc biệt gồm các axit béo được gắn vào một dimer phosphate glucosamine.một glucosamine gắn liền với một polysaccharides cốt lõi mà mở rộng đến các polysaccharides O. Các màng ngoài cũng là một phương tiện để điều tiết sự hấp thụ chất dinh dưỡng và loại trừ các độc tố. Chủng Serratia marcescen DT3 được phân lập từ mẫu đất ở Việt Nam. Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria. Bộ: Enterobacteriales. Họ: Enterobacteriaceae. Chi: Serratia. Loài: Serratia marcescens Hình 1.1 Hình ảnh chủng Serratia marcescens DT3 trên môi trường LB đặc Trần Thị Thùy Linh 3 K22

1.2 Bệnh cây trồng do nấm Fusarium và Rhizoctoniagây ra 1.2.1 Đặc điểm sinh học của nấm Fusarium và Rhizoctoniahại cây trồng Fusarium là một họ lớn của nấm sợi phân bố rộng rãi trong đất và gắn với thực vật. Hầu hết các loài đều sống kí sinh vô hại và là thành viên tương đối phong phú của cộng đồng vi sinh vật đất. Fusarium oxysporum là phân tán rộng nhất của các loài Fusarium được tìm thấy trên toàn thế giới.f. oxysporum không có giai đoạn sinh dục điển hình, nhưng sản xuất ba loại bào tử vô tính: bào tử nhỏ, bào tử đính lớn và bào tử hậu.bào tử nhỏ là các bào tử sản xuất nhiều nhất, nó có hình bầu dục, hình elip hoặc thận được định hình và sản xuất trên sợi nấm trên bề mặt.bào tử đính lớn, có 3-5 tế bào và nhọn hai đầu hoặc cạnh cong, được tìm thấy trên khối bào tử phân trên bề mặt của cây bị bệnh. Bào tử hậu được hình thành đơn lẻ hay theo cặp nhưng đôi khi được tìm thấy trong các cụm hoặc chuỗi ngắn. Nó là bào tử tròn có vách dày được sản xuất trên một sợi nấm hoặc trong bào tử đính lớn.bào tử hậu không giống như các bào tử khác có thể tồn tại trong đất một thời gian dài[4,19]. Hình 1.2 Hình thái nấm F. oxysporum trên đĩa thạch PDA Nấm F. oxysporum là một tác nhân gây bệnh đất rất phổ biến với lá cây mầm, làm chết và phân hủy chất hữu cơ trong cây.nó tồn tại trong đất như sợi nấm và các loại bào tử nhưng thường tồn tại trong đất như bào tử hậu. Lây lan mầm bệnh theo hai cách cơ bản lây lan khoảng cách ngắn qua bắn nước, bằng thiết bị trồng trọt và khoảng cách dài qua Trần Thị Thùy Linh 4 K22

KẾT LUẬN 1. Trong 4 môi trường đã khảo sát là môi trường NA, NYD, LB và môi trường bột đậu tương 2% chúng tôi đã chọn được môi trường LB để nuôi chủng S. marcescens DT3 cho hoạt tính kháng nấm mạnh. Dịch chiết ngoại bào ở nồng độ 50%, đã ức chế được 71%- 81% sự sinh trưởng và phát triển của chủng nấm F. oxyporum và R. solani. 2. Tối ưu môi trường và một số điều kiện nuôi cấy chủng S. marcescens DT3 cho hoạt tính kháng nấm cao nhất. Môi trườnglb sau tối ưu bao gồm: 1,25% pepton, 1% Nacl, 0,5% cao nấm men với thời gian nuôi cấy 28h, ph tối ưu 7, nhiệt độ 28 0 C.Hoạt tính kháng nấm ở môi trường tối ưu đã tăng so với môi trường trước tối ưu lên 15 lần đối với nấm R. solani và 2,6 lần đối với nấm F. oxyporum. 3. Đã tinh sạch được protein có hoạt tính kháng nấm với khối lượng phân tửkhoảng 56 kda từ chủng S. marcescens DT3. Proteinkhá bền với nhiệt độ khi được ủ ở các nhiệt độ80 0 C trong 30 phút vẫn không làm ảnh hưởng đến khả năng ức chế sinh trưởng và phát triển của nấm F. oxyporum và R. solani. Proteinase K không ảnh hưởng đến hoạt tính kháng nấm với nồng độ ủ từ 0,5-4 µg. Đặc biệt protein tinh sạch có khả năng kháng nấm F. oxyporum mạnh. KIẾN NGHỊ Hoàn thiện quy trình tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm ở quy mô lên men lớn ứng dụng tạo sản phẩm sinh học có khả năng kháng nấm phục vụ phát triển nông nghiệp bền vững. Trần Thị Thùy Linh 5 K22

