NAUJAUSI PASIEKIMAI BALTYMŲ BIOSINTEZĖS SRITYJE

KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS MEDICINOS FAKULTETAS BIOCHEMIJOS KATEDRA NAUJAUSI PASIEKIMAI BALTYMŲ BIOSINTEZĖS SRITYJE Mokslinė studija Kaunas, 2007

TURINYS 1. PROGRAMOS APRAŠYMAS. 2. STUDIJŲ DALYKO BALTYMŲ BIOSINTEZĖ PASKAITŲ KONSPEKTAI: 2. 1. Transliacijos proceso bendra charakteristika. Baltymų biosintezės stadijos. 2. 2. Ribosomos, jų sandara, funkcijos vietos. 2. 3. Transliacijos iniciacija. 2. 4. Polipeptidinių grandinių elongacija. Transliacijos terminacija. 2. 5. Baltymo biosintezės inhibitoriai. Antibiotikų poveikio baltymų sintezei mechanizmai. 3. TEORINĖ-PRAKTINĖ DALIS: 3. 1. Laboratorinių darbų aprašas: 3. 1. 1. Suminių transportinės RNR ir aminoacil-trnr sintetazių preparatų išskyrimas iš pelių kepenų ir jų aktyvumo nustatymas. 3. 1. 2. Transliacijos greičio ir lygio nustatymas. neląstelinėje baltymus sintezuojančioje sistemoje iš pelių kepenų. 3. 1. 3. Baltymų analizė gel-filtracijos, elektroforezės poliakrilamidiniame gelyje denatūruojančiomis sąlygomis ir imunoblotingo metodais. 3. 2. Studijų dalyko Baltymų biosintezė seminarų temų konspektai: 3. 2. 1. Genetinio kodo bendros savybės ir iššifravimas. 3. 2. 2. Informacinės RNR (mrnr) savybės ir brendimas. 3. 2. 3. trnr struktūra. Aminoacil-tRNR sintetazės. Aminorūgščių liekanų akceptavimas (prijungimas) prie trnr. 3. 2. 4. Potransliacinis baltymų paskirstymas ir modifikavimas. 4. METODINIS DALYKO PROGRAMOS APRŪPINIMAS. 4. 1. Studijoms rekomenduojama pagrindinė literatūra. 4. 2. Savarankiškam darbui rekomenduojama papildoma literatūra.

Biomedicinos mokslų srities medicinos krypties Baltymų biosintezės dalyko studijų programa Medicinos fakulteto II kurso studentams Modulis (dalykas) MF/BCM/M-VO1 Biochemija Studijų programa Medicina Dėsto padalinys Biochemijos katedra Studijų dalyko programos poreikis: Aukštos kvalifikacijos medikai ir biologai turi išmanyti genų raiškos molekulinius mechanizmus, suprasti kaip įvairūs veiksniai gali paveikti svarbiausią genetinės informacijos realizavimo etapą ląstelėje baltymų sintezės procesą ir kokios gali būti tų pokyčių pasekmės organizmo funkcionavimui. Jie taip pat turi suprasti biocheminės, molekulinės biologijos, biotechnologijos, medicininės genetikos, genų terapijos ir kitas taikomojo pobūdţio problemas. Studijų tikslai: Išnagrinėti gyvybiškai svarbaus proceso baltymų biosintezės funkcionavimo ypatumus tiek ţmogaus ir gyvūnų, tiek ir bakterijų ląstelėse bei supaţindinti su šio proceso reguliavimo būdais. Studijų rezultatai: Įgytos žinios/mokėjimai/įgūdžiai Programos tikslas yra suteikti medicinos krypties studentams ţinias apie genų raiškos molekulinius mechanizmus, supratimą kaip įvairūs veiksniai gali paveikti svarbiausią genetinės informacijos realizavimo etapą ląstelėje baltymų sintezės procesą ir kokios gali būti tų pokyčių pasekmės organizmo funkcionavimui. Jie taip pat turi suprasti biocheminės, molekulinės biologijos, biotechnologijos, medicininės genetikos, genų terapijos ir kitas taikomojo pobūdţio problemas. Įgyti gebėjimai Studentai įsisavins molekulinės biologijos tyrimo metodus ir, panaudojant gautas teorines ţinias, sugebės juos pritaikyti ląstelių transliacijos sistemos tyrimuose. Studijų apimtis: Bendras akademinių valandų ir kreditų skaičius: 80 valandų 2 KMU kreditai Auditorinių valandų skaičius: 40 val. Akademinių valandų paskirstymas: Paskaitos Laboratoriniai darbai Seminarai Savarankiškas darbas 10 val. 18 val. 12 val. 40 val.

Studijų turinys: Programoje aprašyti baltymų biosintezės aparato pagrindiniai komponentai, sudėtingo daugiastadijinio baltymų biosintezės proceso molekulinis mechanizmas, šio proceso specifiniai ypatumai prokariotams ir eukariotams, antibiotikų ir toksinų veikimai. Išanalizuoti transliacijos mechanizmai ląstelėse normoje ir fagų bei virusų įtakoje. Aprašyti klasikiniai baltymus sintezuojančios sistemos tyrimo eksperimentai. Studijų metodai: paskaitos (10 val.), laboratoriniai darbai (18 val.), seminarai (12 val.), studentų savarankiškas darbas (40 val.). Paskaitos (10 val.) Eil. Nr. Paskaitos pavadinimas Trukmė 1. Pagrindinė molekulinės biologijos dogma. 2 val. DNR ir jos reikšmė baltymų sintezės procesui. Transliacijos proceso bendra charakteristika. Baltymų biosintezės stadijos. Baltymų biosintezės svarbiausi komponentai. 2. Ribosomos, jų sandara, funkcijos vietos. 2 val. 3. Transliacijos iniciacija. 2 val. 4. Polipeptidinių grandinių elongacija. Transliacijos terminacija. 2 val. 5. Baltymo biosintezės inhibitoriai. Antibiotikų poveikio baltymų sintezei mechanizmai. 2 val. Laboratoriniai darbai (18 val.) TEORINĖ-PRAKTINĖ DALIS Eil. Laboratorinio darbo pavadinimas Nr. 1. Suminių transportinės RNR ir aminoacil-trnr sintetazių preparatų išskyrimas iš pelių kepenų ir jų aktyvumo nustatymas. 2. Transliacijos greičio ir lygio nustatymas neląstelinėje baltymus sintezuojančioje sistemoje iš pelių kepenų. 3. Baltymų analizė gel-filtracijos, elektroforezės poliakrilamidiniame gelyje denatūruojančiomis sąlygomis ir imunoblotingo metodais. Trukmė 6 val. 6 val. 6 val. Seminarai (12 val.) Eil. Nr. Seminaro temos pavadinimas Trukmė 1. Genetinio kodo bendros savybės ir iššifravimas. 3 val. 2. Informacinės RNR (mrnr) savybės ir brendimas. 3 val. 3. trnr struktūra. Aminoacil-tRNR sintetazės. 3 val. Aminorūgščių liekanų akceptavimas (prijungimas) prie trnr. 4. Potransliacinis baltymų paskirstymas ir modifikavimas. 3 val.

SAVARANKIŠKAS DARBAS Ruošdamiesi seminarams ir egzaminui studentai individualiai studijuoja nurodytą literatūrą, originalius mokslinius straipsnius pagal nurodytas temas bei savarankiškai vykdo naujos literatūros paiešką duomenų bazėse. Studentų savarankiško darbo temos: 1. Baltymų biosintezės (transliacijos) ir ribosomų tyrimų istorija. 2. Bakterijų ir augalų toksinų poveikis baltymų biosintezei. 3. Eukariotų baltymų biosintezės potranskripcinė reguliacija. 4. Baltymai pagrindinė organizmų struktūrinė ir funkcinė medţiaga. 5. Struktūriniai ribosomų pokyčiai. 6. Ribosomos ir augančio peptido sąveika su membrana. 7. Transliacijos tikslumas. Baltymų sintezės tikslumą apsprendţiantys faktoriai. 8. Baltymų biosintezės eukariotuose ir prokariotuose ypatybės. Baltymų degradavimas ląstelėje. Baltymų degradavimo eukariotuose ir prokariotuose ypatybės. 9. Biologiškai neaktyvios trnr molekulės, jų vaidmuo transliacijos reguliacijoje. 10. Eukariotų transliacijos aparato baltymų kompartmentalizacija poliribosomose. 11. Baltymų irimas ląstelėje. Programą parengė: Dr. Ilona Sadauskienė, KMU Biochemijos katedros lektorė, darbo telefonas: 302967, vietinis 1345, elektroninio pašto adresas: ilona_sad@med.kmu.lt Studijų dalyko programos sandara Studijų kursą sudaro: paskaitos (12,5 proc.), laboratoriniai darbai (22,5 proc.), seminarai (15 proc.) ir savarankiškas darbas (50 proc.). Įvertinimas Suminis balas. 100 proc. balo sudaro: 40 proc. auditorinio darbo + 20 proc. savarankiško darbo + 40 proc. baigiamojo teorinio ir praktinio patikrinimo.

