4-TIAZOLIDINONO JUNGINIŲ SINTEZĖ, ANALIZĖ IR MIKROBIOLOGINIS TYRIMAS

Transcription

1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA AGNĖ MAZURKEVIČIŪTĖ 4-TIAZOLIDINONO JUNGINIŲ SINTEZĖ, ANALIZĖ IR MIKROBIOLOGINIS TYRIMAS Magistro baigiamasis darbas Darbo vadovai: prof. dr. H. Rodovičius ( m.) prof. habil. dr. E. Tarasevičius ( m.) KAUNAS, 2014

2 2 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA TVIRTINU: Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis TIAZOLIDINONO JUNGINIŲ SINTEZĖ, ANALIZĖ IR MIKROBIOLOGINIS TYRIMAS Magistro baigiamasis darbas Darbo vadovas prof. dr. Hiliaras Rodovičius Darbo recenzentas Darbą atliko Magistrantė Agnė Mazurkevičiūtė KAUNAS, 2014

3 3 TURINYS SANTRUMPOS 5 ĮVADAS 6 DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI 7 1. LITERATŪROS APŽVALGA Tiazolidinonai tiazolidinono darinių biologinis aktyvumas Sulfadimidinas Sulfadimidino biologinis aktyvumas Nitrofurfurolas tiazolidinono žiedo pakaitų įtaka antimikrobiniam junginių aktyvumui Metodika ir metodai Sintezės metodai Junginių analizės metodai Efektyvioji skysčių chromatografija IR spektroskopija Lydymosi temperatūra Mikrobiologinis tyrimas Junginių sintezė Rodanino perkristalinimas AM-3 sintezė Tio-rodanino sintezė AM-3-1 sintezė AM-3-2 sintezė AM-4 sintezė AM-4-1 sintezė AM-4-2 sintezė AM-5 sintezė AM-6 sintezė Sintetintų junginių fiziko- cheminė analizė IR sprektroskopija 28

4 UV spektroskopija Aukšto slėgio skysčių chromatografija (HPLC) REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS Mikrobiologinių tyrimų rezultatai PASS prognozavimas Mikrobiologinių tyrimų in vitro ir PASS prognozavimo rezultatų palyginimas IŠVADOS PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS LITERATŪROS SĄRAŠAS PRIEDAI 42

5 5 Santrauka Agnės Mazurkevičiūtės baigiamasis magistro darbas 4-tiazolidinono junginių sintezė, analizė ir mikrobiologinis tyrimas. Moksliniai vadovai: prof. dr. Hiliaras Rodovičius ( m.) ir prof. habil. dr. Eduardas Tarasevičius ( m.). Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra.- Kaunas. Darbo tikslas: nustatyti galimą nifumezino ir į jį panašių junginių struktūros-aktyvumo ryšį. Tyrimo metodai: susintetintų nifumezino analogų preliminarūs antimikrobinio aktyvumo tyrimai in vitro ir antimikrobinio aktyvumo prognozė PASS programa. Tyrimo rezultatai: atlikus antimikrobinio aktyvumo tyrimus in vitro nustatyta, kad junginiai AM-3 ir AM-4 yra praktiškai neaktyvūs, kai koncentracija 500 µg/ml. Junginiai AM-3-1 ir AM-4-1 veikia S. aureus, E. faecalis, S. epidermidis. AM-5 aktyvus prieš S. aureus ir B. subtillis. Nė vienas iš susintetintų junginių nėra aktyvus prieš P. aeruginosa, P. mirabilis ir E. coli. Atlikus kompiuterinį aktyvumo prognozavimą PASS programa, nustatyta, kad stipriausias antibakterinis poveikis prognozuojamas AM-3-1 ir AM-4-1 junginiams (Pa>0,4). Priešgrybelinis poveikis prognozuotas junginiui AM-3-1. Prognozuojamas didžiausias toksiškumas (Pa>0,6) AM-3-1 ir AM-4-1 junginiams. AM-4 prognozuojami 4 nepageidaujami farmakologiniai poveikiai, o AM-5 6. Tyrimo išvados: Nustatyta, kad antimikrobiniam poveikiui yra svarbus nitrofuraldehido pakaitas 5-oje padėtyje ir sulfadimidino pakaitas. Sulfadimidino vieta rodanino žiede (3-ia ar 4-a padėtis) reikšmingos įtakos neturi, tačiau dalinai skiriasi junginių aktyvumas prieš skirtingas bakterijų rūšis. PASS programa gali nuspėti junginių aktyvumą ir pagreitinti galimų veiklių junginių atranką ir kryptingą sintezę.

6 6 Summary Master thesis of Agnė Mazurkevičiūtė Biologically active compounds of 4-thiazolidinone synthesis, analysis and microbiological testing. Tutor: Hiliaras Rodovičius, proffesor, Ph.D., ( m.) and Eduardas Tarasevičius, proffesor, Ph.D., ( m.). Lithuanian university of healh science, faculty of Pharmacy, Department of Pharmaceutical chemistry. Aim of study: to identify potential nifumezine and similar compounds structure- activity relationship. Study methods: antimicrobial activity tests in vitro and prognosis of antimicrobial activity by PASS program. Study results: antimicrobial activity tests in vitro showed that the compouds AM-3 and AM-4 is inactive at concentration 500 µg/ml. Compounds AM-3-1 and AM-4-1 are active against S. aureus, E. faecalis, S. epidermidis. None of the synthesized compounds are not active against P. aeruginosa, P. mirabilis and E. coli. Activity prognosis by PASS program showed that the strongest antibacterial effect predisted compound AM-3-1 and AM-4-1, but these compouds have also the bigest risk to be toxic. Conclusions: it was found that the nitrofuraldehyde in 5-position is important to antimicrobial effects. The position of sulfadimidine (3rd or 4th position)is not significantly affected in rhodanine ring, bet different compounds could be active against different type of bacteria. PASS program can predict the activity of compounds.

7 7 PADĖKA Nuoširdžiai dėkoju savo magistrinio darbo vadovams: prof. dr. Eduardui Tarasevičiui ir prof. dr. Hiliarui Rodovičiui už pagalbą, paramą ir patarimus atliekant eksperimentinę dalį ir magistrinio darbo rašymo metu. Dėkoju LSMU SMD už suteiktą finansinę paramą atlikti mokslinį darbą ir įsigyti dalį reikalingų reagentų. Dėkoju UAB Aconitum už suteiktą galimybę atlikti junginių struktūros tyrimus. Dėkoju LSMU FF Analizinės ir toksikologinės katedros vedėjui prof. dr. Liudui Ivanauskui už suteiktą galimybę nustatyti susintetintų junginių grynumą ESC metodu ir laborantui Mindaugui Marksai už pagalbą atliekant tyrimą. Dėkoju LSMU Mikrobiologijos katedros vedėjui prof. dr. Alvydui Pavilioniui už suteiktą galimybę atlikti mikrobiologinius tyrimus, patarimus ir pagalbą. Dėkoju vaistų chemijos katedros darbuotojams ir doktorantams: Liudui Šlepikui ir Jonui Saliui už paramą ir pagalbą vykdant sintezę.

8 8 Santrumpos B. cereus Bacillus cereus; B. subtillis Bacillus subtillis; C. albicans Candida albicans; DMFA Dimetilformamidas; E. coli Escherichia coli; E. faecalis Enterococcus faecalis; ESC Efektyvioji skysčių chromatografija; K. pneumoniae Klebsiella pneumoniae; P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa; P. mirabilis Proteus mirabilis; S. aureus Staphylococcus aureus; S. epidermidis Staphylococcus epidermidis; ŽIV Žmogaus imunodeficito virusas.