Tài liệu tiếng Việt TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. A Cục Y Tê Dự Phòng Và Môi Trường - Bộ Y Tế (2009), Gần 5000 người nhiễm độc thuốc bảo vệ thực vật.. 2. A Đỗ Tấn Dũng (2006), Nghiên cứu bệnh lở cổ rễ ( Rhizoctonia solani Kuhn ) tại một số cây trồng vùng Hà Nội năm 2005-2006. 3. A Đỗ Thị Tuyên, Lê Đình Quyền, Quyền Đình Thi, and Nguyễn Ngọc Dũng (2011), Tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng Bacillus subtilis XL62, Tạp chí Công Nghệ Sinh Học, 3, pp. 1811-4989. 4. A Đoàn Thị Thanh (2005), Nghiên cứu đa dạng sinh học của các isolates nấm Fusarium spp, Tập san BVTV 1. 5. A Nguyễn Kim Vân (2003), Nghiên cứu các chủng nấm Rhizoctonia solani Kuhn gây hại bắp cải và bước đầu khảo sát biện pháp phòng trừ, Tạp chí BVTV, 192, pp. 18-21. 6. A Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Minh Anh, Phan Thị Hoài Anh, and Nguyễn Ngọc Dũng (2006), Nghiên cứu cơ chế kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh ở cây trồng của một số chủng vi khuẩn Pseudomonas huỳnh quang chọn lọc, Tc Sinh học, 28, pp. 77-81. 7. A Vũ Trọng Lượng, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Đỗ Thị Tuyên, and Nguyễn Thị Hồng Nhung (2015), Nghiên cứu tách chiết, tinh sạch và đánh giá hoạt tính của hoạt chất chống khuẩn và chống nấm Prodigiosin từ chủng Seratia marcescens M6, Y Học Việt Nam, 433, pp. 190-195. 8. Andrews, J.H. (1992), Biological control in the phyllosphere, Annual review of phytopathology, 30, pp. 603-635. 9. Babashpour, S., S. Aminzadeh, N. Farrokhi, A. Karkhane, and K. Haghbeen (2012), Characterization of a chitinase (Chit62) from Serratia marcescens B4A and its efficacy as a bioshield against plant fungal pathogens, Biochemical genetics, 50 (9-10), pp. 722-735. 10. Bach. E, Sant anna. V, Daroit. D, Corrêa. A P F, Segalin. J, and Brandelli. A (2012), Production, one-step purification, and characterization of a keratinolytic protease from Serratia marcescens P3, Process Biochemistry, 47 (12), pp. 2455-2462. 11. Bezuglova, O.S. and G.V. Motuzova (2007), Environmental Monitoring of Soil., Gaudeamus,Moscow. 12. Bradford, M.M. (1976), A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Analytical biochemistry, 72, pp. 248-254. 13. Ceresini, P. (2011), rhizoctonia solani. 14. Chitarra, G.S., P. Breeuwer, M.J. Nout, A.C. Van Aelst, F.M. Rombouts, and T. Abee (2003), An antifungal compound produced by Bacillus subtilis YM 10-20 Trần Thị Thùy Linh 6 K22