Studijų dalyko Baltymų biosintezė paskaitų konspektai 1 paskaita Transliacijos proceso bendra charakteristika. Baltymų biosintezės stadijos (2 val.) Genų raiška, kurios dalis yra ir baltymų sintezė tai sudėtingų biocheminių procesų visuma. Šiuose procesuose dalyvauja apie 300 biomolekulių. Kiekvienos iš šių molekulių aktyvumo pakitimas gali vienaip ar kitaip pakeisti genetinės informacijos, uţkoduotos ląstelės DNR, perdavimo tikslumą ir greitį. lemia visus ląstelės funkcijų aspektus, kontroliuoja visas ląstelę sudarančias molekules. Todėl baltymų sintezėje dalyvaujančių makromolekulių pakitimai gali atsispindėti ir atskirų organų funkcijoje, o tuo pačiu paveikti viso organizmo gyvybinius procesus. Pagrindinė molekulinės biologijos dogma (1 pav.) teigia, kad aminorūgščių seką polipeptidinėje grandinėje lemia informacinės RNR (mrnr) struktūra, o šios molekulės struktūrą koduoja universali genetinė medţiaga. Eukariotinėse ląstelėse tai deoksiribonukleorūgštis (DNR). Baltymų sintezė vykdoma transliacijos (angl. translation vertimas) metu tai procesas, kai DNR ir atitinkamos mrnr bazių seka pervedama į aminorūgščių, sujungtų į polipeptidinę grandinę ir sudarančių pirminę baltymo struktūrą, seką. Pirminė baltymų seka savo ruoţtu apsprendţia antrinę, tretinę struktūras ir galiausiai baltymų funkciją. Baltymų sintezė (kaip DNR bei RNR) apima tris stadijas: iniciaciją, elongaciją ir terminaciją. Kiekvienai aminorūgščiai specifinis fermentas aminoacil-trnr sintetazė aktyvina aminorūgštį, prijungdamas ją prie atitinkamos trnr molekulės. Kai kuriais atvejais vieną aminorūgštį atitinka keletas trnr ir fermentų. Polipeptidinė grandinė ilgėja ant polisominės surinkimo linijos nuo amino link karboksilinės grupės (NH + 3 COO ). Baltymai, pasiţymintys ypatingai plačiu biologinių funkcijų spektru, iš esmės sąlygoja visus ląstelės medţiagų apykaitos ir struktūros bruoţus. Šia prasme per baltymų sintezę DNR Skiriamos 3 baltymų biosintezės stadijos: 1. Iniciacija. Iniciacijos metu iniciacinė trnr prisijungia prie mrnr starto signalo ir uţima ribosomos P (angl. peptidyl) vietą. 2. Elongacija. Elongacija prasideda aminoacil-trnr (aa-trnr) prisijungimu prie A (angl. aminoacyl) vietos ribosomoje. Peptidinis ryšys susidaro tarp naujos ateinančios aa-trnr - NH 2 grupės ir formilmetionino -COOH grupės (fmet atneša iniciacinė trnr). Gautas dipeptidil-trnr pasislenka iš A į P vietą, o iniciacinė trnr prieš palikdama ribosomą juda į

E (angl. exit) vietą. Šiems procesams energiją teikia GTP. Prie atsilaisvinusios A vietos prisijungia nauja aa-trnr molekulė ir vyksta sekantis elongacijos etapas. 1 pav. Pagrindinės molekulinės biologijos dogmos schema. 3. Terminacija. Terminacija vyksta pasiekus ant mrnr esantį terminacijos signalą, kurį atpaţįsta atpalaidavimo (angl. release) faktoriai, atpalaiduojantys polipeptidą. Baltymų biosintezės svarbiausi komponentai. Ribosomos. Tai makromolekuliniai kompleksai, koordinuojantys trnr, mrnr ir baltymų tarpusavio sąveiką bei katalizuojantys nuo mrnr priklausomą peptidinių ryšių susidarymą. Ribosomos sudarytos iš maţojo ir didţiojo subvienetų. Vadinamos ribosomomis, nes apie 2/3 jų masės sudaro rrnr molekulės, vaidinančios labai svarbų vaidmenį transliacijos procese. Bakterijų ląstelėse yra apie 20 000 ribosomų, sudarančių apie 20 proc. sausos ląstelės masės, o rrnr ir jų baltymus koduoja apie 5 proc. E. coli genomo.

Ribosoma disocijuoja į didįjį (50S) ir maţąjį (30S) subvienetus. Visos rrnr įgauna būdingą struktūrą, kurią suformuoja trumpos susiporavusios sritys. Įrodyta, kad baltymų sintezėje svarbiausią vaidmenį atlieka rrnr. Ribosomų struktūros palaikymui labai svarbūs Mg 2+ maţinant jo koncentraciją iš pradţių vienas po kito atsiskiria abu subvienetai, o paskui pradeda disocijuoti ir patys subvienetai. trnr. Dar Francis Crick numatė, kad turi būti adaptorinės molekulės, kurios būtų lyg tiltas tarp mrnr, kuriose yra informacija apie būsimo baltymo struktūrą, ir aminorūgščių. Ta adaptorinė molekulė pasirodė besanti trnr, atpaţįstanti: a) fermentą, prijungiantį teisingą aminorūgštį ir b) mrnr antikodoną. Visos šiuo metu ţinomos trnr yra sudarytos iš vienos 73-95 nukleotidų ilgio grandinės, jos turi daug neįprastų, daugiausiai metilintų bazių. Subrendusios trnr 3' galo nukleotidų seka yra CCA, prie kurios jungiasi aktyvinta aminorūgštis (prie galinio adenino 3'-OH). Be to, apie pusė trnr nukleotidų susiporuoja ir sudaro dvigubas spirales. Aminoacil trnr sintetazės ARSazės. Peptidinio ryšio susidarymas tarp vienos aminorūgšties NH 2 galo ir kitos aminorūgšties COOH galo yra termodinamiškai nepalankus. Šis barjeras įveikiamas aktyvinant aminorūgšties COOH grupę. Baltymų biosintezės aktyvinti tarpininkai yra aminorūgščių esteriai, kuriuose aminorūgščių karboksi grupė sujungta su trnr 3' galu. Toks trnr aminorūgšties esteris vadinamas aminoaci-trnr (aa-trnr), kartais pakrauta trnr. Pačios aminorūgštys negali atpaţinti mrnr kodonų, todėl būtinos trnr, atpaţįstančios mrnr kodonus ir nešančios į ribosomą reikalingą aminorūgštį adaptorinė trnr funkcija. Aminorūgštis aktyvina ir prie trnr prijungia fermentai ARS-azės: Aminorūgštys + ATP + trnr +H 2 O aminoacil-trnr + AMP + 2P n Kiekvienai aminorūgščiai egzistuoja maţiausiai viena ARS-azė ir viena trnr. ARSazės yra labai specifiški fermentai ir labai tikslūs atpaţindami tiek aminorūgštis, tiek trnr. Šie fermentai pasiţymi savęs pasitikrinimo (angl. proofreading) savybe. Svyravimo hipotezė. Svyravimo hipotezė (nevienareikšmio atitikimo, angl. wobble) paaiškina, pirmiausia, kodėl viena trnr gali atpaţinti keletą kodonų ir, antra, kadėl dauguma kodonų gali būti atpaţinti keletu trnr molekulių rūšių. Tačiau reikia paţymėti, kad kiekviena trnr gali nešti tik vienos rūšies aminorūgštį. Tai įmanoma tik todėl, kad ribojimai, kurie yra dėl bazių poravimo pagal Kriko-Votsono taisyklę nesiderina su 3 (skaičiuojant 5 / 3 / kryptimi) kodono bazės mrnr ir 1 (5 / 3 / kryptimi) bazės trnr antikodono poravimuisi. Tai priverčia nukleotidus tiesiog suptis, keičia sąveikos kodonas-antikodonas geometriją ir leidţia

susidaryti G-U poroms. Kai kurių rūšių trnr esantys modifikuoti nukleotidai pirmoje antikodono padėtyje ar netoli jos taip pat gali sukelti svyravimą ir dėlto sumaţinti apribojimus poruojantis kodonui su antikodonu. Svarbus modifikuotas nukleotidas pagal svyravimo hipotezę yra inozino rūgštis, kuri gali sudaryti poras su A, C ir U, kurie yra 3 mrnr kodono padėtyje. Ribojimų sumaţinimas porų susidarymui svyravimo procese teoriškai reiškia, kad daugybė skirtingų kodonų gali būti atpaţinti santykinai nedideliu kiekiu trnr antikodonų. Tačiau gamtoje ši galimybė praktiškai neišnaudojama ir dauguma ląstelių turi maţdaug tiek trnr rūšių, kiek egzistuoja aminorūgščių. 2 paskaita Ribosomos, jų sandara, funkcijos vietos (2 val.) Baltymų sintezė vyksta ribonukleoproteininėse dalelėse ribosomose. Ribosoma tai kompleksas, sudarytas iš dviejų tarpusavyje surištų pagrindinių subvienetų. Šis kompleksas koordinuoja baltymų surinkimą. Ribosoma Bakterijų ribosomos. Gerai ištirtos bakterijų (pvz. E. coli) ribosomos yra netaisyklingos formos nukleoproteininės dalelės, kurių sedimentacijos konstanta yra 70S, diametras apie 20 nm ir molekulinė masė apie 2700 kda. Eksperimentinėmis sąlygomis ribosomą galima padalinti į didesnį 50S subvienetą ir maţesnį 30S subvienetą, o toliau kiekvieną jų į juos sudarančius baltymus ir rrnr (2 pav.). Ribosomos struktūra ir funkcijos priklauso nuo susisukimo ir sąveikos su baltymais ją sudarančių rrnr molekulių. Kiekviena bakterijų ląstelė turi maţdaug 20000 ribosomų, kurios sudaro apie 25 proc. ląstelės masės. Elektroninė mikroskopija leidţia pamatyti laisvas ribosomas citoplazmoje Eukariotų ribosomos. Nors ribosomų struktūra bei funkcijos ţinduolių ir E. coli ląstelėse panašios, egzistuoja atitinkami skirtumai jų sudaryme. Ţinduolių ribosomos sedimentacijos konstanta 80S, molekulinė masė 4200 kda ir jos disocijuoja į du subvienetus 60S bei 40S. 40S subvienetas turi 18S rrnr ir apie 30 su ja surištų baltymų. 60S subvienetas sudarytas iš 5S, 5,8S ir 28S rrnr ir apie 45 su juo susijusių baltymų. Elektroninis mikroskopas leidţia pamatyti tiek laisvas ribosomas, tiek su endoplazminiu tinklu tvirtai surištas ribosomas. Paprastai laisvos ribosomos sintezuoja baltymus, kurie skirti naudojimui citoplazmoje, o su endoplazminio tinklo membrana surištos ribosomos sintezuoja baltymus, kurie eksportuojami iš ląstelės arba įeina į membranos sudėtį.