9 9 ĮVADAS Šiuolaikiniame pasaulyje daugelį anksčiau paplitusių ligų galime kontroliuoti vaistais ar vakcinomis, tačiau kyla nauja problema atsparumas antimikrobinėms medžiagoms. Kasmet Europos sąjungoje nuo vaistams atsparių bakterijų sukeltų infekcijų miršta apie pacientų, o sveikatos priežiūros išlaidos siekia 1,5 mlrd. eurų [1]. Europos komisijos pranešime spaudai 2011 m. lapkričio 17 d. pateikiamas veiksmų planas, kuriuo siekiama sumažinti atsparumą antimikrobinėms medžiagoms. Viena iš plano dalių naujų veiksmingų antimikrobinių medžiagų arba pakaitinių gydymo priemonių kūrimas [2]. Pastaruoju metu beveik neatrandama naujų antibiotikų, sintetinami jau esančių klasių nauji dariniai, kurie iš esmės panašūs į savo pirmtakus. Taip mikroorganizmai gali greičiau adaptuotis ir įgyti atsparumą [1]. Todėl labai svarbu kurti naujus antimikrobinį aktyvumą turinčius junginius. 2 Pastaruoju metu didžiulis dėmesys skiriamas tiazolidinono junginių sintezei ir junginių struktūros optimizavimui. Tiazolidinono junginiai pasižymi antibakteriniu, priešvirusiniu, antituberkulioziniu, priešgrybeliniu ir kitais poveikiais [3-17]. Lietuvos sveikatos mokslų universitete (anksčiau Kauno medicinos universitete) jau daug metų sintetinami 4- tiazolidinono dariniai. Prof. Eduardo Tarasevičiaus sintetintas junginys nifumezinas pasižymi dideliu aktyvumu prieš S. aureus MSK = 256 µg/ml ir mažu toksiškumu (LD 50 =5000 mg/kg). Šio junginio struktūra pavaizduota 1 pav. 1 pav. Nifumezino struktūra Nors vaistų sintezės laboratorijoje buvo susintezuota daug rodanino junginių, nifumezino struktūros ir aktyvumo ryšys iki šiol nebuvo nagrinėtas. Todėl buvo nuspręsta šio junginio struktūrą paanalizuoti plačiau. Šiame darbe siekiama ištirti, kaip keičiasi junginio aktyvumas, keičiant pakaitų padėtį rodanino žiede. Dėl to buvo susintetinti 4 nauji tiazolidinono junginiai ir 4 tarpiniai sintezės junginiai. Nauji

10 10 junginiai nuo nifumezino skiriasi sulfadimidino padėtimi rodanino žiede (2 ar 3-ia padėtis). Dviejų junginių struktūroje vietoje nitrofurfurolo yra ilgesnę anglies grandinę turintis nitrofurfurolo akroleinas. Susintetintų junginių struktūra nustatyta UV ir IR spektroskopijų metodais, grynumas įvertintas atliekant ESC tyrimą. Junginių aktyvumas buvo vertinamas in vitro ir kompiuterinio prognozavimo metodu PASS. Gauti tyrimų duomenys apibendrinti, siekiant nustatyti galimą nifumezino analogų struktūros aktyvumo ryšį. Darbo tikslas: nustatyti nifumezino ir į jį panašių junginių struktūros-aktyvumo ryšį. Darbo uždaviniai: 1. Susintetinti nifumezino analogus su pakaitais skirtingose rodanino žiedo padėtyse; 2. Nustatyti susintetintų junginių fiziko-chemines savybes ir antimikrobinį aktyvumą in vitro; 3. Įvertinti susintetintų junginių antimikrobinį aktyvumą kompiuterinio prognozavimo metodu PASS; 4. Nustatyti nifumezino ir jo analogų struktūros- aktyvumo ryšį.

11 11 1. LITERATŪROS APŽVALGA 1.1. Tiazolidinonai Tiazolidinonai yra penkianariai cikliniai junginiai, turintys du heteroatomus: sierą ir azotą bei karbonilinę grupę. Karbonilinė grupė gali būti 2, 4 ar 5-oje padėtyse (junginiai atitinkamai vadinami 2/4/5-tiazolidinonais). Tiazolidinonų galimos struktūros pavaizduotos 2 pav. 2 pav. Tiazolidinonų struktūros (iš kairės): 2-tiazolidinonas, 4-tiazolidinonas, 5-tiazolidinonas 4-Tiazolidinonas yra tiazolidino darinys su karboniline grupe 4-oje padėtyje. Pakaitai gali būti įvesti į 2, 3, 5-ą padėtis [3, 4]. Karbonilinė grupė yra gana neaktyvi, tačiau gali būti pakeista tioline grupe, kuri yra labai reaktyvi [4] tiazolidinono darinių biologinis aktyvumas Rodanino dariniai yra vieni iš labiausiai išnagrinėtų junginių [5]. Mokslinėje literatūroje aprašomas labai platus rodanino darinių biologinio veikimo spektras: antibakterinis, priešvirusinis, antihelmintinis, priešgrybelinis, kardiovaskulinis, priešepilepsinis, migdomasis, antihistamininis, priešuždegiminis. Trumpai apžvelsime šiais poveikiais pasižyminčius 4-tiazolidinono junginius. Priešepilepsinis poveikis. Priešepilepsiniu poveikiu pasižymi 2-(arilimino)/(arilhidrazono)-3- aril/(alkilaril)/furfuril/2-pirimidil/cicloalkili/(3-(n-morfolin-4-il-propil)-4-tiazolidinonai [6], bis(4- tiazolidinonai), N,N -bis(ariliden)dihidrazidai, tiazolidinonil-kvinolin-4(3h)-onai, tiazolidinonobarbitūrinės rūgšties ir tiazolidinono-triazolo dariniai [4]. Šių junginių struktūros aktyvumo ryšys nėra nustatytas. [3] Migdomasis poveikis. 3-(3-(N-morfolin-4-fl-propil)-2-(arilimino)-4-tiazolidinonai ir 2- (arilimino)-3-(pirimidin-2-il)-4-tiazolidinonai, 2-(benziliden/furfuriliden)-hidrazono-3-[2-(3,4-

12 12 dimetoksifenil)etil]tiazolidin-4-onai ir 1-( benziliden/furfuriliden)-amino -3-[2-(3,4-dimetoksifenil)etil]-2- tiokso-4,5-imidazolidindionai [7] stiprina pentobarbitalio poveikį. Visi tiazolidinonai ilgina pentobarbitalio sukelto miego laiką [3]. Antituberkuliozinis aktyvumas. Nustatyta, kad antituberkulioziniu aktyvumu pasižymi kai kurie tiazolidinono junginiai: 2-imino-4-tiazolidinonai, 5-(5-nitrofurfuriliden)-3-etilrodaninas [3], 2-pakeisti-3- {[4-(4-metoksibenzoilamino)benzoil]amino}-4-tiazolidinonai ir kt. [8]. 4-tiazolidinono aromatinio žiedo pakaitai labiausiai lemia antituberkuliozinį poveikį: junginiai be pakaitų aromatiniame žiede nepasižymi stipriu poveikiu, o įvedus pakaitus (ypač hidroksilo ar metoksi- grupes), junginiai tampa aktyvesni [5]. Antihelmintinis poveikis. 3-metil-5-[(4-nitrophenil)-azo]-rodaninas, 2-imino-3-(2- acetamidofenil)-4-tiazolidinonas, 2-tiono-3-pakeistas-5-[(2-metil-4-nitrofenil)- azo]-4-tiazolidinonas ir 2- tiono-3-metil-5-[(2,4-dinitrofenil)-azo]-4-tiazolidinonas yra aktyvūs prieš kai kurias kirmėles [3, 9]. Kardiovaskulinis poveikis. 2-ciklopenti/(cikloheksilimino)-3-aril-4-tiazolidinon-5-iletano rūgštis pasižymi kardiovaskuliniu poveikiu. Visi 4-tiazolidinono dariniai sukelia įvairaus lygio hipotenziją, kuri trunka iki 15 min [3], o sergantiems cukriniu diabetu tiazolidinono junginiai padidina miokardo infarkto riziką [10]. Priešvėžinis aktyvumas. 2-aril- 4-okso-tiazolid-3-il amidai ir jo dariniai, tiazolidinono amidai, karboksilinės rūgštys slopina prostatos vėžinių ląstelių augimą [3, 4]. Moksliniais tyrimais nustatyta, kad įvairūs tiazolidinono junginiai slopina daugiau nei 9 rūšių vėžinių ląstelių augimą [11]. Antihistamininis poveikis. Kai kurie tiazolidinonai savo struktūra yra panašūs į antihistamininius preparatus. Nustatyta, kad (fenil)-3-[3-(n,n-dimetilamino)propil]-1,3-tiazolidin-4-onai [12], 2,3- pakeisti tiazolidin-4-onai, turintys hidrofobinius pakaitus 4-oje fenilo padėtyje, turi antihistamininį aktyvumą [3]. Priešgrybelinis poveikis. 2-tiono-4-tiazolidinono dariniai, 2-[(o-metilfenil)-imino]-3-aril-4- tiazolidinonai, 8-(2-amino-3-fenil-propionil)-4-dodecil-1-tia-4-aza-spiro-[4.5]-dekan-3-onas, spiro-[3hindol-3,2 -tiazolidin]-3 -(1,2,4-triazol-3-il)-2,4 -(1H)-dionas [3, 14] bei tiazolidinono junginiai su pirazolo pakaitu pasižymi stipriu priešgrybeliniu poveikiu [15N]. Antivirusinis aktyvumas. Kai kurie junginiai slopina ŽIV-1 replikaciją ir yra mažai citotoksiški. [3, 4] Literatūroje aprašomas 2,3-diaril-1,3-tiazolidin-4-onų[3], 2-adamantil-pakeistų-tiazolidin-4-onų [4] 3-hidrazono-5-nitro-2-indolinono junginių su tiazolidinonais [16] poveikis prieš ŽIV. Priešuždegiminis poveikis. 3,3 -(1,2-etandiil)-bis-[2-aril-4-tiazolidinono] junginiai pasižymi stereoselektyviu priešuždegiminiu/analgetiniu poveikiu, tačiau turi silpnesnį poveikį virškinimo sistemai nei įprasti nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo. 2-imino-4-tiazolidinonai ir 5-ariliden-2-imino-4- tiazolidinonai tyrimuose in vitro parodė reikšmingą priešuždegiminį poveikį [17].

