VYTAUTO DIDŢIOJO UNIVERSITETAS JUSTINA VAITKEVIČIŪTĖ

Transcription

1 VYTAUTO DIDŢIOJO UNIVERSITETAS GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS BIOLOGIJOS KATEDRA JUSTINA VAITKEVIČIŪTĖ BITINĖS SPRIGĖS (Impatiens glandulifera Royle) KAI KURIŲ EUROPOS ŠALIŲ POPULIACIJŲ SKIRTUMAI PAGAL ISSR ŢYMENIS Magistro baigiamasis darbas Molekulinės biologijos ir biotechnologijos studijų programa, valstybinis kodas 621C71001 Molekulinės biologijos, biochemijos, biofizikos studijų kryptis (01B) Darbo vadovė: prof. habil. dr. E. Kupčinskienė Apginta: Algimantas Paulauskas Kaunas, 2013

2 Turinys TURINYS... 2 SANTRUMPOS... 3 SANTRAUKA... 4 SUMMARY... 6 ĮVADAS... 8 I. LITERARŪROS APŢVALGA SPRIGĖS GENTIES (IMPATIENS SPP. L.) BIOLOGINĖS SAVYBĖS Bitinės sprigės (Impatiens glandulifera Royle) morfologinė, fenologinė, geografinė charakteristika SPRIGIŲ GENTIES EKOFIZIOLOGINĖS SAVYBĖS Bitinės sprigės naudingosios savybės METODOLOGIJA, TAIKOMA SPRIGIŲ GENTIES GENETINIAMS TYRIMAMS II. METODINĖ DALIS TYRIMO OBJEKTAS, VIETOS IR METODAI Augalinės medžiagos surinkimas Genominės DNR išskyrimas Išskirtos genominės DNR koncentracijos ir švarumo nustatymas Paprastųjų pasikartojančių sekų intarpų (PPSI) analizės sąlygos PGR produktų elektroforezė Elektroforezės duomenų statistinė analizė III. REZULTATAI GENETINĖS ĮVAIROVĖS TYRIMAS PPSI METODU IŠVADOS LITERATŪROS SĄRAŠAS PADĖKA

3 SANTRUMPOS AFIP amplifikuotų fragmentų ilgio polimorfizmas (angl. Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP) APPD atsitiktinai pagausinta polimorfinė DNR (angl. Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD) bp bazių pora (angl. base pair) DNR deoksiribonukleorūgštis (angl. Deoxyribonucleic acid, DNA) dntp deoksiribonukleotidai PGR polimerazinė grandininė reakcija (angl. Polymerase Chain Reaction, PCR) PKSP paprastųjų kartotinių sekų polimorfizmas (angl. Simple Sequence Repeats/Microsatellites, SSR) PPSI paprastųjų pasikartojančių sekų intarpai (angl. Inter-Simple Sequence Repeats, ISSR) VNP vieno nukleotido polimorfizmas (angl. Single Nucleotide Polymorphism, SNP) UPGMA porų grupavimo pagal aritmetinius vidurkius metodas su vienodais svoriais (angl. Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) 3

4 SANTRAUKA Autorius: Pavadinimas: Europos šalių Vadovas: Pristatyta: Justina Vaitkevičiūtė Bitinės sprigės (Impatiens glandulifera Royle) kai kurių populiacijų skirtumai pagal ISSR ţymenis prof. habil. dr. Eugenija Kupčinskienė Vytauto Didţiojo Universitetas, Gamtos mokslų fakultetas, Kaunas, 2013, geguţės mėn. Puslapių skaičius: 52 Lentelių skaičius: 11 Paveikslų skaičius: 15 Priedų skaičius: 0 Literatūros nuorodų skaičius: 73 Iš vakarų Himalajų kilęs vienametis ţolinis augalas bitinė sprigė (Impatiens glandulifera Royle) šiuo metu yra vienas iš labiausiai plintančių svetimkraščių augalų Europoje. To pasekoje bitinė sprigė išstumia vietines augalų rūšis ir okupuoja pakrančių augavietes. Populiacijų paplitimo genetiniai duomenys bei dabartinės padėties įvertinimas yra svarbūs tam, kad būtų galima nuspėti bitinės sprigės plėtrą ateityje bei imtis atitinkamų veiksmų natūraliai augalų rūšinei sudėčiai išlaikyti. Mes surinkome bitinės sprigės augalus iš 13 geografiškai skirtingų Europos vietovių, esančių Lietuvoje ir kitose šalyse: Olandijoje, Belgijoje, Liuksemburge, Vokietijoje (Heepen, Rinteln, Bad Zalzuflen, Seeker), Šveicarijoje, Austrijoje, Vengrijoje, Čekijoje. Šias populiacijas genetiškai ištyrėme paprastų pasikartojančių sekų intarpų metodu, panaudojant 4 oligonukleotidinius pradmenis: ISSR2, ISSR3, ISSR4 bei ISSR5. PGR poduktai buvo leidţiami 1,5 % agarozės gelyje, elektroforezės rezultatai fotografuojami ir analizuojami. Fragmentų ilgis išmatuotas pagal 100 plus bp ilgio standartus. Nustatyta, kad populiacijoms būdinga genetinė diferenciacija: skirtumai tarp populiacijų sudarė 81 % ir populiacijų viduje 19 %. DNR polimorfizmas tarp populiacijų svyravo 30,3 % (Vokietija, Bad Zalzuflen) 5,6 % (Šveicarija ir Lietuva) ribose, (vidutinis 16,1 %). Pagal Nei genetinį atstumą labiausiai atsiskiria šiaurės Liuksemburgo ir Lietuvos populiacijos (0,570), 4