Prokariotų 70S ribosoma 23S ir 5S rrnr 16S rrnr Eukariotų 80S ribosoma 28S, 5,8S ir 5S rrnr 18S rrnr 2 pav. Prokatiotų ir eukariotų ribosomų erdvinė struktūra Transliacija Baltymų sintezės procese prie mrnr molekulės vienu metu gali prisijungti keletas ribosomų, kurios sudaro poliribosomą arba kitaip vadinamą polisomą (3 pav.). Iniciacija Elongacija Terminacija Ribosomos judėjimo kryptys 3 pav. Bendra transliacijos proceso schema Blogiausiu atveju viena ribosoma tenka kiekvieniems 8 mrnr molekulės nukleotidams. Atskiros ribosomos, įeinančios į polisomos sudėtį, funkcionuoja nepriklausomai viena nuo kitos, kiekviena jų formuodama pilną polipeptidinę grandinę. Polipeptidinė grandinė

sintezuojama NH 3 COOH kryptimi, o mrnr nuskaitoma nuo 5 / į 3 / galą. Eukariotų baltymų sintezė vyksta citoplazmoje, kur ir pernešama mrnr iš branduolio. Prokariotų (pvz., E. coli) mrnr molekulės transliacija gali prasidėti anksčiau, nei pilnai pasibaigs transkripcija. Lentelė. Prokariotų ir eukariotų baltymų sintezė (reziume) Savybė Prokariotai Eukariotai Didysis ribosomos subvienetas 50S 60S Maţasis ribosomos subvienetas 30S 40S Ribosoma 70S 80S Didţiojo subvieneto rrnr 5S, 23S 5S, 5,8S, 28S Maţojo subvieneto rrnr 16S 18S Baltymų skaičius didţiajame subvienete 34 50 Baltymų skaičius maţajame subvienete 21 34 Iniciacijos faktoriai IF1, IF2, IF3 eif2, eif3, eif4a, eif4b, eif4c, eif5, eif6, cap surišantis baltymas Iniciacinė aminoacil-trnr fmet-trnr Met-tRNR Turtinga purinai priešstartinė seka Šaino-Delgarno seka Nėra Elongacijos faktoriai EF-G (translokazė) EF1, EF2 (translokazė) Atpalaidavimo faktoriai RF1, RF2, RF3 RF 3 paskaita Transliacijos iniciacija (2 val.) Transliacijos iniciacija prokariotuose. Prokariotinėje ląstelėje baltymų sintezė prasideda citozolyje nuo iniciacinės trnr molekulės, nešančios metionino (Met) aminorūgštį, prisijungimo prie maţojo ribosomos subvieneto (4 pav.). Iniciacinė trnr suriša Met reakcijoje, kurią katalizuoja atitinkama aminoacil-trnr sintetazė, o su trnr surištas Met yra formilinamas transformilazės (formilas skruzdţių rūgšties liekana, HCOOH). Iniciacinė trnr ţymima kaip trnr f. Su trnr surištas Met paprastai netampa polipeptidinės grandinės dalimi baltymų sintezės pabaigoje jis yra pašalinamas. Su iniciacine trnr surištas Met paprastai formilinamas. Tačiau Met, surištas su ta trnr rūšimi, kuri neša Met, skirtą įjungti į baltymo molekulę, nėra formilinamas. Šiuo atveju atitinkamą trnr ţymime kaip trnr Met arba trnr m. Laisvas maţasis 30S subvienetas suriša 3 iniciacijos faktorius (IF): IF1, IF2 ir IF3. IF2 suriša GTP, o taip pat paţįsta kompleksą Met-tRNR f. Be to, reakcija tarp IF2 ir GTP leidţia

Šaino-Dalgarno seka Prokariotų mrnr 16S RNR Eukariotų mrnr 40S subvienetas Ribosomų skenavimas 4 pav. Transliacijos iniciacijos schema mrnr molekulei prisijungti prie 30S subvieneto. Kai tik susiformuoja kompleksas 30S-mettRNR f, IF3 išlaisvinamas. Prie komplekso prisijungus didţiajam 50S subvienetui, vyksta GTP hidrolizė, po to atpalaiduojami IF1 ir IF2. Tuo metu formuojasi du surišimo centrai: P-centras (peptidinis, angl. peptidyl) ir A-centras (aminoacilinis, angl. aminoacyl). Baltymų sintezės eleongacijos stadijos pradţioje Met-tRNR f molekulė yra ribosomos P-centre, o A-centras laisvas. Susidaręs 70S kompleksas vadinamas iniciacijos kompleksu. Šaino-Dalgarno seka. Met trnr f molekulės antikodonas UAC, sugebantis nekovalentiškai sąveikauti su iniciacijos kodonu AUG ant mrnr molekulės. AUG koduoja Met. E.coli iniciacijos sritis išsidėsčiusi virš start-kodono AUG purininėmis bazėmis turtingoje srityje. Šią sritį vadina Šaino-Dalgarno seka (pvz., E. coli lacl ši seka susideda iš 5 / -AGGAGG-3 / ). Ši seka poruojasi su komplementaria sritimi, išsidėsčiusia 30S subvieneto 16S rrnr 3 / gale. Taigi, baltymo sintezė prasideda ten, kur antikodonas trnr f susiriša su iniciacijos kodonu AUG, o mrnr susiporuoja su komplementaria seka ant 16S rrnr molekulės 3 / galo. Transliacijos iniciacija eukariotuose. Transliacijos iniciacijos mechanizmas eukariotų ląstelėse yra toks pat kaip ir prokariotų, tačiau turi ir skirtumų: 1. Iniciacijos trnr neša Met, o ne formilmetioniną (fmet). Ji ţymima kaip trnr i. 2. Egzistuoja ţymiai daugiau iniciacijos faktorių IF (šiandien jų ţinoma 9 ir, be abejo, bus nustatyta daugiau): a) eif2 suriša GTP ir dalyvauja surišant trnr su 40S kompleksu;

b) cap -surišantys baltymai sąveikauja su 5 / -kepurėle mrnr, o eif3 susiriša su arčiausiai prie cap esančiu start-kodonu AUG dėka ATP energijos, aprūpinamos eif4; c) Met-tRNR i susiriša su start-kodonu AUG, o eif5 verčia eif hidrolizuoti GTP, o tai atpalaiduoja eif2 ir eif3 iš iniciacijos komplekso; d) vyksta 60S subvieneto prijungimas bei pilno iniciacijos komplekso formavimasis. Eukariotai turi tik vieną start-kodoną AUG ir neturi purinais turtingos Šaino-Dalgarno sekos. 40S kompleksas susiriša su 5 / mrnr galu ir, panaudodamas ATP energiją, juda 3 / galo kryptimi iki start-signalo AUG. 4 paskaita Polipeptidinių grandinių elongacija. Transliacijos terminacija (2 val.) Po baltymų sintezės iniciacijos vyksta eleongacijos procesas, o po to, kai pasiekiamas atitinkamas kodonas terminacija. Peptidas palieka ribosomą ir gali būti keičiamas dėl potransliacinėss modifikacijos. Baltymo modifikacijos pobūdis priklauso nuo to, ar jis skirtas kitoms ląstelės organelėms (mitochondrijoms, branduoliui ar lizosomoms), ar struktūriniams vienetams (ląstelės membranos). Modifikuojami gali būti ir baltymai, eksportuojami iš ląstelės. Potransliacinių modifikacijų klaidos kartais sukelia įvairius susirgimus. Elongacija. Po pirmo metionino sekanti aminorūgštis (komplekse su trnr) prisijungia prie ribosomos A centro dėka elongacijos faktoriaus. Labai svarbu, kad į A centrą patektų teisinga aminoacil-trnr, todėl kad ląstelė negali nustatyti neteisingos aminorūgšties po jos įsijungimo į grandinę. Prokariotuose patikrinimą atlieka elongacijos faktorius EF-TU. EF- TU suriša GTP, po to jis geba susirišti su aminoacil-trnr ir uţtikrina sąveiką su A centru. Aminorūgštis negali būti įjungta į augančią grandinę anksčiau, nei EF-TU paliks kompleksą, o pastarasis negali atsilaisvinti, kol neįvyks GTP hidrolizė iki GDP. Taigi, neteisinga aminoacil-trnr turi laiko išeiti iš komplekso kol vyksta GTP hidrolizė ir EF-TU atsiskyrimas. Eukariotuose elongaciją tikrinančiu faktoriumi yra EF1, kurio EF1 subdalelė sudaro kompleksą su aminoacil-trnr. Elongacijos procesą (5 pav.) sudaro dvi pagrindinės stadijos: peptidinės jungties susidarymas ir translokacija. Peptidinės jungties susidarymo reakciją katalizuoja peptidiltransferazė. Ji prijungia aminoacil-trnr, esančios P centre, karbonilinį atomą prie aminoacil-trnr, esančios A centre, -aminogrupės. Po to A centras turi būti išlaisvintas

