IN SILICO PAREMTA 5-VINILSULFONAMIDO TETRAZOLO SINTEZĖ, GRYNINIMAS IR ANALIZĖ

Transcription

1 LIETUV VEIKAT MKLŲ UIVEITETA FAMACIJ FAKULTETA VAITŲ CEMIJ KATEDA GETA PAPLAUKAITĖ I ILIC PAEMTA 5-VIILULFAMID TETAZL ITEZĖ, GYIIMA I AALIZĖ Magistro baigiamasis darbas Darbo vadovas prof. dr. iliaras odovičius KAUA, 2017

2 2 LIETUV VEIKAT MKLŲ UIVEITETA FAMACIJ FAKULTETA VAITŲ CEMIJ KATEDA TVITIU: Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis, Data 2017 I ILIC PAEMTA 5-VIILULFAMID TETAZL ITEZĖ, GYIIMA I AALIZĖ Magistro baigiamasis darbas Darbo vadovas Prof. dr. iliaras odovičius, Data 2017 ecenzentas Data 2017 Darbą atliko Magistrantė Greta Paplauskaitė, Data 2017 KAUA, 2017

3 3 TUIY ATAUKA... 5 UMMAY... 7 ATUMP... 9 ĄVK ĮVADA LITEATŪ APŽVALGA Tetrazolų struktūra ir jų fizikocheminės savybės truktūra ir tautomerizacija ūgšties-bazės savybės Tetrazolai kaip bioizosterai Tetrazolų biologinis aktyvumas bei panaudojimas Duomenų bazės PubChem duomenų bazė PubChem duomenų bazės pritaikymas virtualiai atrankai ID, CID ir AID truktūros paieška truktūrų parsisiuntimas METDIKA Tetrazolo struktūrinio fragmento in silico tyrimų metodika audotos medžiagos ir tirpikliai Junginių sintezės metodikos Junginių analizės metodikos FT-I spektroskopija EC-M spektrometrija UV spektrofotometrija Preparatyvinė chromatografija EZULTATAI I JŲ APTAIMA... 30

4 4 1. Tetrazolo ir sulfonamido fragmentų atranka Tetrazolo sintezė Junginių analizės rezultatai FT-I spektroskopijos rezultatai EC-M analizės rezultatai UV spektrofotometrijos analizės rezultatai Preparatyvinės chromatografijos analizės rezultatai IŠVAD LITEATŪ ĄAŠA PIEDAI... 48

5 5 ATAUKA Magistro baigiamąjį darbą, tema In silico paremta 5-vinilsulfonamido tetrazolo sintezė, gryninimas ir analizė, atliko Greta Paplauskaitė. Darbo vadovas prof. dr. iliaras odovičius. Darbo atlikimo vieta Lietuvos veikatos Mokslų universitetas, Farmacijos fakultetas, Vaistų chemijos katedra, Kaunas. Darbo tikslas sintezuoti tetrazolo struktūrinį fragmentą, remiantis in silico parametrais. Darbo uždaviniai: 1. ptimizuoti tetrazolo struktūrinį fragmentą, remiantis in silico atliktais tyrimais. 2. Atlikti PubChem duomenų bazės tetrazolo žiedą turinčių darinių kiekybinę analizę. 3. intetinti 5-vinilsulfonamidtetrazolą, atlikti jo gryninimą ir analizę. 4. emiantis 5-vinilsulfonamidtetrazolo fragmentu sukurti virtualią biblioteką in silico. Tyrimo metodika: ustatant tetrazolo, kaip struktūrinio fragmento, parametrus in silico, buvo panaudoti šie programiniai paketai: Jchem for excel; chrodinger; chrodinger modulis Canvas; Interactive enumeration, Instant Jchem. Junginių struktūrų paieškai naudotas PubChem paieškos įrankis. Virtuali biblioteka sukurta naudojantis Maestro chrodinger Interactive Enumeration paketu. Atlikta junginių sintezė ciklizacijos bei adicijos metodu.vykdytas galutinio produkto gryninimas preparatyvinės chromatografijos pagalba. Gautų produktų tapatybei ir grynumui nustatyti buvo atliekama FT-I, UV ir M spektrų analizė. Tyrimo rezultatai: apskaičiuoti struktūrinių fragmentų parametrai in silico, jie analizuoti bei sudaryta biblioteka, iš kurios pasirinktas junginys sintezei. Pirmos pakopos sintezės metu gautas junginys 5-aminotetrazolas, vėliau antrosios pakopos metu iš šio produkto sintezuotas 5- vinilsulfonamido tetrazolas. intezuoto junginio grynumas - 95 %. Tyrimo išvados: emiantis in silico rezultatais buvo aptimizuotas tetrazolo struktūrinis fragmentas. ustatyta, kad tetrazolas, turintis sulfanilamido fragmentą, lyginant su tetrazolu bei 5- aminotetrazolu, turi pagerintą Log, LogP, LogD, pk a, pk b, PA. Be to, tetrazolo sulfanilamido junginys turi geresnes minėtas reikšmes esant skirtingoms p reikšmėms. Atlikus PubChem duomenų bazės junginių, turinčių struktūrinę tetrazolo žiedą kiekybinę analizę, nustatyta, kad iš substruktūrų tik 533 substruktūros turi pagerintą, tetrazolo sulfanilamido fragmentą. Papildomų struktūrinių kriterijų paieška parodė, jog 5-vinilsulfonamidtetrazolo nebuvo rasta. intezuotas pasirinktas 5-vinilsulfonamidtetrazolas, gauta 65% išeiga, atlikus preparatyvinę chromatografiją nustatytas 95% grynumas. Šis junginys buvo susintezuotas pirmą kartą, literatūros apie jį nerasta. Dėl 5-vinilsulfonamidtetrazolo hidrofiliškumo įprastais analizės metodais bei keičiant kolonėles (stacionarias fazes ir fizinius parametrus) nebuvo galima identifikuoti, junginys išsiplauna su tuščiu

6 6 kolonėlės tūriu. Tuomet buvo taikyta derivatizacijos reakcija su benzoilchloridu, buvo stebima atskirta junginio smailė, sulaikymo trukmė 14,823 min. 5-vinilsulfonamidtetrazolo fragmento įvedimas į in silico sukurtą junginių biblioteką, dėl savo struktūrinių ypatumų, išreikšto didesnio Log, LogP, LogD ir kitų fizikochemininių parametrų, potencialiai pagerina ADME parametrus.

7 7 UMMAY Master thesis of Greta Paplauskaitė In silico driven synthesis of 5-vinylsulfonamide tetrazole. Tutor iliaras odovičius, professor, Ph.D. Lithuanian University of ealth ciences, faculty of Pharmacy, department of Drug Chemistry. Aim of study: to perform synthesis of tetrazole structural fragment based on in silico. tudy objectives: 1. To depick tetrazole structural fragment based on in silico parameters. 2. To accomplish quantitative analysis of depickted tetrazole ring derivatives in PubChem database. 3. To synthesize 5-vinylsulfonamidtetrazole, perform purification and analysis. 4. To design virtual library in silico based on 5-vinylsulfonamidtetrazole fragment. tudy methods: in determining the tetrazole as a structural fragment parameters in silico, were used following software packages: Jchem for excel; chrodinger; chrodinger Canvas; Instant Jchem. In search for structures of compounds used PubChem search tool. Virtual library created with Maestro chrodinger Interactive Enumeration package. ynthesis of compounds were done by cyclization and addition reactions. Purification of the final product conducted by preparative chromatography. The final product structiure and purity was confirmed by means of FT-I, UV and LC-M analitic methods. tudy results: the parameters of structural fragments in silico was calculated, analyzed and composed virtual library, from which the compound for the synthesis was selected. The first step the intermidiate 5-aminotetrazole was synthetized by cyclization. Further reaction with ethenesulfonyl fluoride yielded target 5-vinylsulfonamidtetrazole. The purity after preparative purification of the final product was 95%. Conclusions: on the basis of parameters in silico, tetrazole structural fragment was optimized. In silico results showed that tetrazole with sulphanilamide fragment, comparing with tetrazole and 5- aminotetrazole, has improved Log, LogP, LogD, pk a, pk b, PA. Furthermore, sulphanilamide tetrazole compound has improved above mentioned meaning at different p values. After structural quantitative analysis in PubChem database, there was found substructures of witch only 533 substructures has improved sulphanilamide tetrazole moiety. Additional criteria for structural analysis showed that 5-vinylsulfonamidtetrazole hasn t been found. The synthesis of 5- vinylsulfonamidtetrazole was achieved in 65% yield, after preparative chromatography obtained 95% purity. This compound has been synthesized for the first time. Because of 5-vinylsulfonamidtetrazole hydrophilicity by conventional methods of analysis and by changing the colums (stationary phase and physical parameters) it was not possible to identify, compound elutes with the empty volume of the column. There was applied derivatization reaction with benzoyl chloride, it was observed the peak separation of

8 8 the compound, retention time 14,823 min. 5-vinylsulfonamidtetrazole fragment introduction into the in silico generated library of compounds, due to its structural features, expressed improved Log, LogP, LogD and others physico chemical parameters, pottentially improved ADME parameters.