inhibits germination of Penicillium roqueforti conidiospores, Journal of applied microbiology, 94 (2), pp. 159-166. 15. David, P. and H. Kelsey (2007), Public Health and Costs of Pesticides, in Encyclopedia of Pest Management, Taylor & Francis, pp. 677-680. 16. Farr. Df, G.F.B., George P. Chamuris, and Amy Y. Rossmanrogerson, Clarkt and B. Boom (1990), Fungi on plants and plant products in the United States., Brittonia, 42 (3), pp. 243-246. 17. Gerhardson, B. (2002), Biological substitutes for pesticides, Trends in biotechnology, 20 (8), pp. 338-343. 18. Giri, A.V., N. Anandkumar, G. Muthukumaran, and G. Pennathur (2004), A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil, BMC microbiology, 4, pp. 11. 19. Gordon, T.R. and R.D. Martyn (1997), The evolutionary biology of Fusarium oxysporum, Annual review of phytopathology, 35, pp. 111-128. 20. Green, A.A. and W.L. Hughes (1955), Protein fractionation on the basis of solubility in aqueous solutions of salts and organic solvents, Methods Enzymol, 1, pp. 67-90. 21. Gutiérrez-Román. Mi, Holguín-Meléndez. F, Dunn. Mf, G.-N. K, and Huerta- Palacios. G (2015), Antifungal activity of Serratia marcescens CFFSUR-B2 purified chitinolytic enzymes and prodigiosin against Mycosphaerella fijiensis, causal agent of black Sigatoka in banana (Musa spp.), BioControl, 60 (4), pp. 565-572. 22. Huber, J., H. Bochow, and H. Junge (1987), Selektion und biotechnische Herstellung von Kulturlösungen mikrobieller Antagonisten zur Unterdrückung phytopathogener Bodenpilze, Journal of Basic Microbiology, 27 (9), pp. 497-503. 23. Jin-Lan Xia, Jing Xiong, Rui-Yong Zhang, Ke-Ke Liu, Bin Huang, and Z.-Y. Nie (2011), Production of Chitinase and its Optimization from a Novel Isolate Serratia marcescens XJ-01, Indian J Microbiol, 51 (3), pp. 301-306. 24. Kalbe, C., P. Marten, and G. Berg (1996), Strains of the genus Serratia as beneficial rhizobacteria of oilseed rape with antifungal properties, Microbiological Research, 151 (4), pp. 433-439. 25. Kamensky, M., M. Ovadis, I. Chet, and L. Chernin (2003), Soil-borne strain IC14 of Serratia plymuthica with multiple mechanisms of antifungal activity provides biocontrol of Botrytis cinerea and Sclerotinia sclerotiorum diseases, Soil Biology and Biochemistry, 35 (2), pp. 323-331. 26. Laemmli, U.K. (1970), Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227 (5259), pp. 680-685. 27. Li, J., Q. Yang, L.H. Zhao, S.M. Zhang, Y.X. Wang, and X.Y. Zhao (2009), Purification and characterization of a novel antifungal protein from Bacillus subtilis strain B29, J Zhejiang Univ Sci B, 10 (4), pp. 264-272. Trần Thị Thùy Linh 7 K22

28. Liu, X., M. Bimerew, et al. (2007), Quorum-sensing signaling is required for production of the antibiotic pyrrolnitrin in a rhizospheric biocontrol strain of Serratia plymuthica, FEMS microbiology letters, 270 (2), pp. 299-305. 29. Liu, X., J. Jia, et al. (2010), Biocontrol potential of an endophytic Serratia sp. G3 and its mode of action, World J Microbiol Biotechnol, 26 (8), pp. 1465-1471. 30. Liu, X., J. Jia, et al. (2011), Characterisation of two quorum sensing systems in the endophytic Serratia plymuthica strain G3: differential control of motility and biofilm formation according to life-style, BMC microbiology, 11 (1), pp. 26. 31. Mahlen. S. D (2011), Serratia infections: from military experiments to current practice, Clinical microbiology reviews, 24 (4), pp. 755-791. 32. Nalini. S and Parthasarathi. R (2014), Production and characterization of rhamnolipids produced by Serratia rubidaea SNAU02 under solid-state fermentation and its application as biocontrol agent, Bioresource technology, 173, pp. 231-238. 