sekančiai aminoacil-trnr, todėl nuskaitymo rėmelis pasislenka išilgai mrnr per 3 bazes ir A centre atsiranda sekantis kodonas. Pasislinkimą uţtikrina kitas elongacijos faktorius translokazė, energijos šaltiniu naudojanti GTP hidrolizę. Prokariotams šis faktorius EF-G, eukariotams EF2. Šio proceso metu aminorūgštį praradusi trnr-oh pastumiama į taip vadinamą ribosomos išėjimo sritį, iš kur ji išlaisvinama atgal į citoplazmą. Eukariotuose buvo nustatyta eilė kitų elongacijos faktorių, bet tikslus jų vaidmuo neaiškus. 5 pav. Transliacijos elongacijos schema Terminacija. Kai tik pasiekiamas terminacijos kodonas arba stop kodonas, A centras daugiau nesuriša aminoacil-trnr (6 pav.). Vietoje jo prie kodono prijungiamas išlaisvinimo faktoriaus ir GTP kompleksas (RF-GTP). Tada peptidiltransferazė atlieka hidrolazės vaidmenį ir prijungia vandens molekulę prie peptidinės grandinės karbonilinio galo. RF hidrolizuoja GTP iki GDP ir pakeičia konformaciją. Šie pokyčiai aprūpina energija elongacijos komplekso disociaciją į mrnr, polipeptidinę grandinę ir ribosomų subvienetus. Prokariotams aprašyti 3 išlaisvinimo faktoriai: RF1, RF2 ir RF3. Du pirmieji atpaţįsta skirtingus stop-kodonus, o RF3 potencijuoja RF1 ir RF2 veikimą.

6 pav. Transliacijos terminacijos schema 5 paskaita Baltymų biosintezės inhibitoriai. Antibiotikų poveikio baltymų sintezei mechanizmai (2 val.) Baltymų biosintezės inhibitoriai. Baltymų biosintezę inhibuoja antibiotikai ir tam tikri toksinai. Antibiotikai tai medţiagos, neleidţiančios mikroorganizmams augti arba daugintis. Todėl jie vartojami uţkrečiamosioms ligoms gydyti. Antibiotikus gamina mikroorganizmai, pelėsiai arba grybai. Tačiau antibiotikai

veikia pagrindinius, gyvybiškai svarbius molekulinius ląstelės mechanizmus, svarbius ne tik mikrobo, bet kartais ir ligonio gyvybinėms funkcijoms. Daugeliui antibiotikų būdingos antikancerogeninės savybės, nes jie ypač veiksmingai veikia greitai besidalijančias ląsteles bakterijas, vėţines ląsteles, ląsteles kraujo kūnelių pirmtakus (tuo aiškinamas tam tikrų antibiotikų poveikis kraujo gamybai). Antibiotikai daţnai sėkmingai vartojami tiriant biocheminius procesus, nes jie inhibuoja tik tam tikrus molekulinius mechanizmus. Puromicinas. Tai vienas iš geriausiai ištirtų antibiotikų bakterijų baltymų biosintezės inhibitorių. Jį išskiria Streptomyces alboniger. Puromicinas yra panašus į aminoacil-trnr akceptorinio stiebo 3' galą. Todėl jis gali prisijungti ribosomos A centre (50S didţiajame subvienete) ir sudaryti peptidinį ryšį peptidil-puromiciną. Tačiau puromicinas neturi aminoacilo grupės (karboksigrupės), todėl augančią polipeptidinę grandinę pernešus ant šio antibiotiko, tolesnis polipeptidinės grandinės ilgėjimas tampa neįmanomas. Kai turėtų įvykti peptido translokacija į P centrą, peptidil-puromicinas disocijuoja iš ribosomos, ir įvyksta priešlaikinė polipeptidinės grandinės terminacįja. Taip inhibuojama bakterijų baltymo biosintezė. Tetraciklinas slopina baltymų biosintezę bakterijose, prisijungdamas ribosomos 30S subvieneto A centre. Jis inhibuoja aminoacil-trnr prisijungimą prie ribosomos 30S subvieneto. Yra plataus spektro antibiotikas. Chloramfenikolis (levomicetinas) jungiasi prie ribosomos 50S subvieneto; slopina baltymo biosintezę bakterijose, mitochondrijose ir chloroplastuose, inhibuodamas peptidiltransferazę, t.y. peptidilo pernašą ir peptidinio ryšio susidarymą (eukariotų baltymų sintezės neveikia). Atvirkščiai, cikloheksimidas slopina eukariotų 80S ribosomos peptidiltransferazę ir, susijungdamas su ribosomos didţiuoju subvienetu, inhibuoja translokaciją. Tačiau jis neveikia bakterijų, mitochondrijų bei chloroplastų 70S ribosomos. Panašiai veikia ir linkomicinas, sparsomicinas bei eritromicinas. Eritromicinas, prisijungdamas prie 50S subvieneto, inhibuoja ribosomos translokaciją. Veikia gramneigiamąsias ir gramteigiamąsias bakterijas. Streptomicinas ir gentamicinas (aminoglikozidai) sutrikdo normalų genetinio kodo nuskaitymą sukeldami daug translokacijos klaidų. Pavyzdţiui, poli(u) normaliai koduoja fenilalanino įsijungimą. Esant streptomicinui, polinukleotidas (mrnr) ant ribosomos gali koduoti ne tik fenilalanil-trnr, bet ir leucil-trnr (leucil-trnr koduoja CUU, UUG) bei izoleucil-trnr. Esant šiems antibiotikams, maţėja mrnr tripletų specifiškumas, ir jie gali sąveikauti su antikodonais, turinčiais tik dvi komplementarias bazes. Antibiotikai inhibuoja baltymo sintezės iniciaciją ir geriausiai veikia gramneigiamąsias bakterijas. Panašus veikimas būdingas ir neomicinui, ir kanamicinui.

Veikiant bakterijų populiaciją, pvz., E. coli, buvo gauti mutantai, atsparūs streptomicinui, nors jų atsiradimo daţnis yra labai maţas 10-12. Iš atsparių streptomicinui bakterijų galima atrinkti mutantų, kurie negali augti ir daugintis, jei terpėje nėra streptomicino. Atsiradusi nauja savybė priklauso nuo vienintelės taškinės mutacijos, pakeičiančios tik vieną aminorūgštį bakterijos ribosomos baltyme. Penicilinas inhibuoja bakterijų sienelių susidarymą. Veikia gramteigiamąsias bakterijas. Cefalosporinas taip pat veikia bakterijų sienelę. Inhibuoja gramteigiamųjų ir gramneigiamųjų bakterijų biosintezę. Antibiotikai neveikia virusų, nes virusai neturi nei transkripcijos, nei baltymus sintetinančios sistemos. Savo replikacijai, transkripcijai ir transliacijai jie naudoja šeimininko ląstelės aparatą. Patekus virusui į ląstelę, išjungiama šeimininko RNR, o kartu ir baltymų biosintezė. Visas baltymus sintetinantis aparatas perjungiamas į viruso nukleorūgščių ir baltymų sintezę. Būtent šie procesai vyksta uţsikrėtus raupų, poliomielito, gripo ir kt. virusais. Labai stiprus ţmogaus ir kitų ţinduolių baltymo biosintezės inhibitorius yra difterijos toksinas. Jis inhibuoja baltymo biosintezės elongacijos faktoriaus eef2 prisijungimą prie ribosomos. Difterijos bacila dauginasi ant gerklų gleivinės paviršiaus ir išskiria baltyminės kilmės toksiną, sudarytą iš vienos polipeptidinės grandinės (molekulinė masė 60 kda). Veikiant šeimininko proteazėms, difterijos toksinas suskyla į du fragmentus A ir B. Fragmentas A yra fermentas ADP-riboziltransferazė, pernešanti ADP-ribozilinę liekaną nuo NAD'o ant eukariotų elongacijos faktoriaus 2 (eef2): NAD+eEF2 ADP-ribozil-EF2 + nikotinamidas + H + Taip modifikuotas eef2 praranda savo galimybę dalyvauti ribosomos translokacijoje. Transliacija nutrūksta. Tuo ir paaiškinamas toksinis baltymo veikimas. Inhibitorius Veikimo vieta Inhibuojamas procesas Chloramfenikolas Prokariotų 50S subvienetas Peptidiltransferazė Cikloheksimidas Eukariotų 80S ribosoma Elongacija Eritromicinas Prokariotų 50S subvienetas Translokacija Fuzido rūgštis Prokariotų EF-G veikimas Translokacija Neomicinai Prokariotai, daug taikinių Transliacija Puromicinas Eukariotų ir prokariotų ribosoma Peptido pernešimas Ricinas Eukariotai Eilė procesų Streptomicinas Prokariotų 30S subvienetas Iniciacija Elongacija Tetraciklinai Prokariotų 30S subvienetas Aminoacil-tRNR surišimas