9 9 ATUMP pk a rūgšties disociacijos konstanta, rūgštingumo konstanta, apibūdina vandenilio jonų atskilimo laipsnį nuo vandenyje ištirpusios rūgšties. Ϭp polinės jėgos parametras, π pakaitų hidrofobiškumo rodiklis, M molekulinis refraktyvumas Å angstremas, ilgio matavimo vienetas, lygus metro, juo matuojami atomų dydžio objektai. FT-I Furje transformuota infraraudonųjų spindulių spektrometrija. EC-M efektyvioji skysčių chromatografija-masių spektometrija. M/M tandeminė masių spektrometrija. m/z masės-krūvio santykis UV ultravioletinė spinduliuotė

10 10 ĄVK Tautomerija dinaminė izomerija, rėiškinys, kai vienas tautomeras lengvai virsta kitu ir tarp jų nusistovi pusiausvyra. Bioizosterai tai pakaitai ar grupės, kurie suteikia panašias biologines savybes cheminiui junginiui. Planarinė struktūra struktūra plokštumoje. Duomenų bazė tai organizuotas duomenų rinkimas bet kurioje srityje. PubChem yra vieša informacijos apie chemines medžiagas ir jų biologinį aktyvumą saugykla, sukurta 2004 metais kaip JAV acionalinio sveikatos instituto dalis. Entrez CBI publikacijų paieškos sistema.

11 11 ĮVADA eterocikliniai junginiai, savo struktūroje turintys kelis azoto atomus, yra mokslininkus dominantis objektas dėl savo ypatingų savybių. Šie junginiai itin lipofiliški bei pasižymi plačiu biologiniu aktyvumu. Vienas iš tokių junginių tetrazolas, penkianaris žiedas, savo struktūroje turintis net 4 azoto atomus. usidomėjimas tetrazolų molekuline struktūra, fizikocheminėmis savybėmis ir pritaikymu nuolat auga [1]. Pirmasis tetrazolas buvo susintetintas 1885 metais švedų mokslininko J.A. Bladin o, Upsalos universitete vykdant cianogeno ir fenilhidrazino kondensacijos produkto dicianofenilhidrazino reakcijų tyrimus [2]. Vėliau tyrinėjant šį junginį buvo atrastos įvairios savybės, suteikiančios jam unikalumą. Tetrazolo žiedas egzistuoja dvejomis tautomeriškomis formomis, pasižymi ir rūgštinėmis, ir bazinėmis savybėmis. Taip pat jis yra ne klasikinis karboksirūgšties bioizosteras. Šios savybės atradimas paskatino mokslininkus dar labiau susidomėti tetrazolo struktūrinio fragmento pritaikymo galimybėmis vaistinių medžiagų sintezėje [3]. Šios įvairios unikalios fizikocheminės tetrazolo savybės bei platus tetrazolo darinių biologinis aktyvumas paskatino pasirinkti šį fragmentą virtualios bibliotekos kūrimui ir sintezei. Darbo tikslas sintezuoti tetrazolo struktūrinį fragmentą, remiantis in silico parametrais. Darbo uždaviniai: 1. ptimizuoti tetrazolo struktūrinį fragmentą remiantis in silico atliktais tyrimais. 2. Atlikti PubChem duomenų bazės tetrazolo žiedą turinčių darinių kiekybinę analizę. 3. intetinti 5-vinilsulfonamidtetrazolą, atlikti jo gryninimą ir analizę. 4. emiantis 5-vinilsulfonamidtetrazolo fragmentu sukurti virtualią biblioteką in silico.

12 LITEATŪ APŽVALGA 1. Tetrazolų struktūra ir jų fizikocheminės savybės 1.1. truktūra ir tautomerizacija 12 Tetrazolas tai penkianaris poliazo junginys su dvigubai neprisotintu žiedu, kurį sudaro vienas anglies ir keturi azoto atomai [4]. Patys tetrazolai gali egzistuoti dvejomis tautomeriškomis formomis I, kur vandenilio atomas yra prie 1 azoto (1-tetrazolas) bei II, kur vandenilio atomo pozicija yra prie 2 azoto (2-tetrazolas). Abu tautomerai pavaizduoti 1 paveikslėlyje, b dalyje [5]. Šios dvi formos tirpaluose egzistuoja pusiausvyroje. Jų santykis kiekviename tirpale priklauso nuo tirpiklio poliariškumo bei pakaito, esančios 5 padėtyje, prigimties, jo savybių [6]. 2-tetrazolas yra stabilesnis už tautomerinę 1-tetrazolo formą [7]. Del esamos tautomerijos yra žinomi mono- ir disubstituoti tetrazolų dariniai. Be to, tetrazolo žiedas gali įeiti į kondensuotų heterociklinių junginių struktūras [5]. 4 1 a) 5 2 b) 3 I II 1 pav. Tetrazolo žiedo numeracija ir tautomerizacija a) Pavaizduota tetrazolo IUPAC nomenklatūrinė numeracija. Žiedas numeruojamas parodant žemiausią heteroatomų (azoto) poziciją [8]. b) Pateiktos 1-tetrazolo (I) bei 2-tetrazolo struktūros (II). Ši heteroaromatinė sistema turi didžiausią galimą azoto atomų skaičių po pentazolo, kurį sudaro net penki azoto atomai [9]. Pentazolo struktūra pavaizduota 2 paveikslėlyje. Būtent dėl didelio azoto atomų skaičiaus savo struktūroje tetrazolai demonstruoja ekstremalias rūgštingumo, bazingumo ir kompleksų susidarymo konstantų reikšmes [10]. 2 pav. Pentazolo struktūra Ši heteroaromatinė struktūra turi didžiausią galimą azotų skaičių.

13 ūgšties-bazės savybės ūgštingumas. Tetrazolai yra heterociklinės rūgštys, kurių pk a reikšmių diapazonas yra nuo 1 iki 7 p vienetų. Atsižvelgiant į prototropinę tautomerizaciją, tetrazolų disociacija pavaizduota 3 paveikslėlyje [11]. 2 + K T + 2 K a1 K a T - 3 pav. ūgštinė tetrazolų disociacija K a1 ir K a2 yra 1 ir 2 tautomerų disociacijos konstantos, T - yra tetrazolo anijonas. Pakaito, pridėto prie žiede esančio anglies atomo, pobūdis turi lemiamą poveikį tetrazolų rūgštingumui [11]. Pats tetrazolas [12] yra vidutinio stiprumo rūgštis. Apibendrinant galima būtų pastebėti, kad 5 padėtyje substitutų tetrazolų pk a reikšmės panašios į karboksilinių rūgščių reikšmes [11]. Baziškumas. Tetrazolai yra silpnos organinės bazės ir yra protonizuojamos, kai ištirpinamos rūgštyse. Protono prisijungimo vieta yra sunkiai prognozuojama, kadangi tetrazolo žiedas turi keletą potencialių protono prisijungimo centrų. Tetrazolų disociacija rūgštyse pavaizduota 4 paveikslėlyje pav. Bazinė tetrazolų disociacija Paveikslėlyje pavaizuota kaip tetrazolo žiedas protonizuojamas jį ištirpinus rūgštyse. Tetrazolo žiede 1 arba 4 pozicijose esantys azoto atomai gali būti protonizacijos centrais, priklausomai nuo to, kur elektronų tankio pasiskirtymas tetrazolo žiede yra maksimalus [13, 14]. Protonizacijos vieta taip pat gali priklausyti nuo pakaitų, esančių žiede, pobūdžio bei padėties [11].