5 pagal genetinį panašumą labiausiai panašios dvi Vokietijos populiacijos (Bad Zalzuflen ir Rinteln populiacijos; 0,831), maţiausias genetinis panašumas (0,566) nustatytas tarp Lietuvos ir vienos iš Liuksemburgo populiacijų. Principinė koordinačių analizė ir UPGMA klasterių analizė ir jos pagrindu sudarytas genetinio giminingumo medis parodė, kad tik kai kurių populiacijų genetiniam polimorfizmui turi įtakos geografinė padėtis. Tai galima paaiškinti faktu, kad bitinė sprigė plinta ne tik natūraliai palei upelius, griovius, bet yra platinama ţmogaus tiek netikslingai, tiek tikslingai perveţama įvairiais atstumais ir kryptimis. 5

6 SUMMARY Author of term paper: Full title of term paper: Term paper advisor: Presented at: Justina Vaitkevičiūtė Genetic analysis of Impatiens glandulifera using ISSR markers in some Europian Countries Habitual Doctor in Biomedical Sciences, Professor Eugenija Kupčinskienė Vytautas Magnus University, Faculty of Nature Sciences, Kaunas, 2013, May Number of pages: 52 Number of tables: 11 Number of figures: 15 Number of appendixes: 0 Number of references: 73 Impatiens glandulifera is annual weed that came from West of Himalays and nowadays is highly invasive in almost whole Europe and occurs in various habitats. As a result of this fact Impatiens glandulifera displace native species and occupies growing areas near the rivers. Population genetic data on genetic peculiarities may aid in the management of the invasive species. We collected Impatiens glandulifera plants from 13 different abitats located in Lithuania and in the other European countries: Holland, Belgium, Luxembourg, Germany (Heepen, Rinteln, Bad Zalzuflen, Seeker, Switzerland, Austria, Hungary and Czech Republic. These populations we compared using an intersimple sequence repeat (ISSR) markers: ISSR2, ISSR3, ISSR4 and ISSR5. PCR products were separated by 1,5 % agarose gel, photographed and statistically analyzed. Fragment length was measured by Gene Ruller (100 bp length standards). Among populations of Impatiens glandulifera genetic parameters ranged in the following intervals: percentage of polymorphic DNA within populations was between 5,6 % (Switzerland and Lithuania) and 30,3 % (Germany, Bad Zalzuflen), mean being 16,1 %. In accordance with Nei s gene diversity index, the 6

7 most different were northern Luxembourg and Lithuanian populations (0,570), and the most simillar were two populations from Germany (Bad Zalzuflen and Rinteln populations; 0,831). It was found genetic difference between populations 57 %, within population 19 % and 24 % of the molecular diversity within countries. The principle coordinate analyses of populations and genetic tree built on the bases of UPGMA cluster analyses showed relations to geographical position of sampling sites only for part of populations. It might be explained by the fact that Himalayan balsam is spreading not only naturally - along streams, ditches, but it is unintentionally and intentionally distributed by the human in different distances and directions. 7