Laboratorinių darbų aprašas 1 laboratorinis darbas Suminių transportinės RNR ir aminoacil-trnr sintetazių preparatų išskyrimas iš pelių kepenų ir jų aktyvumo nustatymas (6 val.) Universalus genetinis kodas yra realizuojamas vienos iš pagrindinių biocheminių reakcijų metu. Ši reakcija tai trnr molekulės aminoacilinimas, kurią katalizuoja specifiniai fermentai aminoacil-trnr sintetazės (ARSazės). Kiekvienai aminorūgščiai egzistuoja viena ARSazė ir viena trnr. trnr aminoacilinimo reakcijoje dalyvauja viena iš 20-ies ARSazių, kurių kiekviena yra specifinė tik vienai aminorūgščiai. 1. Suminių trnr preparatų išskyrimas. Transliacijos metu mrnr molekulėje esanti kodonų seka, patekusi į ribosomą, nurodo aminorūgščių seką polipeptidinėje grandinėje. Tačiau mrnr kodonas tiesiogiai neatpaţįsta aminorūgšties. Ir aminorūgštį, ir tris ją atitinkančio kodono nukleotidus specifiškai atpaţįsta RNR molekulė, vadinama transportine RNR (trnr). trnr yra pakankamai maţa molekulė, kurios grandinę sudaro 73-95 nukleotidai, jos molekulinė masė yra apie 25 kda, sedimentacijos koeficientas 4S. Eukariotų ląstelių citoplazmoje yra daugiau kaip 100 įvairių trnr. Kiekviena aminorūgštis turi jai specifiškas kelias trnr, vadinamas izoakceptinėmis. Darbo eiga: 1. Pelių kepenys pasveriamos ir 3 min. homogenizuojamos 1,5 tūrio (lyginant su kepenų svoriu) buferio (0,1 M Tris-HCl, ph 7,5; 1,0 M natrio chloridas; 0,005 M etilendiamintetraacetatas). 2. Į homogenatą įpilama 1,5 tūrio (lyginant su kepenų svoriu) 80 proc. fenolio tirpalo ir purtoma purtyklėje 5 min. 3. Gautas mišinys centrifuguojamas 15000xg pagreičiu 15 min. K-24 centrifuga. 4. Po centrifugavimo nusiurbiamas vandeninis sluoksnis, į kurį pridedama lygus tūris 80 proc. fenolio, purtoma purtyklėje 5 min. ir dar kartą centrifuguojama (15000xg pagreičiu 15 min. K-24 centrifuga). 5. Po centrifugavimo nusiurbiamas vandeninis sluoksnis, pridedamas trigubas tūris šalto 96 proc. etanolio ir laikoma -20 0 C temperatūroje 3 val. 6. Nuosėdos surenkamos centrifuguojant 8000xg pagreičiu 5 min. K-24 centrifuga ir tirpinamos tokiame 0,3 M natrio acetato ml kiekyje, kiek gramų buvo kepenų. 7. Į gautą tirpalą lėtai maišant po truputį pilama iki 0,54 tūrio (lyginant su nuosėdų tirpalo natrio acetate tūriu) izopropanolio. 8. Po to centrifuguojama 8000xg pagreičiu 5 min. ir nuo nuosėdų nupilamas supernatantas.

9. Į supernatantą po truputį pilama iki 0,44 tūrio izopropanolio (galutinis izopropanolio tūris turi būti 0,98 lyginant su nuosėdų tirpalo natrio acetate tūriu) ir paliekama nakčiai -20 0 C temperatūroje. 10. Iškritusios nuosėdos surenkamos centrifuguojant 8000xg pagreičiu 5 min., ištirpinamos bidistiliuotame vandenyje ir gaunamas suminis trnr preparatas. 11. trnr koncentracija gautame tirpale nustatoma spektrofotometriškai matuojant sugertį ties 260 ir 280 banga. 2. Aminoacil-tRNR sintetazių preparatų išskyrimas. ARSazės tai 20-ties fermentų šeima, atliekanti panašias funkcijas, tačiau pasiţyminti skirtingu specifiškumu substratui. Viena ypatingų šių fermentų savybių yra ta, kad juos sudaro skirtingas skaičius įvairaus dydţio subvienetų. ARSazės gali būti ir monomerai, ir dimerai, ir tetramerai, o jų subdalelių molekulinė masė skiriasi nuo 37 kda iki 108 kda. Darbo eiga: 1. Bemitochondrinio supernatanto išskyrimui pelių kepenys pasveriamos ir homogenizuojamos trijuose buferio (100 mm Tris-HCl, ph 7,5; 10 mm MgCl 2 ; 10 mm KCl; 250 mm sacharozė; 1 mm ditiotreitolas) tūriuose. 2. Fermentai ekstrahuojami audinių homogenatą 15 min. maišant stikline lazdele ledo vonioje. 3. Ląstelių, branduolių ir mitochondrijų nuolauţos pašalinamos homogenatą centrifuguojant 15000 g pagreičiu 15 min. K-24 centrifuga. 4. Supernatantas filtruojamas per keturgubą sterilios marlės sluoksnį ir gaunamas aminoacitrnr-sintetazių preparatas. 5. Baltymų koncentracija gautame tirpale nustatoma spektrofotometriškai matuojant sugertį ties 260 ir 280 banga, preparatą praskiedus 100 kartų homogenizacijos buferiu. 3. trnr Leu aktyvumo nustatymas. Darbo eiga: 1. Aminoacilinimo reakcijos mišinys (100 l), kurį sudaro: 100 mm Tris-HCl (ph 7,5), 10 mm MgCl 2, 10 mm KCl, 4 mm ATP, 0,2 mm [ 14 C]-leucino, 250 g aminoacil-trnrsintetazių preparato ir 50 g trnr preparato, inkubuojamas 37 o C temperatūroje 20 min. 2. Aminoacilinimo reakcija sustabdoma pridedant 0,2 ml 10 proc. trichloracto rūgšties. 3. Mėginiai laikomi ledo vonioje 20 min., kad susiformuotų nuosėdos. 4. Nuosėdos surenkamos ant nitroceliuliozės filtrų ir praplaunamos 25 30 ml. 5 proc. trichloracto rūgšties tirpalu. 5. Filtrai išdţiovinami (apie 30 min. po staline lempa). 6. Reakcijos produktų radioaktyvumas kiekybiškai įvertinamas matuojant skysčio scintiliaciniu skaitikliu,,delta 300 (skaičiavimo efektyvumas 60 proc.). Pagal [ 14 C]

leucino prisijungimą prie trnr Leu galima spręsti apie trnr Leu akceptinį aktyvumą pelių kepenyse. 4. Leucil-tRNR sintetazės aktyvumo nustatymas. Darbo eiga: 1. Leucil-tRNR-sintetazės aktyvumo nustatymui mišinys (100 l), kurį sudaro: 100 mm Tris- HCl, 10 mm MgCl 2, 10 mm KCl, 4 mm ATP, 0,2 mm [ 14 C]-leucino, 250 g aminoaciltrnr-sintetazių preparato, 150 g trnr preparato, inkubuojamas 3 min. 37 o C temperatūroje. 2. Po to reakcija sustabdoma, pridėjus dvigubą tūrį 10 proc. trichloracto rūgšties. 3. Mėginiai laikomi ledo vonioje dar 20 min. nuosėdų susiformavimui. 4. Nuosėdos surenkamos ant nitroceliuliozės filtrų Synpor Nr. 3 ir praplaunamos 25-30 ml 5 proc. trichloracto rūgšties tirpalu. 6. Filtrai išdţiovinami (apie 30 min. po staline lempa). 7. Reakcijos produktų radioaktyvumas kiekybiškai įvertinamas matuojant skysčio scintiliaciniu skaitikliu,,delta 300 (skaičiavimo efektyvumas 60 proc.). 2 laboratorinis darbas Transliacijos greičio ir lygio nustatymas neląstelinėje baltymus sintezuojančioje sistemoje iš pelių kepenų (6 val.) Transliacijos greičio ir lygio nustatymui yra naudojama neląstelinė sistema, turinti bemitochondrinį supernatantą. Šios sistemos privalumas yra tas, kad joje baltymų biosintezė vyksta panašiai kaip intaktinėse ląstelėse. Lyginant su sistema, turinčia ribosomas ir mikrosomas, sistemoje su bemitochodriniu supernatantu baltymų biosintezė vyksta 25-50 proc. efektyviau. Darbo eiga: 1. Bemitochondrinio supernatanto išskyrimui pelių kepenys pasveriamos ir homogenizuojamos trijuose buferio (100 mm Tris-HCl, ph 7,5; 10 mm MgCl 2 ; 10 mm KCl; 250 mm sacharozė; 1 mm ditiotreitolas) tūriuose. 2. Fermentai ekstrahuojami audinių homogenatą 15 min. maišant stikline lazdele ledo vonioje. 3. Ląstelių, branduolių ir mitochondrijų nuolauţos pašalinamos homogenatą centrifuguojant 15000 g pagreičiu 15 min. K-24 centrifuga. 4. Supernatantas filtruojamas per keturgubą sterilios marlės sluoksnį. 5. Nufiltruotas supernatantas centrifuguojamas 30000xg pagreičiu 20 min. MSE centrifuga (rotorius 10x10 ml): gaunama S-30 frakcija.