14 14 2. Tetrazolai kaip bioizosterai Bioizosterai tai pakaitai ar grupės, kurie suteikia panašias biologines savybes cheminiui junginiui. Bioizosterai gali būti skirstomi į klasikinius ir neklasikinius. Abiejų grupių pavyzdžiai pateikiami 5 paveikslėlyje. Klasikiniai bioizosterai yra skirstomi į monovalenčius (D ir ; F ir ; ir ; ir ; F,, 2 ir C 3 ; Cl, Br, ir ; C ir i), bivalenčius (C=C, C=, C=, C=; C2,,, ; C', C', C', C') ir trivalenčius (3C, 3; 4C, 4i, 4+; alkenai, iminai; C=C, ; C= I =C). e klasikiniai bioizosterai gali būti skirstomi į ciklinius ir neciklinius. Be to, ne klasikiniai izosterai taip pat gali turėti keičiamosios grupės izosterizmą, kuriame atskirų funkcinių elementų savybės yra vienos kitą pamėgdžiojančios [15]. Bioizosterai Klasikiniai bioizosterai e klasikiniai bioizosterai Monovalenčiai Bivalenčiai Trivalenčiai Cikliniai ir necikliniai Keičiamos grupės izosterizmas 5 pav. Bioizosterų grupės Paveikslėlyje pateikiama bioizosterų klasifikacija. Vieno bioizostero keitimo kitu tikslas sureguliuoti bioaktyvių juginių farmakokinetines ir farmakodinamines savybes [10]. Vienas iš dažniausiai vykdomų monovalentinių izosterinių mainų yra vandenilio keitimas fluoru, siekiant pagerinti metabolinį stabilumą. Klasikinis tokių mainų pavyzdys yra antineoplastinis vaistas 5-fluorouracilas (5-FU). Vandenilio pakeitimas fluoru taip pat pritaikytas ir kondensuotuose naftildiazepinuose. Šie minėti izosteriniai mainai pavaizduoti 6 paveikslėlyje [16].

15 15 a) F 3C 3C b) F 6 pav. Monovalentiniai izosteriniai mainai Paveikslėlyje pavaizduotas vandenilio pakeitimas fluoru a) 5-fluorouracilo molekulėje; b) naftildiazepino molekulėje. Daugelio klasikinių bioizosterinių junginių cheminis ir fizinis panašumas yra akivaizdus, pvz. vandenilis ir fluoras, esteris ir amidas, fenilas ir tiofenas, tačiau yra nemažai ne klasikinių bioizosterinių pakaitų, kurie neturi fizikocheminių panašumų [10]. Bioizosterinių junginių panašumas pavaizduotas 7 paveikslėlyje. a) F b) c) 7 pav. Bioizosterinių junginių panašumas Paveikslėlyje vaizduojamas klasikinių bioizosterinių junginių panašumas: a) vandenilio ir fluoro; b) esterio ir amido; c) fenilo ir tiofeno. Tetrazolais mokslininkai susidomėjo dėl jų neklasikinio bioizosteriškumo vienam iš dažniausiai naudojamų fragmentų karboksilo [3]. 1 lentelėje pateikiamas fizikocheminių savybių karboksigrupės ir jos anijoninio darinio su tetrazolu, neutralios bei anijoninės būklės, palyginimas.

16 1 lentelė. Karboksilinės rūgšties ir tetrazolo fizikocheminių savybių palyginimas [16] Ϭp polinės jėgos parametras, π pakaitų hidrofobiškumo rodiklis, M molekulinis refraktyvumas. Bioizosterai Ϭp π M 16 0,45-0,32 6,9 0,00-4,36 6,0 0,56-0,48 15,6 0,35-3,55 14,6 Tetrazolai yra jonizuoti esant fiziologiniam p ir eksponuoja planarinę struktūrą kaip ir karboksirūgštis. Tačiau buvo nustatyta, kad anijoniniai tetrazolai yra beveik 10 kartų lipofiliškesni nei atitinkami karboksilatai, nors turi panašų rūgštingumą [17]. Be to, tetrazolo radikalas yra metaboliškai stabilesnis nei pati karboksigrupė. Planarinės tetrazolo žiedo bei šios rūgšties struktūros pateikiamos 8 paveikslėlyje. + 2,6 Å 2,2 Å 8 pav. Karboksirūgšies ir tetrazolo žiedo planarinės struktūros Paveiklėlyje pateikiamas karboksirūgšties ir tetrazolo žiedo struktūrinis panašumas. 3. Tetrazolų biologinis aktyvumas bei panaudojimas Tetrazolų dariniai gana plačiai naudojami medicinoje. Vienas pirmųjų medicininių preparatų, turinčių savo struktūroje tetrazolo fragmentą, gana plačiai naudotas, buvo ciklopentametilentetrazolas (Corazole) [18]. Kiti pavadinimai: pentyleno tetrazolas, kardiazolas, metrazolas.

17 17 Ciklopentametilentetrazolas yra prototipinis anksiogeninis vaistas [19]. Žmonių farmakoterapijoje jis buvo naudojamas kaip prieštraukulinis vaistas, bet vėliau buvo atrasta, jog šis preparatas terapinėmis dozėmis sukelia nerimą ir panikos priepuolius [20 22]. Šio junginio struktūra pavaizduota 9 paveikslėlyje. 9 pav. Ciklopentametilentetrazolas Paveikslėlyje pavaizduotas vienas pirmųjų medicininių preparatų, turinčių savo struktūroje tetrazolo fragmentą (Corazole). Tetrazolai dažniausiai naudojami kaip metabolizmui atsparūs izosteriniai karboksirūgščių pakaitalai. Jie yra atsparūs biologinei degradacijai. Ši savybė leidžia naudoti tetrazolus kaip izosterinius įvairių funkcinių grupių pakaitus kuriant naujus biologiškai aktyvius junginius. Tetrazolo motyvas buvo naudotas įvairių vaistų farmakoforų sintezei, kaip tinkamas karboksirūgščių fragmento pakaitas, naudojant skirtingus metodus sintezei bei skirtingas reakcijų sąlygas [10]. ors tetrazolų junginiai tik labai retais atvejais randami natūraliai gamtoje, tačiau tetrazolų dariniai pasižymi labai įdomiomis farmakologinėmis bei biologinėmis savybėmis ir plačiu biologiniu aktyvumu. Iki šiol daugelis tetrazolo pagrindą turinčių darinių, buvo sėkmingai ištirti, praėjo klinikinius tyrimus arba yra jų ketvirtoje fazėje bei pradėti vartoti klinikinėje praktikoje. Keletas jų pavyzdžių antihipertenzinis vaistas losartanas [23], antibakterinis preparatas ceforanidas [24], antikoaguliantas cilostazolis [25], priešastminis preparatas pranlukastas [25], diuretikas azosemidas [26] ir skausmą blokuojantis alfentanilis [27]. Šių vaistų struktūros pavaizduotos 10 paveikslėlyje.

18 18 2 Losartanas Cl Ceforanidas Cilostazolis Pranlukastas 2 Cl Azosemidas Alfentanilis 10 pav. Įvairaus biologinio aktyvumo vaistai, turintys savo struktūroje tetrazolo fragmentą Paveiksle pavaizduoti junginiai pasižymi tokiu biologiniu aktyvumu: losartanas antihipertenziniu, ceforanidas antibakteriniu, cilostazolis antikoaguliaciniu, pranlukastas priešastminiu, azosemidas diuretiniu bei alfentanilis skausmą blokuojančiu aktyvumu.