33. Okay, S., M. Özdal, and E.B. Kurbanoğlu (2013), Characterization, antifungal activity, and cell immobilization of a chitinase from Serratia marcescens MO-1, Turk J Biol, 37, pp. 639-644. 34. Parani, K., G.P. Shetty, and B.K. Saha (2011), Isolation of Serratia marcescens SR1 as a Source of Chitinase Having Potentiality of Using as a Biocontrol Agent, Indian J Microbiol, 51 (3), pp. 247-250. 35. Paul D and Sarma Y (2006), Antagonistic effects of metabolites of Pseudomonas fluorescens strains on the different growth phases of Phytophthora capsici, foot rot pathogen of black pepper (Piper nigrum L.), Arch Phytopathol Plant Protect, 39, pp. 311 314. 36. Pimentel, D., H. Acquay, et al. (1993), Assessment of Environmental and Economic Impacts of Pesticide Use, in The Pesticide Question, D. Pimentel and H. Lehman, Editors, Springer US, pp. 47-84. 37. Rattanachuay. P, Kantachote. D, T. M, Nitoda. T, and Kanzaki. H (2010), Inhibition of shrimp pathogenic vibrios by extracellular compounds from a proteolytic bacterium Pseudomonas sp. W3, Electronic Journal of Biotechnology, 13. 38. Shokouhfard, M., R.K. Kermanshahi, R.V. Shahandashti, M.M. Feizabadi, and S. Teimourian (2015), The inhibitory effect of a Lactobacillus acidophilus derived biosurfactant on biofilm producer Serratia marcescens, Iranian journal of basic medical sciences, 18 (10), pp. 1001-1007. 39. Someya, N., M. Nakajima, K. Hirayae, T. Hibi, and K. Akutsu (2001), Synergistic Antifungal Activity of Chitinolytic Enzymes and Prodigiosin Produced by Biocontrol Bacterium, Serratia marcescens Strain B2 against Gray Mold Pathogen, Botrytis cinerea, J Gen Plant Pathol, 67 (4), pp. 312-317. 40. Stuart, S. (2003), Development of Resistance in Pest Population. Trần Thị Thùy Linh 8 K22

41. Tariq. Al, Reyaz. Al, and Prabakaran. J John (2011), Purification and characterization of 56 kda cold-active protease from Serratia marcescens, Afr. J. Microbiol. Res, 5, pp. 5841-5847. 42. Wan, M.H., B. Wu, W. Ren, and B. He (2010), Screening, characterization, and cloning of a solvent-tolerant protease from Serratia marcescens MH6, Journal of microbiology and biotechnology, 20 (5), pp. 881-888. 43. Wang, K., P.-S. Yan, L.-X. Cao, Q.-L. Ding, C. Shao, and T.-F. Zhao (2013), Potential of chitinolytic Serratia marcescens strain JPP1 for biological control of Aspergillus parasiticus and aflatoxin, BioMed research international, 2013. 44. Zarei. M, Aminzadeh. S, et al. (2011), Characterization of a chitinase with antifungal activity from a native Serratia marcescens B4A, Brazilian journal of microbiology : [publication of the Brazilian Society for Microbiology], 42 (3), pp. 1017-1029. 45. Zeng, H.-W., Y.-J. Cai, X.-R. Liao, S.-L. Qian, F. Zhang, and D.-B. Zhang (2010), Optimization of catalase production and purification and characterization of a novel cold-adapted Cat-2 from mesophilic bacterium Serratia marcescens SYBC- 01, Ann Microbiol, 60 (4), pp. 701-708. 46. Zhou. P, Zhao. Y, et al. (2012), Dietary exposure to persistent organochlorine pesticides in 2007 Chinese total diet study, Environment international, 42, pp. 152-159. Trần Thị Thùy Linh 9 K22