8 ĮVADAS Pasaulio augalijos evoliucija apima milijardus metų. Ţemės kalnynai, vandenynai, dykumos ir netgi didelės upės suformavo fizines kliūtis, trukdančias rūšims judėti, taip paskatindami ir sudarydami naujas sąlygas labai didelei planetos biologinei įvairovei. Dėl to susiformavo gyvūnų bei augalų bendrijos, kurias mes laikome būdingomis tam tikriems regionams ar vietovėms. Dėl sąmoningos ar nesąmoningos ţmonių veiklos, gamtiniai barjerai riboję savaiminį rūšių plitimą, buvo sugriauti. Kai kurios rūšys, atsidūrusios naujoje aplinkoje, tampa invazinėmis sukelia dideles ekologines, ekonomines problemas ar kenkia ţmonių sveikatai (Mcneely et al., 2001). Intensyvus prekių veţimas, kelionės, didėjantis gyventojų skaičius, intensyvi ţemdirbystė ir miškininkystė, laivininkystė, urbanizacija, klimato pokyčiai (Reymanek, 1995), moksliškai nepagrįstas teritorijų apţeldinimas svetimkraščiais augalais, siekiant sustabdyti nestabilių natūralių buveinių degradaciją (Edvards et al., 1995), produktyvių augalų veisimas, tikintis ekonominės naudos, neapsvarsčius augalų galimos skverbties (Reymanek, 1995), sukelia arba skatina pasaulinį augalų rūšių judėjimą iš natūralios augavietės arealo ir turi didelę įtaką biologinės invazijos intensyvumui (Falinski, 1998). Bitinė sprigė (Impatiens glandulifera Royle), vadinama Himalajų sprige arba policininko šalmu, priklauso sprigiečių (Balsaminaceae Lindl.) šeimai, sprigių (Impatiens L.) genčiai. Literatūros šaltiniai nurodo, kad bitinė sprigė šiuo metu yra viena iš dominuojančių invazinių augalų rūšių Europoje (Ugoletti et al., 2009). Šis augalas uţkariavo daugiau kaip pusę Čekijos Republikos paupių augaviečių ir panašiai pasklido kitose Vakarų Europos valstybėse bei Šiaurės Amerikoje (Clements, 2007; Chittka, Schürkens, 2001). Baltijos šalyse sprigių genties augalų rūšinės sudėties ir gausumo poslinkiai taip pat vyksta sparčiu tempu. Svetimkraščių augalų biologinė invazija paveikia vietinę biologinę įvairovę įvairiais mastais. Augalai patekę į naują aplinką, greitai dauginasi, auga ir taip stelbia vietines augalų rūšis. Invazinės augalų rūšys keičia augalų bendrijų rūšių sudėtį. Bitinei sprigei ypatingai sparčiai gausėjant greta natūraliai augančios augalų rūšys maţėja (Priede, 2008). Kadangi invazinės sprigės vis labiau įsigali Europoje (Gudţinskas, Sinkevičienė, 1995), išstumdamos vietines rūšis bei sukeldamos daug neigiamų padarinių, yra svarbu tirti ir įvertinti dabartinę padėtį, tam, kad būtų galima imtis atitinkamų veiksmų biologinei augalų įvairovei palaikyti. Invazinių augalų morfologijos, fiziologijos, ypač fenologijos ir genetikos paţinojimas, įskaitant ţinias apie bitinę ir smulkiaţiedę spriges yra būtinos svetimkraščių sprigių rūšių kontrolei vykdyti. 8

9 Problemos naujumas PPSI metodui yra sukurti pradmenys, tačiau konkretūs genetiniai bitinės sprigės tyrimai Europoje atlikti nebuvo. DARBO TIKSLAS Šio darbo tikslas yra išanalizuoti Europos šalių: Lietuvos, Olandijos, Čekijos, Belgijos, Šveicarijos, Vengrijos, Austrijos, Vokietijos, ir Liuksemburgo ekosistemose plintančio augalo bitinės sprigės (Impatiens glandulifera Royle) populiacijų genetinę įvairovę. PAGRINDINIAI TYRIMŲ UŢDAVINIAI Darbo tikslui pasiekti iškelti šie uţdaviniai: 1. Pasirinkti tinkamas keliamiems uţdaviniams spręsti augalų radavietes surinkti bitinės sprigės individus iš 13 kontrastingų geografija Europos vietovių. 2. Išskirti iš bitinės sprigės individų genominę DNR, nustatyti švarumą bei koncentraciją. 3. Ištirti bitinės sprigės DNR polimorfizmą paprastų pasikartojančių sekų intarpų (PPSI) metodu ir įvertinti Europos populiacijų genetinę įvairovę, panaudojant 4 oligonukleotidinius pradmenis. 9