19 19 Be to, nemažai tetrazolo darinių yra pradinėse klinikinių tyrimų stadijose. eseniai atliktas tyrimas su 5-(o-tolyl)-1 tetrazolo dariniais, kur buvo vertinti šių junginių tyrimų rezultatai in vivo su gyvūnais. ezultatai parodė, jog kai kurie šios grupės junginiai pasižymi geru prieštraukuliniu aktyvumu, ypač aktyvūs ir mažai toksiški buvo 1-(3-fluorobenzyl)-5-(o-tolyl)-1 tetrazolas bei 1-(2- methylbenzyl)-5-(o-tolyl)-1 tetrazolas. Šie junginiai gali būti toliau modeliuojami, modifikuojami ir tiriami, siekiant sukurti dar aktyvesnius analogus [28]. Minėti junginiai pavaizduoti 11 paveikslėlyje. a) b) F 11 pav. 5-(o-tolyl)-1 tetrazolo dariniai a) 1-(3-fluorobenzyl)-5-(o-tolyl)-1 tetrazolas; b) 1-(2-methylbenzyl)-5-(o-tolyl)-1 tetrazolas 4. Duomenų bazės Duomenų bazė tai organizuotas duomenų rinkimas bet kurioje srityje. Mokslinės duomenų bazės kaupia ir sistemina mokslinę informaciją iš mokslinių, apžvalginių straipsnių, konferencijų, atvejų ataskaitų, publikuojamų profesionaliuose žurnaluose, patentų bei informaciją iš kitų platformų. Duomenų bazės suteikia informaciją apie temas, autorius, talpina straipsnių santraukas, leidinių pavadinimus ir tipus bei nuorodas [29]. Šias duomenų bazes kuria įvairios institucijos, tokios kaip profesionalios cheminės organizacijos (Chempider), akademinės įstaigos (ZIC), ar viešosios visuomenės pelno nesiekiančios (Vikipedija). Tik rinkti duomenis nepakanka, taip pat labai svarbu užtikrinti, kad tie duomenys būtų teisingi. Viešose duomenų bazėse tai daroma peržiūrint duomenis, atnaujinant ir taisant klaidas bei validuojant (formalios tyrimo procedūros skirtos įvertinti, ar tam tikri duomenys yra teisingi). Vartotojų pateikti šaltiniai, tokie kaip Vikipedija yra sunkiai kuruojami. Techniškai kontroliuojamos duomenų bazės, tokios kaip PubChem yra geriau kontroliuojamos (pvz. automatiškai tikrinama, kad anglies atomai neturėtų daugiau nei keturių jungčių) [30].

20 PubChem duomenų bazė PubChem ( yra vieša informacijos apie chemines medžiagas ir jų biologinį aktyvumą saugykla, sukurta 2004 metais kaip JAV acionalinio sveikatos instituto dalis (part of the Molecular Libraries and Imaging (MLI) component of the ational Institutes of ealth (I) oadmap for Medical esearch initiative) [31]. Pastaruosius vienuoliką metų ši duomenų bazė išaugo į gana didelę sistemą, veikiančią kaip cheminės informacijos šaltinis mokslinių tyrimų bendruomenei. PubChem sudaro trys tarpusavyje susijusios duomeų talpyklos Medžiagos (PubChem ubstance), Junginiai (PubChem Compound) ir Bioaktyvumas (PubChem BioAssay). PubChem duomenys yra teikiamos iš daugiau nei 500 tiekėjų ( įskaitant universitetų laboratorijas, valstybines organizacijas, farmacines kompanijas, cheminių medžiagų pardavėjus, leidėjus ir daugelį kitų cheminių, biologinių šaltinių. Duomenys, patvirtinti šių šaltinių apima ne tik mažas molekules, bet ir si, mi, angliavandenius, lipidus, peptidus, cheminiu būdu modifikuotas makromolekules ir pan. PubChem duomenų organizacija pavaizduota 12 paveikslėlyje [32]. Ši pateikta schema parodo duomenų tėkmę tarp trijų pagrindinių duomenų bazių. 12 pav. Duomenų organizacija PubChem duomenų bazėje Šioje schemoje parodomi duomenų srautai tarp trijų pagrindinių talpyklų.

21 21 PubChem Medžiagos (PubChem ubstance) duomenų bazė talpina cheminių mėginių aprašus, depozitorių patvirtintus duomenis ir nuorodas duomenis apie biologinį aktyvumą. Aprašai turi PubChem Junginių identifikatorius (CID), jei junginių cheminė struktūra yra gerai žinoma. uorodos į biologinio aktyvumo informaciją apima PubMed ( citatas, baltymų 3D struktūras[33], nuorodas į tiekėjų internetinius puslapius ir biologinių testų rezultatus, esančius PubChem Bioaktyvumo duomenų bazėje. PubChem Junginių duomenų bazė talpina unikalių cheminių struktūrų informaciją iš PubChem Medžiagų duomenų bazės. Junginiai gali būti ieškomi pagal apskaičiuotas chemines savybes ir yra suskirstyti pagal struktūros sugretinimą, atsižvelgiant į tapatumą bei panašumą. Kur tik įmanoma, pateikiamos nuorodos per PubChem Medžiagų duomenų bazę į jų biologinio aktyvumo informaciją PubChem duomenų bazės pritaikymas virtualiai atrankai PubChem duomenų bazė siūlo visapusišką cheminę informaciją, naudingą vaistų atradimui. Ji taip pat suteikia kelias programines prieigas, kurios yra svarbios norint sukurti virtualias atrankos gaires, kurios padėtų išnaudoti PubChem duomenis. PubChem esantys duomenis apie biologinį junginių aktyvumą, informacija apie jų farmakologiją, toksikologiją, veikimo mechanizmus, 3D struktūros visa ši informacija padeda vaistų paieškos pradinėse stadijose. Ypač naudinga informacija apie cheminių medžiagų tiekėjus ir patentus, ji padeda atsirinkti dominančius junginius tolimesnei atrankai. Ši duomenų bazė naudota daugelyje studijų vaistų paieškoje. Pavyzdžiui, PubChem bioaktyvumo duomenys buvo panaudoti apskaičiuoti bioaktyvumą, toksiškumą arba atrasti polifarmakologinius, kelis taikinius turinčius ligandus. Kai kuriuose tyrimuose buvo naudojami parengti duomenų rinkiniai, kurie leido objektyviai įvertinti skirtingus virtualios atrankos metodus [34] ID, CID ir AID Esminiai ryšiai tarp trijų PubChem duomenų bazių yra nesudėtingi. PubChem Medžiagų identifikatoriai (IDs) susiję su PubChem Junginių identifikatorius (CIDs) per cheminių struktūrų standartizaciją. Kiekviena standartizuota medžiaga turi atitinkamą CID, kuris yra pagrindinė tos

22 22 standartizuotos medžiagos forma, reprezentuojanti visą struktūrą. Taip pat gali būti komponento formos CIDs, kurios apima informaciją apie unikalias kovalentinių ryšių jungtis, kai medžiaga yra mikstūra arba rūgštis/bazė su krūviu ar neutralizuota forma, kai medžiaga jonizuota. Pirminiai junginiai priskiriami kiekvienam CID ui, kur tik įmanoma, pirminės organinės medžiagos identifikacijai. PubChem tyrimų identifikatoriai (AIDs) talpina aktyvumo duomenis ID ams. Jei medžiaga yra susijusi su junginiu, tyrimų rezultatai skirti ID ui gali būti netiesiogiai susiję taip pat ir su CID [31] truktūros paieška PubChem struktūros paieškos įrankis leidžia pateikti vieną užklausą pagal įvairius cheminės struktūros paieškos tipus ir pasirinktinus filtrus. Cheminės struktūros paieškos paslauga gali būti tiesiogiai atidaroma naudojant UL: [31]. Palaikomi užklausos įvesties formatai yra MILE, MAT [35], InChI, CID, molekulinė formulė ir DF [36]. Taip pat yra interaktyvios paieškos paslauga piešiant cheminę struktūrą su Javacript programa, su kuria struktūra gali būti piešiama rankiniu būdu, redaguojama ar importuojama. Piešimo programa yra suderinta su moderniomis interneto naršyklėmis ir nereikalauja specialios programinės įrangos [31] truktūrų parsisiuntimas uradus dominančias struktūras PubChem duomenų bazėje, vartotojui yra svarbu eksportuoti gautus medžiagų ar junginių duomenis iš duomenų bazės tolesnei analizei. truktūrų parsisiuntimo įrankis paruošia PubChem Medžiagų ar PubChem Junginių duomenis eksportui iš Entrez daugeliu formatų. truktūrų parsisiuntimo įrankis gali būti tiesiogiai pasiekiamas naudojant UL: audotis parsisiuntimo paslauga yra paprasta. Vartotojas tik turi atlikti paiešką pasitelkiant bet kokią Entrez kombinaciją bei PubChem specifinius paieškos įrankius, tuomet eiti į atsisiuntimo puslapį iš PubChem Medžiagos ar Junginiai Entrez Doc-um naudojant parsisuntimo nuorodą, kuri nurodoma kaip mygtukas ar disko ikona. Po to, kai vartotojas pasirenka eksporto formatą, failas, kuriame yra eksportuojami duomenys, yra paruoštas ir tuomet nurodžius parsisiuntimo vietą pateikiamas kaip UL. Labai svarbu yra suprasti, kad duomenys, gauti