13 13 Folikulus stimuliuojančio hormono (FSH) receptorių agonistinis aktyvumas. 2-chloro-4-[5-{[2- (3H-inden-1-il)-etilkarbamoi]-metil}-2-(4-metoksi-fenil)-4-oksotiazolidin-3-il]-benzamidas [3], 5-alkil, gama laktam-tiazolidinono junginiai [4] yra FSH agonistai ir stimuliuoja FSH receptorius. Šios grupės aktyvūs junginiai gali būti naudojami moterų nevaisingumui gydyti. Antibakterinis aktyvumas. Yra susintetinta ir ištirta daug 4-tiazolidinono junginių, kurie pasižymi antibakteriniu poveikiu. Plačiau tiazolidinono junginių antibakterinės savybės aptariamos 1.6. poskyriuje Sulfadimidinas Cheminis pavadinimas: 4-amino-N-(4,6-dimetil-2-pirimidinil)-benzensulfonamidas, Sinonimai: sulfadimidinas, diazilas, sulfadimerazinas, sulfadimetinas, sulfametazinas [18]. 3 pav. sulfadimidino struktūra Sulfadimidinas savo struktūroje turi sulfoninę grupę, benzeno bei pirimidino žiedus (žr. 3 pav). Aromatiniame žiede esanti amino grupė yra reaktyvi ir naudojama įvairių cheminių reakcijų metu. Sulfanilamidai jautrūs UV šviesai ir gali suirti laikymo metu. Daugelio sulfanilamidų tirpalai dalinai suyra per kelias valandas [19]. Į tai reikia atsižvelgti junginių sintezės ir analizės metu Sulfadimidino biologinis aktyvumas Sulfadimidinas yra sulfonamidų grupės antibakterinėmis savybėmis pasižymintis junginys, naudojamas vienas ar deriniuose su kitomis cheminėmis medžiagomis veterinarinėje medicinoje [20]. Antibakterinis poveikis panašus į sulfonamidų. Sulfonamidai yra tik dalinai metabolizuojami organizme ir išskiriami į aplinką. Tai lemia vis didėjantį atsparumą šiai antibakterinių junginių klasei [19]. Buvo nustatyta, kad sulfadimidinas žiurkėms sukelia skydliaukės sutrikimus ir skatina hipofizės auglių augimą. Žmonės šiam poveikiui yra mažiau jautrūs [21].

14 Nitrofurfurolas Cheminis pavadinimas: 2-(5-nitrofuran-2-il)-acetaldehidas; Sinonimai: nitrofurfurolas, nitrofuraldehidas. 4 pav. Nitrofurfurolo struktūra Nitrofurfurolo struktūroje yra furano žiedas, kurio 2-oje padėtyje yra acetaldehido grupė, o 5-oje padėtyje- nitro grupė (žr. 4 pav.). Nitrofurfurolas cheminėse reakcijose reaguoja kaip aldehidas tiazolidinono žiedo pakaitų įtaka antimikrobiniam junginių aktyvumui Literatūroje aprašomi įvairūs 4-tiazolidinono dariniai, kurie pasižymi antimikrobiniu poveikiu. Daugybė atliktų tyrimų rodo, kad 4-tiazolidinono junginiai turi stipresnį poveikį prieš gramneigiamas bakterijas nei prieš gramteigiamas [5]. Yra susintetinta daug 4-tiazolidinono junginių su pakaitais įvairiose padėtyse. Šių junginių antimikrobinis aktyvumas labai įvairus ir priklauso nuo pakaito pobūdžio ir vietos žiede. Tiazolidinonai su radikalais 2 ir 3-ioje padėtyse turi įvairaus stiprumo antibakterinį ir priešgrybelinį poveikį [3, 5]. Antibakterinis aktyvumas priklauso nuo pakaitų pobūdžio 2 ir 3-ioje rodanino žiedo padėtyse [22, 23]. Pavyzdžiui, 3-ioje padėtyje esantis fenilalaninas ar kita hidrofobinė aminorūgštis [15, 16], karboksigrupė [26, 27], propiono rūgšties liekana [28] padidina antimikrobinį poveikį. Pakaitai, esantys 5-oje tiazolidinono žiedo padėtyje taip pat turi įtakos junginių antimikrobiniam aktyvumui: kvinolino grupė padidina aktyvumą prieš S. aureus [26, 27], 3-fenoksibenzilideno grupė [25],

15 15 fenilalaninas [28] reikšmingai padidina rodanino junginių antimikrobinį poveikį. Jin H. ir kitų atliktame tyrime nustatyta, kad penktojoje rodanino žiedo padėtyje esančio pakaito aromatinio žiedo pakaitai nedaro jokios įtakos antimikrobiniam junginių poveikiui [28]. Taip pat rodaninas kaip purino bazių analogas naudojamas nukleino rūgščių sintezėje [29]. Glikozilinti rodanino junginiai pasižymi antimikrobiniu poveikiu prieš S. aureus ir E. coli, tačiau neturi poveikio Candida grybeliui [29]. Tiazolidin-2,4-dionas neturėjo jokio antimikrobinio poveikio, tačiau pakeitus karbonilo grupe į tiokarbonilinę, antimikrobinis poveikis padidėjo [22].

16 16 2. METODIKA IR METODAI 2.1. Sintezės metodai Junginių sintezė vykdyta keliais etapais. AM-3-1 ir AM-3-2 junginiai sintetinti iš tarpinio junginio AM-3, kurio sintezės schema pateikiama 5 pav. 5 pav. AM-3 sintezės schema (R-sulfadimidinas) AM-3 Junginio struktūra ilginama sulfadimidiną veikiant anglies disulfidu, kalio hidroksidu, metilbromacetatu. Gautas junginys ciklizuotas rūgšties tirpale ir gaunamas AM-3, kuris išgryninamas ir naudojamas kitų junginių sintezei (žr. 6 pav.). AM-3 AM pav. Junginių AM-3-1 ir AM-3-2 sintezės schema AM-3-1 Junginiai AM-3-1 ir AM-3-2 gauti AM-3 junginį veikiant su nitrofurfurolu arba nitrofurfurolo akroleinu acto rūgštyje. Kaip katalizatorius naudojamas amonio arba natrio acetatas.