6. Baltymų koncentracija gautame tirpale nustatoma spektrofotometriškai matuojant sugertį ties 260 ir 280 banga, preparatą praskiedus 100 kartų homogenizacijos buferiu. 7. 0,1 ml inkubacinio neląstelinės baltymus sintezuojančios sistemos mišinio, kurį sudaro 30 mm HEPES buferis (ph 7,5), 5 mm magnio acetatas, 100 mm kalio chloridas, 2 mm adenozintrifosfatas, 0,4 mm guanozintrifosfatas, 20 mm fosfokreatinas, 2 g fosfokreatinkinazės, 100 M aminorūgščių mišinio, 5 l [ 14 C]-chlorelos baltymų hidrolizato ir 0,5 optiniai vienetai [A 260 -A 320 ] S-30 frakcijos, inkubuojama 37 0 C temperatūroje 5, 10, 20 ir 30 min. 8. Reakcija stabdoma, pridėjus 0,5 ml 10 proc. trichloracto rūgšties. 9. Po to mėginiai inkubuojami 10 min. 90 0 C temperatūroje aminoacil-trnr hidrolizei. 10. Atšaldţius mėginius 20 min ledo vonioje, nuosėdos rinktos ant nitroceliuliozinių filtrų Synpor Nr. 3 (Čekija) ir praplautos 25-30 ml šaltos 5 proc. trichloracto rūgšties. 11. Filtrai išdţiovinami (30 min. po staline lempa). 12. Radioaktyvumas matuotas scintiliaciniu skaitikliu Delta-300 (Olandija), kurio efektyvumas 60 proc. 3 laboratorinis darbas Baltymų analizė gel-filtracijos, elektroforezės poliakrilamidiniame gelyje denatūruojančiomis sąlygomis ir imunoblotingo metodais (6 val.) Individualių baltymų išskyrimo metodai pagrįsti skirtingomis fizikinėmis ir cheminėmis savybėmis. Baltymus galima išskirti tik esant ţemai temperatūrai. Tinkamiausia temperatūra yra artima tirpalo uţšalimo temperatūrai. Esant ţemai temperatūrai, susilpnėja mikroorganizmų dauginimasis, nuslopinamas proteazių poveikis. Tiriant maţai ţinomus baltymus, reikia vengti rūgščių ir šarmų, nes daugelis baltymų nekinta, kai ph artimas 7, nors esama ir išimčių, pvz.: tripsinas, chimotripsinas, pepsinas ir histonai yra patvaresni rūgščioje terpėje. Organiniai tirpikliai (etanolis, acetonas) tinka baltymams išskirti tik esant ţemai temperatūrai (apie -10 C). Pagrindiniai baltymų išskyrimo etapai: 1. Baltymų ekstrahavimas iš ląstelių ir audinių. 2. Nebaltyminių medţiagų pašalinimas. 3. Baltymų mišinio frakcionavimas. 4. Druskų pašalinimas iš baltymų. Druskoms ir kitoms maţos molekulinės masės priemaišoms pašalinti iš baltymų naudojamas dializės metodas, gel-filtracija. Šių metodų pagrindą sudaro tai, kad baltymų

molekulės, turėdamos didelę molekulinę masę, negali prasiskverbti pro membranų poras arba įsiskverbti į gelio granules. Baltymams išskirti plačiai taikomas elektroforezės metodas, kuris pagrįstas tuo, kad skirtingi baltymai nevienodai jonizuojami, įgyja skirtingą krūvį ir todėl nevienodu greičiu juda elektros lauke. 1. Fermentų molekulinės masės nustatymas chromatografijos gelyje metodu. Gel-filtracijai naudojami vadinamieji molekuliniai tinkleliai inertinės hidratuotos medţiagos: polisacharidai kaip poringos granulės. Jos gaunamos iš bakterijų polisacharidų (sefadeksai), agaro arba polimerizuotų akrilamido gelių (akrileksas). Nedidelės molekulės prasiskverbia į granules per poras, todėl pro geliu pripildytą kolonėlę juda lėčiau negu didelės molekulės, negalinčios patekti į granulių vidų. Molekulinės masės nustatymas chromatografijos gelyje metodu pagrįstas skirtingu įvairaus dydţio molekulių sugebėjimu praeiti per sefarozės kolonėlę. Priklausomybė tarp biologinių molekulių eliucijos greičio ir jų molekulinės masės logaritmo yra tiesinė. Laisvas sefarozės 6B kolonėlės tūris nustatomas pagal mėlynojo dekstrano 2000 eliucijos tūrį. Kalibravimo kreivė nustatoma pagal ţinomos molekulinės masės baltymųţymių eliucijos tūrius. Skaičiuojamas kiekvieno baltymo-ţymės pasiskirstymo koeficientas (K av ) ir sudaromas K av priklausomybės nuo molekulinės masės logaritmo (lg M) grafikas. K av apskaičiuojamas pagal formulę: K av =V e -V o /V t -V o, kur V e baltymo-ţymės eliucijos tūris, V o laisvas kolonėlės tūris, V t - bendras kolonėlės tūris. Naudojami ţinomos molekulinės masės baltymai-ţymės: JSA (67 kda), aldolazė (158 kda), katalazė (232 kda), feritinas (440 kda), tyroglobulinas (669 kda). Eliucija vykdoma 12 ml/val. greičiu. Aprašytu metodu apskaičiuojama K av reikšmė tiriamam baltymui ir pagal kalibravimo kreivę nustatoma jo molekulinė masė. Darbo eiga: 1. Kolonėlė pripildoma išbrinkinta izotoniniame (0,9 proc.) NaCl tirpale sefaroze 6B. 2. Paruošiamas mišinys frakcionuoti iš dviejų komponentų: sočiojo mėlynojo dekstrano tirpalo, kurio molekulinė masė yra 10 7 Da, ir sočiojo K 2 Cr 2 0 7 tirpalo, kurio molekulinė masė yra 294 Da, santykiu 1:1. 3. Ant gelio paviršiaus uţlašinami 2-3 lašai frakcionuoto mišinio ir palaukiama, kol gelis sugers tirpalą. 4. Atsargiai per stiklinę lazdelę, priglaustą prie sienelės, į kolonėlę įpilama apie 2 ml 0,9 proc. NaCl tirpalo ir prijungiamas lašintuvas su izotoniniu NaCl tirpalu. Šio tirpalo reikia išskiriamų medţiagų eliucijai (išplovimui). 5. Perėjęs per kolonėlę mišinys pasiskirsto skirtingų spalvų frakcijomis. Kiekviena frakcija

surenkama į skirtingus mėgintuvėlius. 2. Molekulinės masės nustatymas elektroforezės poliakrilamido gelyje, denatūruojant fermento molekules, metodu. Baltymų molekulės elektrinio krūvio dydis ir ţenklas priklauso nuo bazinių ir rūgštinių jonizuotų grupių santykio molekulėje. Elektriniam laukui susidarius baltymų molekulės tirpale juda priešingai įkrauto poliaus link. Baltymų elektroforezė gali vykti natyvinėmis ir denatūravimo sąlygomis. Vykstant elektroforezei natyvinėmis sąlygomis, baltymų molekulių judėjimo greitis priklauso nuo jų krūvio, molekulinės masės, hidratacijos laipsnio, molekulių dydţio ir formos. Vykstant elektroforezei denatūravimo sąlygomis, pridedama natrio dodecilsulfato, todėl baltymo molekulės tarsi išsitiesia ir jų judėjimas elektriniame lauke priklauso tik nuo jų molekulinės masės. Elektroforezė natyvinėmis sąlygomis atliekama, kai norima išvalyti ir išgryninti baltymą, o denatūravimo sąlygomis kai norima nustatyti baltymo molekulinę masę. Elektroforezė vyksta specialiose plokštelėse ar nedideliuose vamzdeliuose, pripildytuose poliakrilamido gelio. Poliakrilamido gelis yra akrilo rūgšties amido (akrilamido ir ir bisakrilamido) polimeras. Darbo eiga: Elektroforezė 15 proc. PAAG, denatūruojant fermento molekules (su 0,2 proc. NDS), atliekama Lemlio metodu. 1. Elektroforezės plokštelės sandariai pritvirtinamos stove guminėmis tarpinėmis ir gnybtais. 2. Paruošiamas mišinys geliui gauti iš akrilamido (akrilo rūgšties amido), bisakrilamido (N,N'-metilenbisakrilamido), amonio persulfato (NH 4 ) 2 S 2 O 3 ir TEMED (N > N,N I,N I tetrametiletilendiamino). 3. Paruoštas pagrindinio gelio tirpalas (0,75 M Tris-HCl buferio (ph 8,8), 15 proc. PAA (bisakrilamido/akrilamido santykis 1:37) ir 0,2 proc. NDS) supilamas į ertmę tarp elektroforezės plokštelių taip, kad viršutinis gelio paviršius būtų 1,5 cm ţemiau uţ viršutinį jų kraštą. Atsargiai ir lėtai pilant sienele, uţpilamas kelių milimetrų storio distiliuoto vandens sluoksnis. Turi būti riba, skirianti vandenį ir gelį. Vanduo apsaugo gelį nuo oro deguonies, kuris yra polimerizacijos inhibitorius, be to, sudaro sąlygas gauti lygų, plokščią paviršių. Gelis stingsta apie 20 min. 4. Pagrindiniam geliui sustingus, vandens sluoksnis pašalinamas siaura filtrinio popieriaus juostele. 5. Į ertmę tarp plokštelių uţpilamas koncentruojantis gelis, kuris ruošiamas iš 0,25 M Tris-HCl buferio (ph 6,8), 3,5 proc. PAA (bisakrilamido/akrilamido santykis 1:37), 20 proc. sacharozės ir 0,2 proc. NDS. Po to į ertmę tarp plokštelių įstatomos šukutės. Gelis stingsta apie 15 min.