23 iš PubChem Medžiagos, talpina orginalią deponuojamą informaciją, o PubChem Junginiai yra standartizuotos deponuotos struktūrinės informacijos formos [31]. 23

24 24 METDIKA 1. Tetrazolo struktūrinio fragmento in silico tyrimų metodika ustatant tetrazolo kaip struktūrinio fragmento parametrus in silico, buvo panaudoti šie programiniai paketai: Jchem for excel; chrodinger; chrodinger modulis Canvas; Interactive Enumeration, Instant Jchem. Junginių struktūrų paieškai naudotas PubChem paieškos įrankis. Virtuali biblioteka sukurta naudojantis Maestro chrodinger Interactive Enumeration paketu. 2. audotos medžiagos ir tirpikliai Aminoguanidino bikarbonatas, azoto rūgštis, natrio nitritas, natrio karbonatas, sulfato rūgštis, etanolis, 5-aminotetrazolas, trietilaminas, etensulfonilfluoridas, acetonitrilas. audoti reagentai buvo analitinio grynumo. 3. Junginių sintezės metodikos eakcijos pradžioje vykdoma aminoguanidino bikarbonato neutralizacijos reakcija azoto rūgštyje, išsiskiriant anglies dioksidui, į aminoguanidino nitrato tirpalą pridedamas natrio nitrito tirpalas, diazotinimo proceso pabaigoje tirpalo spalva pasikeičia į rudai raudoną. eakcijos mišinys veikiamas natrio karbonatu ir šildomas 4val. Karštas mišinys neutralizuojamas 30 % sulfato rūgštimi, vėstant iškrenta 5-aminotetrazolo kristalai, kurie plaunami vandeniu ir rekristalizuojami. Šios sintezės reakcijos lygtys pavaizduotos 13 paveikslėlyje.

25 25. 2C a 2, Cl 2 13 pav. 5-aminotetrazolo sintezės schema Toliau reakcija vykdoma išgrynintą 5-aminotetrazolą (0,3 g, 3,5266 mmol) ir trietilaminą (7ml) veikiant su etensulfonilfluoridu (0,58246 g, 5,2899 mmol) acetonitrile (35ml). Kaitinama val.. Produktas gryninamas preparatyvinės chromatografijos pagalba. Produktas koncentruojamas rotaciniu vakuumu. Vykdytų procesų schema pateikiama 14 paveikslėlyje. 2 + F Et 3, MeC.T h 14 pav. 5-(vinilsulfamido)-tetrazolo sintezės schema 4. Junginių analizės metodikos Gauto produkto struktūrinė ir priemaišų analizė atliekama FT-I spektroskopu, UV spektroskopu bei EC-M/M spektrometru FT-I spektroskopija Gauto junginio FT-I spektrai nuskenuoti PerkinElmer UAT Two spektrometru. Tiriant medžiagas su šiuo spektrometru, medžiagų I spindulių sugertį apibūdinantis dydis yra bangos

26 26 skaičius n (cm -1 ). PerkinElmer UAT Two spektrometro bangos skaičius apima cm -1 intervalą. Gauto produkto kristalai yra uždedami ant prietaise esančio deimanto, I spinduliuotė nukreipiama per junginį ir kompiuterinė programa užrašo gautą FT-I spektrą. Šiame spektre gauti pikai rodo tiriamo junginio molekulės vibracijas, kurių dėka yra identifikuojamos tiriamojo junginio funkcinės grupės bei pirštų atspaudų regionas. Gautas spektras yra palyginamas su pradinių medžiagų FT-I spektrais, gaunamais tuo pačiu metodu. Lyginant spektrus, nustatomos pranykusios ir naujai atsiradusios smailės, kurios leidžia daryti prielaidą apie pranykusias ar atsiradusias funkcines grupes ar papildomus ryšius tarp atomų. Tai leidžia įsitikinti, jog sintezės metu gautas reikiamas junginys, jog reakcija įvyko sėkmingai. Užrašius spektrą atliekamos smailių AT korekcijos, jas vykdyti rekomenduoja prietaiso gamintojai EC-M spektrometrija usintetinti junginiai buvo analizuojami naudojant Agilent Technologies 6530 Accurate-Mass Q-TF EC/M prietaisą (parametrai nurodyti 2 ir 3 lentelėse). Mėginių paruošimas: atsveriama 1mg junginio ir tirpinama 1ml metanolio. Gautas tirpalas yra koncentruotas, todėl papildomai praskiedžiamas, paimant 10 μl tirpalo ir skiedžiant jį 1ml metanolio. Gaunamas 10 μl/ml tirpalas, kuris filtruojamas ir injekuojamas į efektyvųjį skysčių chromatografą Agilent Technologies Infinity 1260 chromatografinei ir masių spektrometrinei analizei. Prietaiso parametrai nurodyti 2 ir 3 lentelėje. 2 lentelė. Efektyviosios skysčių chromatografijos junginių išskirstymo parametrai junginių grynumo tyrimams Parametrai Chromatografinės kolonėlės Kolonėlių temperatūra Agilent 1260 Infinity EC sistema ACE Generix C8 kolonėlė 4,6x250 mm, 5 µm; ZIC-ILIC PLC kolonėlė 4,6x150 mm, 3,5 µm, Zorbax C18 2,1 50 mm, 1,8-µm 25 C Injekavimo tūris 1-10 µl Injekavimo greitis Mobili fazė 500 µl/min Junginių grynumo tyrimai: A: 0,1% skruzdžių rūgštis (vandeninis tirpalas) B: Metanolis, turintis 0,1% skruzdžių r. (analitinio švarumo >99,5%)

27 27 Tėkmės greitis 0,25 1,25 ml/min Junginio grynumo tyrimai Laikas A: B: 0,00 min 100 % 0 % Gradientas 3,00 min 100 % 0 % 12,00 min 0 % 100 % 16,00 min 0 % 100 % 17,50 min 100 % 0 % 18,00 min 100 % 0 % Detektorius Agilent 1260 Infinity DMD, bangos ilgio intervalas nm, diapazono plotis po 1 nm, <0,0031 min (atsako laikas 0,031s), (80z) A: 254/1 nm ef. 550/100 nm B: 230/1 nm ef. 550/100 nm C: 10/1nm ef.50/100 nm D: 215/1 nm ef.550/100 nm E: 360/1nm ef. 550/100 nm F: 200/1nm ef. 550/100 nm G: 310/1 nm ef.550/100 nm : 280/1 nm ef.550/100 nm Analizės trukmė Post-analizės trukmė 18 minučių sintezuotų junginių grynumo tyrimams 10 minučių 3 lentelė. ptimizuoti 5-vinilsulfonamido masių spektrometrijos parametrai Parametrai Agilent 6530 Q-TF M sistema Jonizacija Teigiama (+), neigiama (-) Jonizacijos šaltinis Agilent Dual Jet tream elektropurkštuvinis jonizatorius (EI) Kapiliarinė įtampa 3250 V(+), V(-) Purkštuvo įtampa 250 V Fragmentatoriaus įtampa 120 V Džiovinimo dujų temperatūra 350 o C

28 28 Džiovinimo dujų tėkmė 10 l/min Purkštuvo slėgis 40 psig Apgaubiančiųjų dujų temperatūra 325 o C Apgaubiančiųjų dujų tėkmė 9 l/min M ribos m/z Kolizijos energija 0 V M registravimo dažnis 2 spektrais/s Etaloninė masė (+): 121, ir 922, Instrumento rėžimas Didelės raiškos rėžimas (4 Gz) Programinė įranga duomenų analizei: Agilent Massunter Qualitative Analysis (Qual) B.07.00; Agilent Massunter Profinder B.06.00, sp UV spektrofotometrija Tiriamojo junginio spektras nuskanuotas naudojant Agilent Technologies Cary 8454 UV-VI spektrofotometrą. Prietaise UV absorbcija yra matuojama esant nm bangos ilgiams. Mėginiai paruošiami pagal tą pačią metodiką, aprašytą EC-M spektrometrijai. Į kiuvetę įpilama metanolio, ši dedama į spektrofotometrą, kuriame užrašomas metanolio sugerties spektras, kuris yra atimamas. Po to analogiškai užrašomi tiriamųjų junginių tirpalų UV sugerties spektrai Preparatyvinė chromatografija Tiriamasis junginys grynintas preparatyvinės chromatografijos būdu naudojantis ainin preparatyvine sistema. Mėginys injekuotas rankiniu būdu. Prietaiso parametrai nurodyti 2 ir 3 lentelėje.