17 17 4-tiazolidinono 4-oje padėtyje esanti karbonilinė grupė nėra pakankamai reaktyvi, todėl ji keičiama į tioninę, kuri yra labai reaktyvi ir gali reaguoti su aminais. Paveikus tiorodaniną sulfadimidinu, gaunamas AM-4 junginys. Reakcijos schema pateikiama 7 pav. Rodaninas Tiorodaninas AM-3 7 pav. AM-4 sintezės schema (R-sulfadimidinas) AM-4-1 ir AM-4-2 junginiai gaunami AM-4 atitinkamai veikiant nitrofurfurolu ar nitrofurfurolo akroleinu acto rūgštyje su katalizatoriumi natrio ar amonio acetatu (žr. 8 pav.). AM-4 AM-4-2 AM pav. Junginių AM-4-1 ir AM-4-2 sintezės schema

18 Junginių analizės metodai Efektyvioji skysčių chromatografija Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) analizė atlikta su Waters 2695 chromatografu (Waters Corporation, Milford, USA) ir fotodiodų matricos detektoriumi Waters 996 PDA (Waters Corporation, Milford, USA). Analizės metu injekuota 10 µl tiriamo metanolinio tirpalo. Naudota gradientinė sistema: 0,1% trifluoracto rūgštis vandenyje (A) ir acetonitrilas (B). Eliucija: 0 min 80% A ir 20% B, 15 min 20% A ir 80% B, 20 min 10% A ir 90% B, 21 min 80% A ir 20% B. Veikliųjų junginių detekcija atlikta nm bangų intervale IR spektroskopija Susintetintų junginių IR spektrai užrašyti Perkin Elmer Spektrum-100 spektrometru, naudojant ATR ( angl. Attenuated total reflection) priedą. Mažas junginio kiekis buvo užnešamas ant cinko selenido kristalo Lydimosi temperatūra Junginių lydymosi temperatūros nustatytos Koflerio prietaisu Mikrobiologinis tyrimas rūšių: Susintetintų junginių biologinis aktyvumas in vitro buvo tiriamas dešimčiai bakterijų ir grybelio Staphylococcus aureus ATCC 25923; Staphylococcus epidermidis ATCC 12228; Enterococcus faecalis ATCC 29212; Escherichia coli ATCC 25922; Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853; Klebsiella pneumoniae ATCC 33499; Proteus mirabilis ATCC 12459;

19 19 Bacillus subtillis ATCC 6633; Bacillus cereus ATCC 8035; Candida albicans ATCC 60193; Bakterijų rūšys buvo pasirinktos dėl skirtingų struktūrinių ypatumų. Šios bakterijos dažnai naudojamos, siekiant nustatyti junginių antimikrobinį poveikį (žr. 1 lent.) 1 lent. pasirinktų mikroorganizmų savybės (pagal 30) Bakterijos pavadinimas Gramteigiama/ Gramneigiama Ypatybės S. aureus Gramteigiama S. epidermidis Gramteigiama E. coli Gramneigiama B. subtilis Gramteigiama Sudaranti sporas B. cereus Gramteigiama Sudaranti sporas K. pneumoniae Gramneigiama Sudaranti kapsulę P. mirabilis Gramneigiama Šliaužianti P. aeruginosa Gramneigiama Atspari daugeliui antimikrobinių vaistų E. faecalis Gramteigiama Atspari daugeliui antimikrobinių vaistų C. albicans - Vienas dažniausių grybelinių infekcijų sukėlėjų Šios bakterijų ir grybelio kultūros auginamos mėgintuvėliuose ant nuožulnaus Miulerio-Hintono agaro, kas 7 dienas persėjamos į šviežią Miulerio-Hintono agarą ir laikomos 2 8 ºC temperatūroje. Etaloninių mikroorganizmų kultūrų paruošimas. Etaloninės bakterijų ir grybelio C. albicans kultūros auginamos val. Miulerio-Hintono agare ºC temperatūroje. Mikroorganizmų suspensija gaminama fiziologiniame natrio chlorido tirpale iš išaugintų kultūrų, standartizuojama McFarland standartiniu indikatoriumi. Paruošta mikroorganizmų suspensija laikoma standartizuota, kai indikatoriaus reikšmė lygi 0,5 (tai reiškia, kad 1 ml mikrobų suspensijos yra 1, mikrobų ląstelių).

20 20 Tiriamųjų junginių tirpalų paruošimas mikrobiologiniam tyrimui. Tiriami junginiai tirpinami DMSO (11 mg/ml) ultragarso vonelėje. Sterilioje Petri lėkštelėje sumaišoma 0,5 ml tiriamojo junginio tirpalo ir 10,5 ml išlydytos Miulerio Hintono standžiosios terpės. Sustingus terpei, standartizuotos mikroorganizmų kultūros sėtos kilpele. Kontrolė atliekama sėjant etalonines bakterijų ir grybelio C. albicans kultūras ant standžiosios Miulerio Hintono terpės ir į į Miulerio Hintono terpe su DMSO (0,5 ml DMSO ir 10,5 ml terpės). Petri lėkštelės laikomos 24 val. termokameroje Junginių sintezė Rodanino perkristalinimas Turimas rodaninas buvo užterštas pašalinėmis medžiagomis ir oksidacijos produktais, todėl buvo nuspręsta rodaniną išgryninti. Gryninimui buvo pasirinktas kristalizacijos metodas. Buvo išbandytos 3 skirtingos metodikos, kurios aprašomos toliau. I metodas 2 lentelėje nurodomi reikalingi reagentų kiekiai. 2 lentelė. Naudotų reagentų kiekiai Pavadinimas Rodanidas Vanduo Anglis Masė, g 10,0-3,2 Tūris, ml - 190,0 - Kiekis, mol 0, Molekulinė masė, 133,18-12,0 g/mol Tankis g/ml - 1,0 - Pasveriamas reikalingas rodanido kiekis. Pamatuojamas atitinkamas tūris vandens. Rodaninas ir vanduo sumaišomi kolboje. Kaitinama, kol rodaninas ištirpsta ir tirpalas užverda. Atsargiai į kolbą

21 21 sudedamas pasvertas ir grūstuvėlėje sutrintas aktyvuotos anglies kiekis. Verdama apie 10-15min. Karštas tirpalas filtruojamas. Filtratas atvėsinamas. Susidarę rodanino kristalai filtruojami ir džiovinami. Tapatybė ir likusios priemaišos vertinamos, nustatant lydymosi temperatūrą ir atliekant plonasluoksnę chromatografiją. Gauti rezultatai pateikiami 3 lentelėje. 3 lentelė. Rodanino gryninimo rezultatai Rodiklis Skaitinė reikšmė Masė, g 5,31 Molekulinė masė, g/mol 133,18 Kiekis, mol 0,040 Išeiga, % 53,1 Lydymosi temperatūra, C II metodas Gryninimas atliekamas analogiškai kaip ir I metodikoje, tik kaip tirpiklis naudojamas butanolis. 4 lentelėje nurodomi reikalingi reagentų kiekiai. 4 lentelė. Naudotų reagentų kiekiai Pavadinimas Rodaninas Butanolis Anglis Masė, g 10,0-5,0 Tūris, ml - 40,0 - Kiekis, mol 0, Molekulinė masė, 133,18 74,12 12,0 g/mol Tankis g/ml - 0,810 - Gauti rezultatai pateikiami 5 lentelėje.