6. Sustingus koncentruojančiam geliui, šukutės atsargiai ištraukiamos, gelyje susidarę šulinėliai praplaunami vandeniu, o po to elektrodiniu buferiu. 7. Baltymų pavyzdţiai elektroforezei ruošti, inkubuojant juos 3 min. 90 o C temperatūroje 0,01 M Tris-HCl (ph 8,2), kurio sudėtyje yra 20 proc. glicerolio, 0,01 M MgCl 2, 2 proc. NDS ir 5 proc. -merkaptoetanolio. Į PAAG plokštelės griovelius įnešama po 5-20 g baltymo. Į tiriamą baltymų tirpalą pridedama mėlyno daţo brom-fenolio mėlynojo, kad galima būtų stebėti elektroforezės eigą ir matyti jos pabaigą. 8. Apatinė elektrodinė kamera pripildoma elektrodinio buferinio tirpalo ir sujungiama su viršutine elektrodine kamera. Viršutinė elektrodinė kamera pripildoma elektrodinio buferio ir uţdengiama dangteliu. 9. Elektroforezė atliekama 0,05 M Tris-HCl buferyje (ph 8,3), kurio sudėtyje yra 0,38 M glicino ir 0,2 proc. NDS. Elektroforezė vyksta, tekant pastoviai 40 ma/plokštelei srovei. 10. Elektroforezė baigiama, kai mėlyna juosta pasiekia plokštelių apatinį galą. Ji trunka apie 1 val. Pasibaigus elektroforezei, išjungiamas srovės šaltinis, viršutinė kamera atskiriama nuo apatinės, išpilamas buferinis tirpalas, išimamos plokštelės su geliu. 11. Geliai iš plokštelių atsargiai išimami ir patalpinami į nerūdijančio plieno indą, kur daţomi specialiais mėlynais daţais (coomasi blue) 60 min. 12. Daţų perteklius nuplaunamas 7 proc. acto rūgšties tirpalu, periodiškai keičiant tirpalą, kol gelio sritys, kur nėra baltymo, tampa visiškai skaidrios. 13. Gelį nudaţius ir atplovus daţo perteklių, matuojami baltymų-ţymių ir tiriamojo baltymo pagrindiniame gelyje nueiti atstumai (R). Nustatoma lg10r priklausomybė nuo baltymųţymių molekulinės masės logaritmo. Pagal gautą kalibravimo kreivę nustatoma tiriamų baltymų molekulinę masę. Naudojami baltymai-ţymės: mioglobinas (17,8 kda), chimotripsinogenas (25 kda), JSA (68 kda), fosforilazė B (91,5 kda). 3. Kaspazės 3 aktyvaus subvieneto nustatymas imunoblotingo metodu. Imunoblotingas (dar vadinamas Western blotingu) yra vienas iš imunocheminės analizės metodų. Naudojant specifinius antikūnus, šiuo metodu galima identifikuoti tiriamąjį baltymą kitų baltymų mišinyje, pavyzdţiui, ląstelių lizate, kraujo serume ir pan. Todėl imunoblotingas plačiai taikomas medicinoje, biotechnologijoje ir moksliniuose tyrimuose. Pavyzdţiui, šiuo metodu galima nustatyti virusų, tokių kaip ŢIV, tymų, hepatito B, C ir kt., baltymus ţmogaus kraujo serume ir patvirtinti diagnozę. Be to, šiuo metodu galima tirti įvairių baltymų, net ir netirpių, ekspresiją ląstelėse pavyzdţiui, membranoje esančių receptorių ir pan. Biotechnologijoje šis metodas gali būti taikomas rekombinantinių baltymų ekspresijai tirti.

Baltymai poliakrilamidiniame gelyje atskiriami elektroforezės būdu ir pernešami ant specialios membranos. Po to membrana inkubuojama su specifiniais antikūnais prieš tiriamąjį baltymą. Prisijungę antikūnai išryškinami, inkubuojant su antriniais antikūnais. Darbo eiga: 1. Atliekama tiriamų audinių poribosominio supernatanto elektroforezė, kaip aprašyta 3 laboratorinio darbo 2 dalyje 1-10 punktuose. 2. Gelis iš plokštelių atsargiai išimamas, patalpinamas į lėkštelę su pernešimo buferiu (25 mm Tris, 192 mm glicinas, 20 proc. metanolio) ir plaunamas 15 min. 3. Blotingo membrana 1 min. plaunama metanolyje, po to 1 min. distiliuotame vandenyje ir perkeliama į lėkštelę su pernešimo buferiu. 4. Iš filtrinio Vatmano popieriaus iškerpami gelio dydţio lapeliai ir pamerkiami į lėkštutę su pernešimo buferiu. 5. Iš poliakrilamidinio gelio baltymai pernešami ant membranos, naudojant blotingo aparatą, sudedant tokia tvarka: filtrinis popierius, membrana, gelis, filtrinis popierius. Pernešimas trunka 1 valandą, esant pastovios srovės stiprumui (40 ma). 6. Toliau atliekamas membranos blokavimas. Tam membrana 5 min. plaunama 50 ml TTBS buferio, kurio sudėtyje yra 20 mm Tris, 100 mm NaCl, 0,05 proc. tvino, ph 7,5 ir inkubuojama 1 val. blokavimo buferyje (TTBS+5 proc. pieno miltelių) kambario temperatūroje. 7. Membrana 5 min. plaunama 50 ml TTBS buferio. 8. Membrana, patalpinta į plastikinį maišelį su pirminiais antikūnais prieš kaspazę 3 (praskiedimas 1:500 su TTBS+3 proc. pieno miltelių), inkubuojama per naktį 4 0 C temperatūroje. 9. Kitą dieną membrana išimama iš maišelio ir 2 kartus po 5 min. plaunama TTBS buferiu. 10. Inkubacija su antriniais antikūnais. Paruošiama 8,3 µl antrinių antikūnų tirpalo 25 ml TTBS+3 proc. pieno miltelių. Membrana inkubuojama šiame tirpale 1 val. kambario temperatūroje. 11. Membrana du kartus po 5 min. plaunama TTBS buferyje. 12 Po to membrana 5 min. plaunama TBS (20 mm Tris, 100 mm NaCl, ph 7,5) buferiu. 13. Fermentinės reakcijos išryškinimas. Membrana inkubuojama daţymo buferyje (paruoštas pagal aprašymą iš imunoblotingo rinkinio), kol išryškėja specifiškai nusidaţiusios juostelės (apie 30 min.). Daţymas baigiamas membraną pernešus į lėkštelę su dejonizuotu vandeniu (10 min.). Po to ji dar keletą kartų plaunama dejonizuotu vandeniu, išdţiovinama ir fotografuojama.

14. Rezultatų įvertinimas. Imunoblotingo rezultatai įvertinami kokybiškai: nustatoma, kuriame iš tiriamųjų pavyzdţių yra aktyvus kaspazės 3 subvienetas (apie 20kDa). Laboratorinių darbų rezultatai pateikiami pagal Biochemijos laboratorinių darbų aprašą (ţiūr. ţemiau). Biochemijos laboratorinių darbų aprašas 1. Data 2. Darbo pavadinimas 3. Darbo tikslas 4. Darbo principas 5. Tyrimo objektas, reagentai, pagrindinės darbo priemonės 6. Darbo rezultatai ir skaičiavimai 7. Išvados

Studijų dalyko Baltymų biosintezė seminarų temų konspektai 1 seminaras Genetinio kodo bendros savybės ir iššifravimas (3 val.) Baltymus sudaro maţiausiai 20 skirtingų aminorūgščių, tuo tarpu DNR ar RNR sudėtyje yra tik 4 bazės. Buvo nustatyta, kad informaciją apie kiekvieną aminorūgštį neša 3 bazių seka, vadinama kodonu. Galimų tripletinių kodonų, sudarytų iš 4 bazių, skaičius lygus 4 3 64. Eksperimentai parodė, kad iš šių teoriškai galimų variantų 61 tikrai koduoja aminorūgštis. Jeigu vienoms aminorūgštims (pvz., triptofanui) atitinka tik vienas kodonas, tai kitoms (pvz., serinui) iki 6 kodonų. Nepaisant to, genetinis kodas yra specifinis ir vienareikšmis, vienas kodonas koduoja tik vieną aminorūgštį. 5' kodono galas Vidurinė kodono bazė 3' kodono galas U C A G U Phe Ser Tyr Cys U U Phe Ser Tyr Cys C U Leu Ser Stop Stop A U Leu Ser Stop Trp G C Leu Pro His Arg U C Leu Pro His Arg C C Leu Pro Gln Arg A C Leu Pro Gln Arg G A Ile Thr Asn Ser U A Ile Thr Asn Ser C A Ile Thr Lys Arg A A Met Thr Lys Arg G (starto kodonas) G Val Ala Asp Gly U G Val Ala Asp Gly A G Val Ala Glu Gly C G Val Ala Glu Gly G Kodą vadina išsigimusiu, kadangi vieną aminorūgštį paprastai atitinka keletas kodonų. Be to, kodas yra universalus praktiškai vienodas kodas buvo nustatytas visiems gyviems organizmams. Mitochondrijos yra vienintelė ţinoma išimtis iš universalumo principo kai kurie kodonai jose turi neįprastą reikšmę. Eukariotų baltymų biosintezės starto signalu yra metionino kodonas AUG. Todėl metioninas yra pirma aminorūgštis peptidinėje grandinėje. Stop signalai UGA, UAA ir UAG

kodonais. nekoduoja jokios aminorūgšties ir kartais yra vadinami beprasmiais (angl. nonsens) Kodonas Mitochondrijose Įprasta reikšmė CUA Thr Leu AUA Met Ile UGA Trp Stop Genetinio kodo savybės: 1. Genetinis kodas yra trinukleotidinis (tripletas). Iš 4 nukleotidų gali susidaryti 64 kodonai (4 3 = 64). Terminas kodonas reiškia trijų nukleotidų seką mrnr molekulėje, kuris nurodo specifinės aminorūgšties įjungimą į baltymą. Iš 64 kodonų 61 koduoja aminorūgštis, o 3 yra nekoduojantys jie vadinami beprasmiais (angl. nonsens) arba "stop" kodonais. Tai baltymų biosintezės pabaigos signalai. 2. Genetinis kodas yra išsigimęs (degeneruotas), t.y. tą pačią aminorūgštį gali koduoti daugiau nei vienas kodonas (taigi ta pati aminorūgštis gali jungtis prie kelių trnr, turinčių skirtingus antikodonus). Daugelis aminorūgščių turi po kelis kodonus, tik Met ir Trp po vieną. 3. Genetinis kodas labai specifinis, paprastai vienas kodonas koduoja vieną aminorūgštį. Išimtis iniciacijos kodonai AUG (Met), GUG (Val), UUG (Leu) ir AUU (Ile), tačiau kai jie lokalizuoti mrnr pradţioje, prie jų jungiasi trnr, prisijungusi formilmet. Ši aminorūgštis būna prokariotų baltymų N gale, kol vyksta sintezė. Po to atskeliama arba formilo grupė (CHO-), arba visas formilmet. Genetinio kodo specifiškumą nulemia pirmi 2 kodono nukleotidai, o 3-ias galinis nukleotidas ne toks specifinis. Ši savybė ţinoma kaip trečios bazės išsigimimas. Tas pačias arba panašias aminorūgštis koduojančių kodonų seka yra panaši. 4. Genetinis kodas yra universalus. Visuose organizmuose tie patys tripletai koduoja tas pačias aminorūgštis. Išimtis kai kurie mitochondrijų kodonai, pvz., AUA koduoja ne Ile, bet Met; UGA čia ne terminacijos kodonas, bet koduoja Trp. Taip pat ţinomos išimtys kai kuriuose prokariotuose ir ţemesniuosiuose eukariotuose. 5. Genetinis kodas nepersidengiantis (kai kurie kodonai persidengia mitochondrijų ir chloroplastų). Prasidėjus baltymo biosintezei, nukleotidiniai tripletai skaitomi vienas po kito, kol pasiekia terminacijos kodoną. 6. Genetinis kodas yra nesanklotinis, t.y. tarp kodonų nėra jokių skiriamųjų ţenklų, po vieno tripleto tuoj pat eina kitas.