29 29 4 lentelė. Preparatyvinės chromatografijos parametrai junginio gryninimui Parametrai ainin preparatyvinė sistema Tėkmės greitis 20 ml/min Chromatografinė kolonėlė Delta Pak C18 21 x 250 mm, 7 µm Detektorius Frakcijų kolektorius Mobili fazė Gradientas ainin UV asorbance detektorius Preparatyvinė celė 9mm-1mm Fiksuotas bangos ilgis 215nm Gilson 203B Junginių grynumo tyrimai: A: 0,1% skruzdžių rūgštis (vandeninis tirpalas) B: Metanolis, turintis 0,1% skruzdžių r. (analitinio švarumo >99,5%) Junginio grynumo tyrimai Laikas A: B: 0,00 min 100 % 0 % 15,00 min 100 % 0 % 75,00 min 0 % 100 % 90,00 min 0 % 100 % 100,00 min 100 % 0 % 115,00 min 100 % 0 % Programinė įranga duomenų analizei: Chromatography CD 2000.

30 30 EZULTATAI I JŲ APTAIMA 1. Tetrazolo ir sulfonamido fragmentų atranka Junginių biblioteka kurta remiantis tetrazolo struktūriniu fragmentu dėl jau minėtų unkialių poliazo žiedo fizikocheminių savybių. Dvivalentės sieros fragmentas dažnai randamas biologiškai aktyviuose junginiuose, bet siera su aukštesnio laipsnio valentingumu, pvz., šešiavalentė, kur kas rečiau. Tačiau toks didesnio valentingumo fragmentas turi papildomų ypatybių, gali sudaryti papildomus vandenilinius ryšius su biologiniais taikiniais bei formuoja erdvinę molekulės konformaciją. Aptartos ypatybės pavaizduotos 15 paveikslėlyje. 15 pav. Šešiavalentės sieros ypatybės Kairėje paveiksliuko dalyje pavaizduoti sieros sudaromi vandeniliniai ryšiai, dešinėje 3D struktūra. Šie faktoriai paskatino junginių bibliotekos kūrimui pasirinkti tetrazolo fragmentą ir šešiavalentį sulfonilo fragmentą, norint susintezuoti mažai ištyrinėtą junginį. Be to, vinilo grupės prijungimas prie tokio junginio praplečia cheminių reakcijų įvairovę. ulfanilamido tetrazolo fragmento įterpimas įterpimas į virtualią biblioteką praplečia struktūrinį diversiškumą bei potencialiai suteikia virtualiai bibliotekai pagerintas ADME savybes, t. y. pagerintą tirpumą (žemesnis LogP rodiklis), geresnį praeinamumą per biologines membranas, geresnį pasiskirstymą organizmo audiniuose ir pan. 4 lentelėje yra tirpumo parametrai esant skirtingam p, 5 lentelėje pateikta fizikocheminiai parametrai, svarbūs ADME savybių įvertinimui.

31 31 4 lentelė. Tetrazolo fragmentų tirpumo parametrų palyginimas Fragmento struktūra LogD (p=7) LogD (p=5) LogD (p=9) Log (p=7) Log (p=5) Log (p=9) Log -2,35-1,16-2,46 2,28 0,68 2,28 0,27-2,25-1,26-3,01 1,09 0,59 1,09-0,94-2,36-1,18-2,96 1,14-0,36 1,46-0,53 5 lentelė. Tetrazolo fragmentų fizikocheminiai parametrai Fragmento struktūra otacinių jungčių skaičius Vandenilio akceptorių skaičius Vandenilio donorų skaičius pk a pk b PA (p=2) PA (p=7) PA (p=9) ,81-0,85 54,46 51,56 51, ,54 0,04 80,48 77,58 77, ,34-0,9 100,63 97,73 97,73 Iš pateiktų duomenų galima matyti, jog pereinant nuo tetrazolo struktūros link sulfonilamido tetrazolo struktūros, esant skirtingiems fiziologiniems p, tirpumo parametrai gerėja. Taip pat 5

32 Junginių skaičius 32 lentelėje matyti, jog gerėja ne tik tirpumo parametrai, bet ir fizikocheminiai rodikliai, kurie atitinka keliamus ADME kriterijus. PubChem duomenų bazėje struktūros paieškos įrankyje nupiešiame savo pasirinktas struktūras bei išfiltruojame esančius substruktūrų duomenis pagal juos. ubstruktūra tai junginio pamatinis fragmentas. Jis atsikartoja visuose išfiltruotuose junginiuose. upiešus tetrazolo žiedą, duomenų bazė randa substruktūras, nupiešus 5-aminotetrazolą randami junginiai. Prijungus sulfonamido grupę prie trazolo žiedo randami 630 junginių, o eteno sulfonamido 533 substruktūros. Tačiau identiškos 5-vinilsulfonamido tetrazolo struktūros PubChem duomenų bazėje nebuvo rasta. 16 paveikslėlyje pavaizduota išfiltruotų junginių diagrama truktūros paieškoje naudotas fragmentas 16 pav. Išfiltruotų junginių diagrama Diagramoje pavaizduota, kiek junginių pateikė PubChem duomenų bazės paieškos sistema pagal pasirinktus fragmentus.

33 33 5-aminosulfonamido tetrazolo pagrindu sugeneruotoje virtualioje junginių bibliotekoje yra daugiau nei junginių. ors biblioteką sudaro diversifikuotos cheminės struktūros, tačiau dėl sulfonilamidtetrazolo fragmento biblioteka pasižymi geresniais ADME parametrais. Šios in silico bibliotekos fragmentas pateikiamas 17 paveikslėlyje. = -Me, -Et, i-pr, n-pr, i-bu, n-bu, -CF 3, -CF 3, -, - 2, -, -F, -Cl, -Br, -I, - 2 2, -, -C2, -C2Alk, -Alk, -2, -3; 17 pav. Virtuali biblioteka 5-aminosulfonamido tetrazolo pagrindu Viduryje pateikiamas pasirinktas struktūrinis fragmentas, pagal kurį kurta virtuali biblioteka.

34 34 2. Tetrazolo sintezė 40% ir 65%. usintetinti du junginiai: 5-aminotetrazolas ir 5-vinilsulfonamido tetrazolas. eakcijų išeiga 3. Junginių analizės rezultatai 3.1. FT-I spektroskopijos rezultatai orint preliminariai patvirtinti, jog sintezė įvyko sėkmingai, užrašomas gauto produkto bei pradinių medžiagų spektrai. Analizuojamos išnykusios ir naujai atsiradusios smailės. ezultatai pateikiami 6 lentelėje. 5-aminotetrazolo spektras pateikiamas 18 paveikslėlyje, 5-vinilsulfonamido spektras pateikiamas 19 paveikslėlyje. X ašis bangos ilgis, cm -1, Y ašis pralaidumas (%). 18 pav. 5-aminotetrazolo FT-I spektras

35 35 19 pav. 5-vinilsulfonamido tetrazolo FT-I spektras 6 lentelė. Junginių I spektrų pikai ir juos atitinkančios funkcinės grupės Junginys Funkcinė grupė pektro pikas (cm -1 ) aminotetrazolas C= 1640 C C= vinilsulfonamidtetrazolas C = 1300 C 2 =C EC-M analizės rezultatai Gautas junginys tiriamas Efektyviosios skysčių chromatografijos ir masių spektrometrijos metodu, naudojant Agilent 1260 Infinity EC-M sistemą. Atlikus pirminę chromatografinę analizę, naudojant Zorbax C18 kolonę, analizuoti junginiai nebuvo užlaikyti joje ir išsiplovė su tuščiu tūriu (t 0 ) [37]. eišskirstyto junginio (5-aminotetrazolo) chromatograma pavaizduota 20 paveikslėlyje. ustatytas tuščias tūris esamomis chromatografinėmis sąlygomis yra 0,56 min, kuris sutampa su iš kolonėlės išplaunamomis analitėmis (5-aminotetrazolas ir 5-vinilsulfonamidtetrazolas).