22 22 5 lentelė. Rodanino gryninimo rezultatai Rodiklis Skaitinė reikšmė Masė, g 5,175 Molekulinė masė, g/mol 133,18 Kiekis, mol 0,039 Išeiga, % 51,7 Lydymosi temperatūra, C III metodas Gryninimas atliekamas analogiškai kaip ir I metodikoje, tik kaip tirpiklis naudojamas izopropanolis. 6 lentelėje nurodomi reikalingi reagentų kiekiai. 6 lentelė. Naudotų reagentų kiekiai Pavadinimas Rodaninas Izopropanolis Anglis Masė, g 10,0-5,0 Tūris, ml - 90,0 - Kiekis, mol 0, Molekulinė masė, 133,18 60,10 12,0 g/mol Tankis g/ml - 0,785 - Gauti rezultatai pateikiami 7 lentelėje. 7 lentelė. Rodanino gryninimo rezultatai Rodiklis Skaitinė reikšmė Masė, g 3,96 Molekulinė masė, g/mol 133,18 Kiekis, mol 0,03 Išeiga, % 39,6 Lydymosi temperatūra, C

23 Įvertinus gautas skirtingų metodikų išeigas ir sunaudotus tirpiklių kiekius, buvo nuspręsta rodaniną gryninti dviem etapais: pirmiausia naudojant I metodiką, o tada II AM-3 sintezė 8 lentelėje nurodomi reikalingi reagentų kiekiai. 8 lentelė. Naudotų reagentų kiekiai Pavadinimas KOH DMFA CS2 Sulfadimidinas Bromacto r. metilo esteris Masė, g 0, , Tūris, ml - 10,0 1,5-1,0 100,0 Kiekis, mol 0,01-0,015 0, Molekulinė masė, g/mol HCl 56,11 73,09 76,14 278,32 152,97 36,46 Tankis g/ml - 0,945 1,271-1,616 1,05 Kalio hidroksidas atsveriamas, sutrinamas grūstuvėlėje ir kolboje sumaišomas su dimetilformamidu. Suspensija šaldiklyje atšaldoma iki 0ºC. Atsargiai pridedama anglies disulfido ir sulfadimidino. Maišoma kambario temperatūroje 5 val. Įpilama bromacto rūgšties metilo esterio ir maišoma dar 5 valandas. Į distiliuotą vandenį lašinama koncentruota druskos rūgštis, kol tirpalo ph tampa 3. Rūgšties tirpalas atšaldomas šaldiklyje iki 0ºC. Į reakcijos mišinį supilamas rūgšties tirpalas. Iškrenta baltos nuosėdos. Maišoma kambario temperatūroje apie 3 val. ir vėliau pakaitinama, kol susidaro geltonas klampus skystis. Atvėsinama. Likusi rūgštis nupilama ir dekantuojama su distiliuotu vandeniu. Gautas masė perkristalinama izopropanolyje su aktyvinta anglimi ir laikant medžiaga kristalizuojasi. Gauti rezultatai pateikiami 9 lentelėje.

24 24 9 lentelė. Rezultatai Rodiklis Skaitinė reikšmė Masė, g 2,96 Molinė masė, g/mol 394,492 Kiekis, mol 0,0075 Išeiga, % 75,03 Lydymosi temperatūra, C Tiorodanino sintezė 10 lentelėje nurodomi reikalingi reagentų kiekiai. 10 lentelė. Naudotų reagentų kiekiai Pavadinimas Rodaninas Fosforo Dioksanas Aktyvinta Cinkas pentoksidas anglis Masė, g ,0-6,0 12,0 Tūris, ml ,0 - - Kiekis, mol 0, Molekulinė 133,18 141,94 88,11 12,0 65,41 masė, g/mol Tankis g/ml - - 1, Rodaninas šildant tirpinamas dioksane. Kai pradeda virti dioksanas, supilamas fosforo pentoksidas. Tirpalas tampa raudonas. Virinama min. Įdedama anglis ir cinko dulkės. Virinama 1-2 min. Karštas tirpalas filtruojamas. Praplaunama su karštu dioksanu. Filtratas distiliuojamas su rotaciniu vakuuminiu distiliatoriumi. Susidaro intensyviai geltoni tio-rodanino kristalai. Gauti rezultatai pateikiami 11 lentelėje.

25 25 11 lentelė. Rezultatai Rodiklis Skaitinė reikšmė Masė, g 34,56 Molekulinė masė, g/mol 149,258 Kiekis, mol 0,232 Išeiga, % 77,18 Lydymosi temperatūra, C AM-3-1 sintezė 12 lentelėje nurodomi reikalingi reagentų kiekiai. 12 lentelė. Naudotų reagentų kiekiai Pavadinimas AM-3 Nitrofurfurolas Amonio Acto rūgštis acetatas Masė, g 3,0 1,35 0,4 - Tūris, ml ,0 Kiekis, mol 0,0073 0, Molekulinė masė, 410, g/mol Tankis g/ml , 49 Visos medžiagos sudedamos į kolbą ir kaitinama vandens vonioje 5 val. Palaikoma temperatūra apie 60ºC. Gautos nuosėdos nufiltruotos ir praplautos distiliuotu vandeniu. Reakcijos eiga stebima plonasluoksnės chromatografijos pagalba. Gauti rezultatai pateikiami 13 lentelėje. 13 lentelė. Rezultatai Rodiklis Skaitinė reikšmė Masė, g 2,86 Molinė masė, g/mol 516,570 Kiekis, mol 0,0055 Išeiga, % 75,8

26 26 Perkristalinta iš butanolio. Gauti rezultatai pateikiami 14 lentelėje. 14 lentelė. Rezultatai Rodiklis Skaitinė reikšmė Masė, g 0,73 Molinė masė, g/mol 516,570 Kiekis, mol 0,0014 Išeiga, % 25, AM-3-2 sintezė 15 lentelėje nurodomi reikalingi reagentų kiekiai. 15 lentelė. Naudotų reagentų kiekiai Pavadinimas AM-3 Nitrofurfurolo Amonio Acto rūgštis akroleinas acetatas Masė, g 3,0 1,65 0,4 - Tūris, ml ,0 Kiekis, mol 0,0073 0, Molekulinė masė, 410, , g/mol Tankis g/ml , 49 Visos medžiagos sudedamos į kolbą ir kaitinama vandens vonioje 5 val. Palaikoma temperatūra apie 60ºC. Gautos nuosėdos nufiltruotos ir praplautos distiliuotu vandeniu. Reakcijos eiga stebima plonasluoksnės chromatografijos pagalba. Sistema: Gauti rezultatai pateikiami 16 lent. 16 lent. Rezultatai Rodiklis Skaitinė reikšmė Masė, g 2,875 Molinė masė, g/mol 539,650 Kiekis, mol 0,0053 Išeiga, % 72,93

27 Perkristalinta iš butanolio. Gauti rezultatai pateikiami 17 lentelėje lentelė. Rezultatai Rodiklis Skaitinė reikšmė Masė, g 0,409 Molinė masė, g/mol 516,570 Kiekis, mol 0,0008 Išeiga, % 14, AM-4 sintezė 18 lentelėje nurodomi reikalingi reagentų kiekiai. 18 lentelė. Naudotų reagentų kiekiai Pavadinimas Tiorodaninas Sulfadimidinas Dioksanas Masė, g 3,0 5,56 Tūris, ml ,0 Kiekis, mol 0,02 0,02 - Molekulinė masė, g/mol 149, ,32 88,11 Tankis g/ml - - 1,033 Sulfadimidinas tirpinamas dioksane kaitinant. Pridedama tiorodanino. Spalva pasikeičia į tamsiai raudoną. Kaitinama apie 16 val. Reakcijos eiga stebima su švino popierėliu ir atliekant plonasluoksnę chromatografiją. Nuosėdos nufiltruojamos. Filtratas kaitinamas su anglimi, karštas tirpalas nufiltruojamas. Išvalytas filtratas nudistiliuojamas rotaciniu vakuuminiu distiliatoriumi. Gauti rezultatai pateikiami 19 lentelėje.

28 28 19 lentelė. Rezultatai Rodiklis Skaitinė reikšmė Masė, g 0,73 Molinė masė, g/mol 392,519 Kiekis, mol 0,0019 Išeiga, % 9, AM-4-1 sintezė 20 lentelėje nurodomi reikalingi reagentų kiekiai. 20 lentelė. Naudotų reagentų kiekiai Pavadinimas AM-4 Nitrofurfurolas Natrio acetatas Acto rūgštis Masė, g 3,0 1,35 0,5 - Tūris, ml ,0 Kiekis, mol 0,0076 0, Molekulinė masė, 392, g/mol Tankis g/ml , 49 Visos medžiagos sudedamos į kolbą ir kaitinama vandens vonioje 3 val. Palaikoma temperatūra apie 40ºC. Gautos nuosėdos nufiltruotos ir praplautos distiliuotu vandeniu. Gautos nuosėdos praplautos karštu dioksanu. Reakcijos eiga stebima plonasluoksnės chromatografijos pagalba. Sistema: heksanas: acetonas: metanolis (3:1:1). Gauti rezultatai pateikiami 21 lentelėje.