2 seminaras Informacinės RNR (mrnr) savybės ir brendimas (3 val.) Labai svarbią vietą transliacijos procese uţima mrnr. Transkripcijos metu susintetinta mrnr molekulė yra vadinama pirminiu mrnr transkriptu. Šis transkriptas toliau modifikuojamas ir brandinamas, vyksta splaisingas, kurį vykdo splaiseosomos tai kompleksas, sudarytas iš kelių rūšių ribonukleoproteidų. Splaisingo metu yra iškerpamos nekoduojančios intronų sekos bei nuosekliai sujungiamos koduojančios egzonų sekos (7 pav.). Subrendusi mrnr palieka branduolį. 7 pav. DNR transkripcija ir RNR splaisingas Nustatyta, kad ląstelės branduolyje prie tam tikrų mrnr vietų prisijungia baltymai, suformuodami informasomas. Branduolio baltymai labai svarbūs mrnr pernešimui. Priklausomai nuo koduojamo polipeptido dydţio, mrnr molekulės gali būti įvairaus ilgio. mrnr molekulės yra maţiausiai stabilios iš visų RNR rūšių, todėl nereikalingų baltymų sintezė ląstelėje gali būti greitai nutraukta. Tačiau ši savybė labai apsunkina mrnr struktūros tyrimus, todėl iki šiol mrnr antrinė ir tretinė struktūros nėra iki galo aiškios. mrnr struktūroje yra įvairių reguliacinių sričių, kurios nekoduoja baltymų. Eukariotų mrnr molekulės 5 gale yra netransliuojama seka, vadinama kepure (angl. cap ), kurioje yra

modifikuotas guanino nukleotidas, nurodantis, kur turi prisijungti ribosoma, prasidedant transliacijai. Transliuojama seka prasideda iniciacijos kodonu AUG ir baigiasi vienu iš šių 3 terminacijos kodonu UAA, UAG, UGA. Po transliuojamos sekos mrnr molekulės 3 gale yra dar viena nekoduojanti seka, kuri vadinama poli-a uodega. Ji susideda iš 150-200 adenino (A) nukleotidų grandinės, jos funkcijos nėra pilnai ištirtos. Manoma, kad greičiausiai uodega palengvina mrnr pernašą iš branduolio ir reguliuoja transliaciją. Taip pat nustatyta, kad kepurėlė ir poli-a apsaugo mrnr nuo egzonukleazių veikimo ir suteikia šiai molekulei didesnį stabilumą. RNR tipas Sintezės vieta, S Funkcija Informacinė RNR (mrnr) Transportinė RNR (trnr) Maţos branduolio RNR (snrnr) Heterogeninė branduolio RNR (hnrnr) Ribosominė RNR (rrnr) Mitochondrijų mrnr (mt mrnr) Mitochondrijų trnr (mt trnr) Maţos citoplazmos RNR (scrnr) Nukleoplazma Nukleoplazma, 4S Nukleoplazma Nukleoplazma, 30-100S Nukleoplazma, 5S Branduolėlis, 5,9-18S Mitochondrijos, 12-16S Mitochondrijos, 9-40S Mitochondrijos, 3,2-4S Šiurkštusis endoplazminis tinklas ir citozolis, 7S Baltymų sintezės matrica Perneša aminorūgštis prie mrnr Reguliacinė chromatinui ir struktūrinė RNR Kitų RNR pirmtakai Ribosomos struktūros dalis Baltymų sintezės matrica Perneša aminorūgštis prie mrnr Atrenka eksportuojamus baltymus 3 seminaras trnr struktūra. Aminoacil-tRNR sintetazės. Aminorūgščių liekanų akceptavimas (prijungimas) prie trnr (3 val.) Transportinė RNR. Transliacijos metu mrnr molekulėje esanti kodonų seka, patekusi į ribosomą, nurodo aminorūgščių seką polipeptidinėje grandinėje. Tačiau mrnr kodonas tiesiogiai neatpaţįsta aminorūgšties. Ir aminorūgštį, ir tris ją atitinkančio kodono nukleotidus specifiškai atpaţįsta RNR molekulė, vadinama transportine RNR (trnr). trnr yra pakankamai maţa molekulė, kurios grandinę sudaro 73-95 nukleotidai, jos molekulinė masė yra apie 25 kda,

sedimentacijos koeficientas 4S. trnr molekulėje susidaro vandeniliniai ryšiai tarp nukleotidų komplementarių bazių porų toje pačioje grandinėje. Eukariotų ląstelių citoplazmoje yra daugiau kaip 100 įvairių trnr. Kiekviena aminorūgštis turi jai specifiškas kelias trnr, vadinamas izoakceptinėmis. Kai kuriais atvejais viena trnr atpaţįsta tik vieną mrnr kodoną, o kai kada gali atpaţinti iki keturių kodonų. trnr molekulėje gali būti 4 spiraliniai fragmentai. Dėl to trnr įgyja specifinę erdvinę struktūrą, dvimatėje erdvėje atrodančią kaip dobilo lapas (8 pav.). Šiai antrinei struktūrai yra būdingi 5 regionai: akceptinis stiebas, D domenas, antikodoninis domenas, variabili kilpa ir T domenas. 8 pav. Schematinis dobilo lapo vaizdas trnr funkcijai ypač svarbios dvi nesuporuotų nukleotidų vietos: vienoje iš jų yra nukleotidų tripletas, vadinamas antikodonu, o kitoje CCA seka. trnr molekulės akceptinis stiebas yra sudarytas apytikriai iš septynių bazių porų ir aminorūgščių prisirišimo vietos, esančios 3 akceptinio stiebo gale tai CCA seka. Atitinkama aminorūgštis rišasi kovalentiškai prie trnr galinio adenozino 3 - arba 2 - OH- galo. Antikodoninis domenas susideda iš antikodoninio stiebo (5 bazių poros) ir kilpos. Antikodone esančios bazės yra komplementarios kodono bazėms mrnr molekulėje. T domenas susideda iš T stiebo (5 bazių poros) ir T C kilpos. T C kilpa yra vadinama taip dėl joje esančio timino nukleotido, kuris yra randamas DNR ir trnr molekulėse, bet jo

nėra kitose RNR rūšyse. T C kilpoje visada būna minorinis nukleotidas pseudouridinas. Manoma, kad ši kilpa svarbi sąveikai su ribosoma. D domenas yra sudarytas iš D stiebo (4 bazių poros) ir D kilpos. D kilpa yra labai svarbi fermentų, kurie prisijungia prie aminorūgščių, (aminoacil-trnr sintetazė, transferazė) atpaţinimo vieta. D kilpoje yra dihidrouridinas. Maţoji kilpa vadinama variabilia, nes jos ilgis įvairiose trnr molekulėse nevienodas. Variabili kilpa išsikiša apie 45 laipsnių kampu į trnr L formos plokštumą. Tarp antrinės struktūros kilpų susidaro vandeniliniai ryšiai, dėl kurių trnr įgauna dar kompaktiškesnę tretinę L-formos konformaciją (9 pav.). Antrinės struktūros kilpos D ir T C svarbios universalios trnr tretinės struktūros susidarymui. trnr biologinę funkciją ir lemia ši tretinė struktūra. Joje aktyviai veikia dvi nesuporuotos nukleotidų vietos, t. y. antikodonas ir 3 gale esanti CCA seka. 9 pav. trnr tretinė struktūra. Aminoacil-tRNR-sintetazės Universalus genetinis kodas yra realizuojamas vienos pagrindinės biocheminės reakcijos metu. Ši reakcija tai trnr molekulės aminoacilinimas, kurią katalizuoja specifiniai fermentai aminoacil-trnr-sintetazės (ARSazės). Kiekvienai aminorūgščiai egzistuoja viena ARSazė ir viena trnr. trnr aminoacilinimo reakcijoje dalyvauja viena iš 20-ies ARSazių, kurių kiekviena yra specifinė tik vienai aminorūgščiai. Tačiau yra ir išimčių. ARSazės tai 20-ties fermentų šeima, atliekanti panašias funkcijas, tačiau pasiţyminti skirtingu specifiškumu substratui. Viena ypatingų šių fermentų savybių yra ta, kad juos sudaro skirtingas skaičius įvairaus dydţio subvienetų. ARSazės gali būti ir monomerai, ir