36 pav. 5-aminotetrazolo chromatograma Chromatogramoje pavaizduota 5-aminotetrazolo analitė, kurios sulaikymo trukmė sutampa su tuščiu tūriu (t = t 0 = 0,56 min). orint atlikti gerą chromatografinį junginių išskirstymą, iškeltos dvi hipotezės: keičiamos kolonėlės, kurios užpildytos skirtingomis stacionariomis fazėmis (Zorbax C18, ACE C8, Merck equant ZIC ILIC) [38, 39]; arba atliekama junginių derivatizacija su benzoilchloridu arba vanilinu. Kita pasirinkta kolonėlė, norint išskirstyti analizuojamus junginius, Merck equant ZIC ILIC. Ši kolonėlė ypatinga tuo, jog tai yra ne tik atvirkštinė stacionari fazė, bet ir turi zviterjoninį pakaitą, kuris leidžia išskirstyti joninius junginius [40, 41]. Tačiau šios kolonėlės trūkumas yra siauros p ribos (p = 3-8). orint suteikti analizuojamiems junginiams krūvį, šios paverčiamos į druskas. Junginių pavertimų druskomis procesai pavaizduoti reakcijos lygtyse 21 paveikslėlyje. 2 + Cl 3 + Cl - + ac 3 a pav. Krūvį suteikiančios 5-aminotetrazolo bei 5-vinilsulfonamidtetrazolo reakcijos

37 37 Gauti junginiai leidžiami per kolonėlę, užrašytų chromatogramų analičių smailės yra išplatėjusios dėl neoptimizuoto ir netinkamo p, dėl to dalis junginio yra jonizuotoje formoje, o kita dalis molekulinėje. Tam kad junginys būtų pilnai jonizuotas, reikia atitinkamų p sąlygų, kurių negalima pasiekti dėl kolonėlės limitacijų. u Cl p turėtų būti mažiau negu 2, o su ac 3 daugiau negu 12. Šios chromatogramos pateikiamos 22 ir 23 paveikslėlyje Cl - 22 pav. Dalinai jonizuoto 5-aminotetrazolo chromatograma Junginys paverstas vandenilio chlorido druska, esant p=3. a pav. Dalinai jonizuoto 5-vinilsulfonamidtetrazolo chromatograma Junginys paverstas natrio druska, esant p=8. ZIC ILIC kolonėlė netinkama šių dviejų junginių analizei dėl per didelio smailių išplatėjimo, dėl to bandyta junginį išskirsti naudojant ACE C8 kolonėlę. u šia kolonėle užrašytoje chromatogramoje nėra gero išskirstymo, nors tuščias tūris ir yra atskirtas nuo analitės, tačiau raiška tarp dviejų smailių yra pernelyg maža[42]. Ši chromatograma pateikiama 24 paveikslėlyje.

38 38 24 pav. 5-vinilsulfonamidtetrazolo chromatograma epakankamas junginio išskirstymas su ACE C8 kolonėle. tebima per maža raiška tarp tuščio tūrio ir analitės (raiškos koeficientas <1,5). Keičiant kolonėles su skirtingomis stacionariomis fazėmis, nepavyko pasiekti gero chromatografinio junginių išskirstymo, taigi atliekama junginio derivatizacija su benzoilchloridu. eakcijos lygtis pateikiama 25 paveikslėlyje. 2 + Cl 2 25 pav. 5-aminotetrazolo derivatizacija su benzoilchloridu [43] Derivatizuoto junginio chromatogramoje, vykdytoje su 1,8 μm Zorbax C18 kolonėle (Agilent Technologies), matoma, jog junginys yra grynas, pilnai išskirstytas, sulaikymo trukmė 14,823 min. Taip pat matyti, jog derivatizacijos reakcija pilnai įvyko, nes chromatogramoje matoma vienos analitės smailė. Chromatograma pateikiama 26 paveikslėlyje.

39 pav. Derivatizuoto 5-aminotetrazolo chromatograma Atlikta derivatizacijos reakcija su benzoilchloridu, stebima atskirta junginio smailė, sulaikymo trukmė 14,823 min. Junginio struktūrinei tapatybei patvirtinti buvo užrašytas masių spektras naudojant Agilent 1260 Infinity EC-M sistemą. ustatytas 5-vinilsulfonamidtetrazolo tikslus masės ir krūvio santykis (m/z), kuris yra 176,0268 [M+] +. Apskaičiuotas teorinis masės ir krūvio santykis, kuris yra lygus 176,0267 [M+] +. Tirto junginio M spektras pateikiamas 27 paveikslėlyje. 27 pav. ustatytas 5-vinilsulfonamidtetrazolo masių spektras Užrašytas tikslus junginio M spektras, kurio masės ir krūvio santykis (m/z) yra 176,0268 [M+] UV spektrofotometrijos analizės rezultatai Pirmasis spektras yra nederivetizuoto junginio, absorbcijos maksimumas stebimas esant 220 nm bangos ilgiui, o atlikus derivatizaijos reakciją su benzoilchloridu stebimi du absorbcijos maksimumai prie 235 ir 270 nm. Dėl įvykusios reakcijos stebimi du UV spektriniai efektai

40 batochrominis (raudonasis) bei hiperchrominis efektai. Šie efektai atsiranda dėl įvesto aromatinio žiedo. UV spektrai pateikiami 28 ir 29 paveikslėlyje pav. ederivatizuoto junginio UV spektras tebimas absorbcijos maksimumas prie 220nm bangos ilgio pav. Derivatizuoto junginio UV spektras tebimi du absorbcijos maksimumai prie 235 ir 270nm bangos ilgio. Tai lemia derivatizacijos reakcijos metu įvykę batochrominis ir hiperchrominis efektai Preparatyvinės chromatografijos analizės rezultatai intezės metu gautas junginys (5-vinilsulfonamidtetrazolas) papildomai grynintas preparatyvinės chromatografijos būdu. urenkamos frakcijos, pirmasis chromatografinės smailės trečdalis, nuo 7 iki 11 min prie fiksuoto detektoriaus bangos ilgio 230 nm. Likusios priemaišos yra išplaunamos į atliekas. Pasirinktas per mažas tėkmės greitis, kolonėlės stacionarios fazės dalelių dydis bei per didelė injekuojamo junginio koncentracija. Šios priežastys nulemia maža išskirstymą tarp smailių. Didesnio tėkmės greičio ir mažesnio stacionarios fazės dalelių dydžio, pvz. 5 μm, nebuvo

41 galima pasirinkti dėl ribotų pompos parametrų (sukeliamas slėgis yra didesnis nei galimas darbinis pompų slėgis). Gauta preparatyvinė chromatograma yra pateikiama 30 paveikslėlyje pav. 5-vinilsulfonamidtetrazolo preparatyvinė chromatograma

42 42 IŠVAD 1. emiantis in silico rezultatais buvo aptimizuotas tetrazolo struktūrinis fragmentas. ustatyta, kad tetrazolas, turintis sulfanilamido fragmentą, lyginant su tetrazolu bei 5-aminotetrazolu, turi pagerintą Log, LogP, LogD, pk a, pk b, PA. Be to, tetrazolo sulfanilamido junginys turi geresnes minėtas reikšmes esant skirtingoms p reikšmėms. 2. Atlikus PubChem duomenų bazės junginių, turinčių struktūrinę tetrazolo žiedą kiekybinę analizę, nustatyta, kad iš substruktūrų tik 533 substruktūros turi pagerintą, tetrazolo sulfanilamido fragmentą. Papildomų struktūrinių kriterijų paieška parodė, jog 5- vinilsulfonamidtetrazolo nebuvo rasta. 3. intezuotas pasirinktas 5- vinilsulfonamidtetrazolas, gauta 65% išeiga, atlikus preparatyvinę chromatografiją nustatytas 95% grynumas. Šis junginys buvo susintezuotas pirmą kartą, literatūros apie jį nerasta. Dėl 5-vinilsulfonamidtetrazolo hidrofiliškumo įprastais analizės metodais bei keičiant kolonėles (stacionarias fazes ir fizinius parametrus) nebuvo galima identifikuoti, junginys išsiplauna su tuščiu kolonėlės tūriu. Tuomet buvo taikyta derivatizacijos reakcija su benzoilchloridu, buvo stebima atskirta junginio smailė, sulaikymo trukmė 14,823 min vinilsulfonamidtetrazolo fragmento įvedimas į in silico sukurtą junginių biblioteką, dėl savo struktūrinių ypatumų, išreikšto didesnio Log, LogP, LogD ir kitų fizikochemininių parametrų, potencialiai pagerina ADME parametrus.