29 29 21 lentelė. Rezultatai Rodiklis Skaitinė reikšmė Masė, g 1,37 Molinė masė, g/mol 515,585 Kiekis, mol 0,0026 Išeiga, % 34, AM-4-2 sintezė 22 lentelėje nurodomi reikalingi reagentų kiekiai. 22 lentelė. Naudotų reagentų kiekiai Pavadinimas AM-4 Nitrofurfurolo Natrio acetatas Acto rūgštis akroleinas Masė, g 3,0 1,65 0,4 - Tūris, ml ,0 Kiekis, mol 0,0076 0, Molekulinė masė, 392, , g/mol Tankis g/ml , 49 Visos medžiagos sudedamos į kolbą ir kaitinama vandens vonioje 3 val. Palaikoma temperatūra apie 40ºC. Gautos nuosėdos nufiltruotos ir praplautos distiliuotu vandeniu. Gautos nuosėdos praplautos karštu dioksanu. Reakcijos eiga stebima plonasluoksnės chromatografijos pagalba. Sistema- heksanas: acetonas: metanolis (3:1:1). Gauti rezultatai pateikiami 23 lentelėje.

30 30 23 lentelė. Rezultatai Rodiklis Skaitinė reikšmė Masė, g 2,875 Molinė masė, g/mol 541,662 Kiekis, mol 0,0053 Išeiga, % 69, AM-5 sintezė 24 lentelėje nurodomi reikalingi reagentų kiekiai. 24 lentelė. Naudotų reagentų kiekiai Pavadinimas Tiorodaninas Nitrofurfurolas Metanolis Masė, g 2,0 1,0 - Tūris, ml - - 5,0 Kiekis, mol 0,013 0,007 - Molekulinė masė, g/mol 149, ,04 Tankis g/ml - - 0,786 Kolboje sumaišomos medžiagos. Kambario temperatūroje ultragarso vonelėje palaikoma apie 2 min. Spalva pasikeičia į tamsiai žalią, kuri pereina į juodai raudoną. Po paros nufiltruota. Nuosėdos juodos, tirpinant nudažo tirpalą avietine spalva. Reakcijos eiga stebima atliekant plonasluoksnę chromatografiją. Gauti rezultatai pateikiami 25 lentelėje. 25 lentelė. Rezultatai Rodiklis Skaitinė reikšmė Masė, g 1,176 Molinė masė, g/mol 256,258 Kiekis, mol 0,0046 Išeiga, % 65,6

31 AM-6 sintezė 26 lent. nurodomi reikalingi reagentų kiekiai. Kolboje sumaišomos medžiagos. Kambario temperatūroje ultragarso vonelėje palaikoma apie 2 min. Po paros nufiltruota. Nuosėdos juodos. Tirpinant nudažo tirpalą avietine spalva. Reakcijos eiga stebima atliekant plonasluoksnę chromatografiją. 26 lentelė. Naudotų reagentų kiekiai Pavadinimas Tiorodaninas Nitrofurfurolo Metanolis akroleinas Masė, g 2,0 2,0 - Tūris, ml - - 7,0 Kiekis, mol 0,013 0,012 - Molekulinė masė, g/mol 149, ,14 32,04 Tankis g/ml - - 0,786 Gauti rezultatai pateikiami 27 lentelėje. 27 lentelė. Rezultatai Rodiklis Skaitinė reikšmė Masė, g 1,8 Molinė masė, g/mol 282,296 Kiekis, mol 0,0064 Išeiga, % 53, Sintetintų junginių fiziko- cheminė analizė IR sprektroskopija Junginių struktūros patvirtinimui buvo padaryti IR spektrai. Gauti rezultatai pateikiami 28 lentelėje, užrašyti spektrai pateikiami 1 priede.

32 32 28 lentelė. Susintetintų junginių IR spektrai ir juos atitinkančios funkcinės grupės Junginys Funkcinė grupė Spektro pikas (cm -1 ) AM-3 -CH3 2995; C=C C=C- (žiede) 1590; C-N- 1246; C=O 1086 AM-3-1 -CH3 2994; C=O (ketonas) C=C- (žiede) C-N- 1252; 1176; C-N- 960 AM-3-2 -C=O (ketonas) C=C- (žiede) C-N- 1252; 1168; C=O 964 AM-4 -N-H (antrinis aminas) C=C C=C- (žiede) C-N C=O 986 AM-4-1 -CH C=C- (žiede) C-N- 1162; 1054 AM-4-2 -C=C- (žiede) C-N C=O 1124; 1058 AM-5 -C=O (ketonas) C=C- (žiede) C-N- 1248; C=O 974 AM-6 -CH C=O (ketonas) C=C- (žiede) C-N- 1254; C=O UV spektroskopija Junginiai buvo identifikuoti, užrašant UV spektrus. Gauti rezultatai pateikti 29 lentelėje, užrašyti spektrai pateikiami 2 priede.

33 33 29 lentelė. Susintetintų junginių UV spektrų pikai Junginys UV spektro pikai AM-3 298,4 AM ,4; 338,7; 437,9 AM-4 244,1 AM ,3; 297,2 AM-5 343,5; 435, Aukšto slėgio skysčių chromatografija (HPLC) AM-3 Junginio AM-3 HPLC kreivėje (žr. 9 pav.) matomi 6 pikai: 4,821; 6,139; 8,188; 9,925; 10,916 ir 12,074 min. Didžiausias plotas po kreive (67,75%) yra ties 8,188 min. AU 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 4,821 6,139 8,188 9,925 10,916 12,074 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 Minutes 9 pav. Junginio AM-3 chromatografinė kreivė AM-3-1 AM-3-1 HPLC spektre matomi pikai: 13,192; 13,415 ir 15,560 min. (žr. 10 pav.) Junginio grynumas 87,73% (plotas po kreive ties 13,415). 0,20 AU 0,15 0,10 0,05 13,192 13,415 15,560 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 Minutes 10 pav. Junginio AM-3-1 chromatografinė kreivė

34 34 AM-4 AM-4 HPLC spektre matomi 3 pikai: 2.887; 4,432 ir 5,235 min. (žr. 11 pav.). grynumas 95,56% (plotas po kreive ties 4,432). Junginio AU 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 2,887 4,432 5,235 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 Minutes 11 pav. Junginio AM-4 chromatografinė kreivė AM-4-2 AM-4-2 HPLC spektre matomi 4 pikai (žr. 12 pav.). Junginio grynumas 63,56%. 12 pav. Junginio AM-4-2 chromatografinė kreivė 82,57 %. AM-5 AM-3-1 HPLC spektre matomi pikai: 15,906 ir 16,181 min. (žr. 13 pav.) Junginio grynumas

35 35 AU 0,40 0,30 0,20 15,906 16,181 0,10 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 Minutes 13 pav. Junginio AM-5 chromatografinė kreivė Kiti junginiai ESC metodu įvertinus junginių grynumą, nustatyta, kad AM-3-2, AM-4-2, AM-6 junginių grynumas buvo mažas, todėl jų rezultatai analizuojami nebuvo.

36 36 3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS 3.1. Mikrobiologinių tyrimų rezultatai Atlikus mikrobiologinius tyrimus buvo nustatomas susintetintų junginių antimikrobinis aktyvumas prieš 9 rūšis bakterijų ir 1 grybelį, kai junginių koncentracija 500 µg/ml. Tyrimo rezultatai pavaizduoti 30 lent. 30 lentelė. Mikrobiologinių tyrimų rezultatai. ( + reiškia bakterijų augimą, - bakterijų neaugimą, +/- (p.k) pavienes augančias kolonijas Mikroorganizmų pavadinimai Tiriamų junginių pavadinimai AM-3 AM-3-1 AM-4 AM-4-1 AM-5 S. aureus + - +/- (p.k) - - E. faecalis S. epidermidis E. coli K. pneumoniae + +/- (p.k) - + +/- (p.k) P. aeruginosa P. mirabilis B. cereus + +/- (p.k) B. subtillis /- (p.k) - C. albicans +/- (p.k) + - +/- (p.k) + Junginys AM-3, kurio struktūroje yra 3 rodanino žiedo padėtyje įvestas sulfadimidinas, nerodė jokio antibakterinio poveikio, bet iš dalies veikia grybelį C. albicans. Junginys AM-3-1 visiškai slopina S. aureus, E. faecalis, S. epidermidis, B. subtillis augimą, iš dalies slopina K. pneumoniae, B. cereus augimą. AM-4 slopina K. pneumoniae, B. subtillis ir C. albicans augimą. AM-4-1 slopina S. aureus, E. faecalis, S. epidermidis kultūrų augimą. Junginys AM-5 baktericidiškai veikia S. aureus ir B. subtillis. Iš rezultatų matyti, kad sulfadimidino vieta rodanino žiede yra svarbi: kai sulfadimidinas yra 3-ioje padėtyje, junginys nėra aktyvus prieš jokią tirtą kultūrą, o pakaitui esant 4-oje padėtyje junginys slopina K. pneumoniae, B. subtilis ir C. albicans augimą. Kai įvestas tik sulfadimidinas į rodanino struktūrą, aktyvesni dariniai gaunami pakaitui esant 3-ioje padėtyje. Lyginant AM-3-1 ir AM-4-1 aktyvumą, galima pastebėti, kad junginių aktyvumas yra panašus: abu junginiai veikia S. aureus, E. faecalis, S. epidermidis. AM-3-1 dalinai veikia B. cereus ir K. pneumoniae, o AM-4-1 dalinai veikia B. subtillis ir C. albicans. Taigi, sulfadimidino vieta rodanino žiede

37 37 nėra svarbi, kai 5-oje padėtyje yra įvestas nitrofurfurolas junginiai vienodai baktericidiškai veikia 3 bakterijų kultūras, tik skiriasi dalinai veikiamos kultūros. Palyginus AM-3 ir AM-3-1 antimikrobinį aktyvumą matyti, kad nitrofurfurolo įvedimas į junginio struktūrą suteikia antimikrobines savybes, nes junginys AM-3, turintis tik 3-ioje padėtyje sulfadimidiną, yra neaktyvus. Lyginant AM-4 ir AM-4-1 antimikrobinio tyrimo rezultatus, galima pastebėti, kad nitrofurfurolo įvedimas padidina aktyvumą prieš S. aureus, E. faecalis, S. epidermidis, tačiau sumažėja aktyvumas prieš K. pneumoniae, B. subtillis ir C. albicans. Junginio AM-5 struktūroje yra įvestas nitrofurfurolas į 5 padėtį. Palyginus AM-5 ir AM-3-1 antimikrobinį aktyvumą matyti, kad abu junginiai veikia S. aureus, tačiau AM-3-1, turintis papildomą sulfadimidino grupę 3-ioje padėtyje, pasižymi papildomu antimikrobiniu aktyvumu prieš E. faecalis, B. subtillis ir S. epidermidis. Palyginus AM-4-1 ir AM-5 aktyvumą, matoma panaši tendencija, tik AM-4-1, priešingai nei AM-3-1, nepasižymi antimikrobiniu aktyvumu prieš B. subtillis PASS prognozavimas Kompiuterinio prognozavimo programa PASS buvo įvertintas galimas junginių aktyvumas. Didžiausias antibakterinis poveikis prognozuojamas AM-3-1 (Pa/Pi- 0,496/0,017) ir AM-3-2 (Pa/Pi- 0,406/0,028) junginiams, mažiausias antibakterinis poveikis- AM-3 (Pa/Pi- 0,277/0,069), AM-4 (0,196/0,121) ir AM-5 (0,277/0,069). Priešgrybelinis poveikis prognozuojamas tik AM-3-1 junginiui (Pa/Pi- 0,231/0,117). Buvo prognozuojamas ir antibakterinis junginių poveikis pries Helicibacter pylori. Nustatyta, kad junginiai AM-3-1 ir AM-4-1 turi didelę tikimybę (Pa>0,5) veikti šią bakteriją. Prognozuojami junginių aktyvumai pateikti 31 lentelėje. PASS programa buvo įvertintas galimas junginių toksiškumas. Gauti duomenys pateikiami 32 lentelėje. Mažiausiai toksinių poveikių prognozuojama AM-3 junginiui (Pa/Pi- 0,371/0,208), daugiausiai- AM-5( Pa: 0,199-0,786). AM-3-1 prognozuojami 2 toksikologiniai poveikiai (Pa: 0,612 ir 0,274), AM-4 4 poveikiai (Pa: 0,241-0,350), AM poveikiai (Pa: 0,323-0,594). Visiems junginiams prognozuojama neurotrofinė dermatozė (AM-3-1, AM-4-1 ir AM-5 junginiams Pa>0,5). Kancerogeninis poveikis prognozuojamas tik AM- junginiui. (Pa/Pi- 0,199/0,091).

38 38 31 lentelė. PASS programos prognozuojamas junginių aktyvumas Farmakoliginis poveikis Antibakterinis poveikis Priešgrybelinis poveikis Anti-Helicobacter pylori Antituberkuliozinis poveikis Pa/Pi AM-3 AM-3-1 AM-4 AM-4-1 AM-5 0,277/0,069 0,496/0,017 0,196/0,121 0,406/0,028 0,277/0,069-0,231/0, ,259/0,053 0,568/0,004 0,303/0,028 0,578/0,004 0,259/0,053 0,209/0,157 0,275/0,086-0,311/0,065 0,209/0, lentelė. PASS programa prognozuojamas junginių toksiškumas. Toksikologinis Pa/Pi poveikis AM-3 AM-3-1 AM-4 AM-4-1 AM-5 Neurotrofinė 0,371/0,208 0,612/0,082 0,350/0,225 0,594/0,089 0,786/0,026 dermatozė Fotoalerginis - - 0,287/0,228-0,308/0,102 dermatitas Trombocitopoezės - - 0,241/0, inhibavimas Splenomegalija - - 0,256/0, Intersticinis nefritas - 0,274/0,208-0,323/0,158 0,283/0,196 Fibrozė ,433/0,086 Alerginis ,387/0,102 kontaktinis dermatitas Kancerogeninis ,199/0,091

39 palyginimas Mikrobiologinių tyrimų in vitro ir PASS prognozavimo rezultatų Atlikus antimikrobinio aktyvumo tyrimus in vitro ir PASS programos prognozes buvo palyginti gauti duomenys. Priešgrybelinis poveikis buvo prognozuotas AM-3-1 junginiui, tačiau C. albicans veikė AM-4 ir iš dalies veikė AM-3 ir AM-4-1 junginiai. Prognozuotas stipriausias antibakterinis poveikis junginiams AM-3-1 ir AM-4-1. Šie junginiai veikė daugiausiai tirtų bakterijų rūšių (atitinkamai 4 ir 3), taigi galima teigti, kad šių junginių antimikrobinis veikimas yra platesnis nei kitų tirtų junginių ir PASS prognozė pasitvirtino.

40 40 4. IŠVADOS 1. Susintetinti 8 junginiai, kurių struktūros yra panašios į nifumezino. AM-3, AM-3-1, AM-3-2 sulfadimidino pakaitas yra 3-ioje padėtyje, o AM-4, AM-4-1 ir AM-4-2 sulfadimidinas yra 4-oje padėtyje. Junginiai AM-3-1 ir AM oje padėtyje turi nitrofuraldehidą, o AM-3-2 ir AM-4-2 nitrofurfurolo akroleiną. Junginiai AM-5 ir AM-6 savo struktūroje neturi sulfadimidino, bet 5-oje padėtyje atitinkamai įvestas nitrofuraldehidas/ nitrofurfurolo akroleinas. 2. Susintetintų junginių tapatybė nustatyta užrašius UV ir IR spektrus, o grynumas- atlikus ESC. Nagrinėtų junginių grynumas yra 63,56-95,56%. 3. Junginiai AM-3-1 ir AM-4-1 veikia S. aureus, E. faecalis, S. epidermidis, kai koncentracija 500 µg/ml. AM-5 aktyvus prieš S. aureus ir B. subtillis. Nė vienas iš susintetintų junginių nėra aktyvus prieš P. aeruginosa, P. mirabilis ir E. coli. 4. Atlikus kompiuterinį aktyvumo prognozavimą PASS programa, nustatyta, kad stipriausias antibakterinis poveikis prognozuojamas AM-3-1 ir AM-4-1 junginiams (Pa>0,4). Priešgrybelinis poveikis prognozuotas junginiui AM-3-1. Prognozuojamas didžiausias toksiškumas (Pa>0,6) AM-3-1 ir AM-4-1 junginiams. 5. Nustatyta, kad antimikrobiniam poveikiui yra svarbus nitrofuraldehido pakaitas 5-oje padėtyje ir sulfadimidino pakaitas. Sulfadimidino vieta rodanino žiede (3-ia ar 4-a padėtis) reikšmingos įtakos neturi, tačiau dalinai skiriasi junginių aktyvumas prieš skirtingas bakterijų rūšis.