43 43 LITEATŪ ĄAŠA 1. hao, Yuling, Weihua Zhu, and eming Xiao tructure-property relationships of energetic nitrogen-rich salts composed of triaminoguanidinium or ammonium cation and tetrazole-based anions. Journal of Molecular Graphics and Modelling 40. Elsevier Inc.: doi: /j.jmgm Bladin, J. A Ueber von Dicyanphenylhydrazin abgeleitete Verbindungen. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft 18: doi: /cber err,. Jason ubstituted-1-tetrazoles as carboxylic acid isosteres: Medicinal chemistry and synthetic methods. Bioorganic and Medicinal Chemistry 10: doi: / (02) Benson, F The Tetrazoles in eterocyclic Compounds. Edited by. C. Elderfield. vol. 8. ew York: John Wiley & ons, Inc. 5. Benson, Frederic The Chemistry of the Tetrazoles. Chemical eviews 41: doi: /cr60128a strovskii, Vladimir A., and Andrei. Koren Alkylation and related electrophilic reactions at endocyclic nitrogen atoms in the chemistry of tetrazoles. eterocycles 53: doi: /ev Lenda, Fatimazohra, Farhate Guenoun, Bouchra Tazi, ajib Ben Iarbi, assan Allouchi, Jean Martinez, and Frédéric Lamaty ynthesis of new tetrazole-substituted pyroaminoadipic and pipecolic acid derivatives. European Journal of rganic Chemistry: doi: /ejoc Altman, F P Tetrazolium salts and formazans. Progress in histochemistry and cytochemistry. Vol. 9. Gustav Fischer Verlag tuttgart. doi: / (76) Janoschek, udolf Pentazole and ther itrogen ings. Angewandte Chemie International Edition in English 32: doi: /anie Malik, Maqsood Ahmad, Mohmmad Younus Wani, haeel Ahmed Al-Thabaiti, and ayees

44 44 Ahmad hiekh Tetrazoles as carboxylic acid isosteres: Chemistry and biology. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry 78: doi: /s x. 11. Koldobskii, G. I., V. A. strovskii, and B. V. Gidaspov Tautomerism and acid-base properties of tetrazoles (review). Chemistry of eterocyclic Compounds 16: doi: /bf V.A. strovskii, G. I. Koldobskii,. P. hirokova, I. Yu. hirobokov, and B. V. Gidaspov o Title. Zh. rg. Khim. 14: V.A. strovskii,.. Panina, G. I. Koldobskii, B. V. Gidaspov, and I. Yu. hirobokov o Title. Zh. rg. Khim. 15: Pujol, M. ouche and L o Title. Bull. oc. Chim. Ft o. 1: Meanwell, icholas A ynopsis of some recent tactical application of bioisosteres in drug design. Journal of Medicinal Chemistry 54: doi: /jm Patani, George A, and Edmond J LaVoie Bioisosterism: A ational Approach in Drug Design. Chemical eviews 96: doi: /cr950066q. 17. C. ansch, A. Leo, and D. oekman. Exploring QA: ydrophobic, Electronic, and teric Constants. Washington: American Chemical ociety. 18. Koldobskii, G I, V A strovskii, and V Poplavskii Advances in Tetrazole Chemistry. Khimiya Geterotsiklicheskikh oedinenii: Woodbury, D.M Antiepileptic Drugs: Mechanismsof Action. Edited by D.M. G.., Penry, J.K., Woodbury. ew York: avenpress. 20. EA, odin Metrazol tolerance in a normal volunteer population. Electroencephalogr Clin europhysiol 10: odin EA, Calhoun D Metrazol in a normal and volunteer population. J erv Ment Dis 150:

45 22. chenberg LC, Bittencourt A, udre ECM, Vargas LC Modeling panic attacks. eurosci Biobehav ev 25: Flack, John M., Elijah aunders, Alan Gradman, William E. Kraus, F. Martin Lester, J. oward Pratt, Michael Alderman, et al Antihypertensive efficacy and safety of losartan alone and in combination with hydrochlorothiazide in adult African Americans with mild to moderate hypertension. Clinical Therapeutics 23: doi: / (01) Lefrock, Jack L, William olloway, Bernice B Carr, and onald F chell In Vitro and Clinical Evaluation of Ceforanide. The American Journal of the Medical ciences 287: doi: Vardanyan, V. ruby ynthesis of Best-eller Drugs. Boston: Academic Press. 26. K. Y. Choi, Y. C. Kim, M. G. Lee o Title. Life ci 78: D. Mehta, E. L. Bradley, I. Kissin o Title. J. Clin. Anesth. 3: Dong, hiyang, Tiantian Wang, uayu Wang, Kun Qian, Zhongli Zhang, Yueming Zuo, Guangming Luo, Yi Jin, and Zengtao Wang ynthesis and Evaluation of 5-( o -Tolyl)-1 -tetrazole Derivatives as Potent Anticonvulsant Agents. Archiv der Pharmazie 350: doi: /ardp Masic, Izet eview of most important biomedical databases for searching of biomedical scientific literature. Donald chool Journal of Ultrasound in bstetrics and Gynecology 6: doi: /jp-journals Walker, Martin A Public Chemical Databases and the. 31. Bolton, Evan E., Yanli Wang, Paul A. Thiessen, and tephen. Bryant Chapter 12 PubChem: Integrated Platform of mall Molecules and Biological Activities. Annual eports in Computational Chemistry. Vol. 4. Elsevier B.V. doi: / (08) Kim, unghwan, Paul A. Thiessen, Evan E. Bolton, Jie Chen, Gang Fu, Asta Gindulyte, Lianyi an, et al PubChem substance and compound databases. ucleic Acids esearch 44: D1202 D1213. doi: /nar/gkv951.

46 Chen, Jie, John B. Anderson, Carol DeWeese-cott, atalie D. Fedorova, Lewis Y. Geer, iqian e, David I. urwitz, et al MMDB: Entrez s 3D-structure database. ucleic Acids esearch 31: doi: /nar/gkg Kim, unghwan Getting the most out of PubChem for virtual screening. Expert pinion on Drug Discovery 11: doi: / Dalby, Arthur, James G. ourse, W. Douglas ounshell, Ann K. I. Gushurst, David L Grier, Burton a Leland, and John Laufer Description of several chemical structure file formats used by computer programs developed at Molecular Design Limited. Journal of Chemical Information and Modeling 32: doi: /ci00007a ováková, Lucie, and Petr olich A comparison of performance of various analytical columns in pharmaceutical analysis: Conventional C18 and high throughput C18 Zorbax columns. Journal of Chromatography A 1088: doi: /j.chroma Kahsay, Getu, uiying ong, Ann Van chepdael, Deirdre Cabooter, and Erwin Adams ydrophilic interaction chromatography (ILIC) in the analysis of antibiotics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 87. Elsevier B.V.: doi: /j.jpba Aral, Tarik, ayriye Aral, Berrin Ziyadanoǧullari, and ecep Ziyadanoǧullari ynthesis of a mixed-model stationary phase derived from glutamine for PLC separation of structurally different biologically active compounds: ILIC and reversed-phase applications. Talanta 131: doi: /j.talanta Xiong, Xin, and Yanmeng Liu Chromatographic behavior of 12 polar pteridines in hydrophilic interaction chromatography using five different ILIC columns coupled with tandem mass spectrometry. Talanta 150. Elsevier: doi: /j.talanta Weber, Günther, icolaus von Wirén, and eiko ayen ydrophilic interaction chromatography of small metal species in plants using sulfobetaine- and phosphorylcholine-type zwitterionic stationary phases. Journal of eparation cience 31: doi: /jssc

47 entkowska, Aleksandra, Magdalena Biesaga, and Krystyna Pyrzynska Effects of the operation parameters on ILIC separation of flavonoids on zwitterionic column. Talanta 115. Elsevier: doi: /j.talanta Mohite, P B, G Khanage, and V Bhaskar a ovel Approach for ynthesis of ubstituted Tetrazoles 4:

48 48 PIEDAI