41 41 5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS Atlikus pirminius mikrobiologinius tyrimus, rekomenduoju atlikti išsamesnius tyrimus prieš S. aureus, S. epidermidis, E. faecalis ir B. subtillis ir nustatyti mažiausias mikrocidines junginių koncentracijas, kad būtų galima tiksliai įvertinti junginių aktyvumo priklausomybę nuo pakaitų padėties 4- tiazolidinono žiede. Rekomenduoju patobulinti junginių su nitrofurfurolo akroleinu (AM-3-2, AM-4-2 ir AM-6) gryninimą ir atlikti mikrobiologinius tyrimus in vitro, o gautus rezultatus palyginti su AM-3-1, AM-4-1 ir AM-5 aktyvumu.

42 42 6. LITERATŪROS SĄRAŠAS 1. Europos ligų prevencijos ir kontrolės centro (ECDC) ir Europos vaistų agentūros (EMA) bendra techninė ataskaita Bakterijų keliama problema laikas veikti. Prieiga per: European Centre for Disease Prevention and Control, Europos Komisijos pranešimas spaudai, Briuselis, 2011 lapkričio 17d Prieiga per: 3. Verma A, Saraf SK. 4-Thiazolidinone - a biologically active scaffold. European Journal of Medicinal Chemistry 43 (2008) Abhinit M, Ghodke M, Pratima NA. Exploring potential of 4-thiazolidinone: a brief review. International journal of pharmacy and pharmaceutical science 2009; 1: Jain AK. Vaidya A, Ravichandran V, Kashaw SK, Agrawal RK. Recent developments and biological activities of thiazolidinone derivatives: A review. Bioorganic & Medicinal Chemistry 2012; C. Dwivedi, T. K. Gupta, Surendra S. Parmar. Substituted thiazolidones as anticonvulsants. Eur J of Med Chem 1972; 15: Ergenc N, Capan G, Gunay NS, Ozkirimli S, Gungor M, Ozbey S, Kendi E. Synthesis and hypnotic activity of new 4-thiazolidinone and 2-thioxo-4,5-imidazolidinedione derivatives. Arch Pharm (Weinheim) 1999; 332: Kucukguzel SG, OruC EE, Rollas S, Sahin F, Ozbek A. Synthesis, characterisation and biological activity of novel 4-thiazolidinones, 1,3,4-oxadiazoles and some related compounds. Eur J of Med Chem 2002; 37: Reddy RSD, Sudhakar D. Synthesis, characterization and biological evaluate on of some novel 6- fluoro benzothiazole substituted thiazolidinones as anthelmintic activity. Der Pharma Chemica, 2014; 6: Shaya FT, Lu Z, Sohn K, Weir MR. Thiazolidinediones and Cardiovascular Events In High-Risk Patients with Type-2 Diabetes Mellitus. Pharmacol Ther 2009; 34(9): ZhangQ, Zhou H, Zhai S and Yan B. Natural Product-Inspired Synthesis of Thiazolidine and Thiazolidinone Compounds and their Anticancer Activities. Current Pharmaceutical Design 2010; 16: Mehta DP, SENGAR NPS, PATHAK AK. 4-thiazolidinone- a new profile of various pharmacological activities. Oriental Journal of Chemistry 2008; 24(2):

43 43 13.Marques GH, Kunzler A, Bareno VD, Drawanz BB, Mastelloto HG, Leite FR, Nascimento GG, Nascente PS, Siqueira GM, Cunico W. Antifungal Activity of 3-(heteroaryl-2-ylmethyl)thiazolidinone Derivatives. Med Chem 2014; 10(4): Omar K, Geronikaki A, Zoumpoulakis P, Camoutsis C, Soković M, Ćirić A, Glamočlija J. Novel 4- thiazolidinone derivatives as potential antifungal and antibacterial drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry 2010; 18(1): Aneja DK, Lohan P, Arora S, Sharma C, Aneja KR, Prakash O. Synthesis of new pyrazolyl-2, 4- thiazolidinediones as antibacterial and antifungal agents. Organic and Medicinal Chemistry Letters 2011; 1: TerzioGlu N, Karal N, GUrsoy A, Pannecouque C, Leysen P, Paeshuyse J, Neyts J, and De Clercq E. Synthesis and primary antiviral activity evaluation of 3-hydrazono-5-nitro-2-indolinone derivatives. Arkivok 2006; Unsal-Tan O, Ozadali K, Piskin K, Balkan A. Molecular modeling, synthesis and screening of some new 4-thiazolidinone derivatives with promising selective COX-2 inhibitory activity. European Journal of Medicinal Chemistry 2012; 57: O Neil MJ, Heckelman PE, Koch CB, Roman KJ, Kenny CM, D Arecca MR. The Merck index. New York: Merck and Co., Inc; Zessel K, Mohring S, Hamscher G, Kietzmann M, Stahl J.Biocompatibility and antibacterial activity of photolytic products of sulfonamides. Chemosphere 2014; 100: Vree TB, Hekster YA, Nouws JFM, Baakman M. Pharmacokinetics, metabolism, and renal excretion of sulfadimidine and its N4-acetyl and hydroxy metabolites in humans. Therapeutic drug monitoring 1986; 21. Poirier LA, Doerge DR, Gaylor DW, Miller MA, Lorentzen RJ, Casciano DA, Kadlubar FF, Schwetz BA. An FDA review of sulfamethazine toxicity. Regulatory toxicology and pharmacology 1999; 30: Gouveia FL 1, de Oliveira RM, de Oliveira TB, da Silva IM, do Nascimento SC, de Sena KX, de Albuquerque JF. Synthesis, antimicrobial and cytotoxic activities of some 5-arylidene-4-thioxothiazolidine-2-ones. European Journal of Medicinal Chemistry 2009; 44: Singh T, Srivastava VK, Saxena KK, Goel SL, Kumar A. Synthesis of new thiazolylthiazolidinylbenzothiazoles and thiazolylazetidinylbenzothiazoles as potential insecticidal, antifungal, and antibacterial agents. Arch. Pharm.Chem. Life Sci. 2006, 339,

44 Song M, Zheng C, Deng X, Wang Q, S Hou, Liu T, Xing X, Piao HR. Synthesis and bioactivity evaluation of rhodanine derivatives as potential anti-bacterial agents. European Journal of Medicinal Chemistry 2012; 54: Patel BA, Ashby CH, Hardej D, Talele TT. The synthesis and SAR study of phenylalanine-derived (Z)-5-arylmethylidene rhodanines as anti-methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) compounds. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2013; 23: Guo M, Zheng CJ, Song MX, Wu Y, Sun LP, Li YJ, Liu Y, Piao HR. Synthesis and biological evaluation of rhodanine derivatives bearing a quinoline moiety as potent antimicrobial agents. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2013; 23: Desai NC, Dodiya A, Shihory N. Synthesis and antimicrobial activity of novel quinazolinone thiazolidine quinoline compounds. Journal of Saudi Chemical Society 2013; 17: Jin H, Zheng CJ, Song MX, Wu Y, Sun LP, Li YJ, Yu LJ, Piao HR. Synthesis and antimicrobial evaluation of l-phenylalanine-derived C5-substituted rhodanine and chalcone derivatives containing thiobarbituric acid or 2-thioxo-4-thiazolidinone. European Journal of Medicinal Chemistry 2012; 56: Metwally NH, Abdalla MA, Mosselhi MAN, El-Desoky EA. Synthesis and antimicrobial activity of some new N-glycosides of 2-thioxo-4-thiazolidinone derivatives. Carbohydrate Research 2010; 345: Lasinskaitė-Čerkašina A, Pavilonis A, Vaičiuvėnas V. Medicinos mikrobiologija ir virusologijos pagrindai. Kaunas: KMU leidykla; 2003.