10 I. LITERARŪROS APŢVALGA 1.1. Sprigės genties (Impatiens spp. L.) biologinės savybės Sprigės gentis (Impatiens L.) priklauso spriginių (Balsaminaceae) šeimai, kurioje yra iš viso iki tūkstančio plačiai šiauriniame pusrutulyje ir atogrąţose paplitusių augalų rūšių. Balsaminaceae sudaro 2 gentys: Hydrocera and Impatiens. Pastaroji yra didesnės genetinės įvairovės ir laikoma viena iš taksonomiškai sudėtingiausių gaubtasėklių genčių. S. Janssens teigia, jog labai tikėtina, kad sprigė kilo iš Pietų Kinijos, iš kurios išsiverţusi kolonizavo gretimas sritis ir po to išplito į Šiaurės Ameriką, Afriką, Indiją, pietryčių Azijos pusiasalį, ir Himalajų sritį (Janssens, 2006). Genties pavadinimas iš lotynų kalbos impatiens reiškia nepakenčiantis; prinokę vaisiai nuo menkiausio prisilietimo sprogsta ir sąvaros, spirališkai susisukdamos, išsviedţia sėklas (Grigas, 1986). Dalis rūšių yra vienamečiai augalai ir ţydi nuo ankstyvos vasaros iki pirmųjų šalnų, kitos rūšys yra daugiametės, auga šiltesniame klimate ir ţydi visus metus. Dauguma jų auga aukštumose ir kalnuose nuo atogrąţų bei paatogrąţių regionų Indijoje iki pietryčių Azijos. Apie 240 rūšių buvo pernešta vien tik iš Kinijos, tai sudaro apytiksliai 25 % Impatiens rūšių visame pasaulyje, daugiausia ten jos yra endeminės (Caris et al., 2006). Europoje be čiabuvės (natūraliai augančios) paprastosios sprigės (Impatiens noli-tangere L.) natūraliai auga keturios svetimkraštės sprigių rūšys su skirtingais natūralizacijos laipsniais: invazinė rūšis bitinė sprigė (Impatiens glandulifera Royle) yra kilusi iš Indijos; smulkiaţiedė sprigė (Impatiens parviflora DC) atkeliavo iš centrinės Azijos 19 ąjį šimtmetį ir plito po visą Europą, dabar yra labai gausi; Impatiens capensis Meerb. išplitusi iš Šiaurės Amerikos, centrinėje Europoje nustatyta nuo 1990-ųjų; azijinė Impatiens balfourii centrinėje ir rytų Europoje vis dar yra pradiniame natūralizacijos proceso tarpsnyje. Tyrimai parodė, kad yra tendencija šiai sprigių rūšiai natūralizuotis ir Pietų bei Vakarų Europos dalyse (Pyšek, Prach, 1995). Mūsų krašto sprigių rūšys tai vienamečiai ţoliniai augalai su stačiais, kartais net permatomais stiebais, šakotais ir neretai šiek tiek sustorėjusiais bambliuose. Lapkočiai su ekstrafloralinėmis liaukutėmis. Lapai paprasti, praţanginiai, priešiniai arba menturiniai, pliki arba apaugę retais plaukeliais. Iš 3 pastebimų taurėlapių 2 šoniniai maţi, ţoliniai, trečias didesnis, panašus į vainiklapį, su pentinu, ne ilgesniu uţ patį ţiedą. Vainiklapis, esantis prieš pentinuotą taurėlapį, daţniausiai apskritas. Kuokeliai su plačiais koteliais, sulipę dulkinėmis. Mezginė pailga. Vaisius pailgai kiaušiniška arba cilindriška dėţutė; ji staiga atsidaro, spirališkai susisukant tamprioms sąvaroms, ir sėklos išsvaidomos. Sėklos 10

11 lygios arba smulkiai karpotos, be endospermo. Kai kurios sprigių rūšys pasiţymi smulkiais, kleistogaminiais ţiedais (Snarkis, 1954). Augalo stiebo pagrindas į dirvą įsitvirtina ilgu, tankiu, lignifikuotu audiniu sustiprintu šaknyno tinklu (Pyšek, Prach, 1995). 1.1 pav. Bitinės sprigės (Impatiens glandulifera L.) vegetatyvinė charakteristika. (a) suaugęs augalas, (b) stiebo stiebo atšakos mazgas, (c) daigelis sėklaskiltės stadijoje, (d) lapijos lapas, (e) stiebo pagrindas, kuriame yra pirminis mazgas ir šaknis ant atsitiktinio dirvoţemio paviršiaus (pav. R. Staniforth) Bitinės sprigės (Impatiens glandulifera Royle) morfologinė, fenologinė, geografinė charakteristika Iš vakarų Himalajų kilusi bitinė sprigė pirmiausia 19-ajame šimtmetyje ( m.) į vakarų Europą (Angliją) buvo įveţta kaip dekoratyvinis sodo augalas (Pyšek, Prach, 1995). Tai buvo natūralizacijos ir gausaus paplitimo pradţia šiaurinėje ir centrinėje Europoje, Šiaurės Amerikoje ir Naujojoje Zelandijoje. Pastaruoju metu bitinė sprigė tapo invaziniu augalu beveik visoje Europoje ir toliau skverbiasi į naujas augavietes. Pasauliniu mastu šis augalas daug kur yra įtrauktas į svarbių svetimţemių augalų, kurie uţgrobia natūralią aplinką sąrašus: įeina į Jungtinėje 11

12 Karalystėje paskelbtų invaziškiausių augalų dvidešimtuko sąrašą, Vokietijos ţalingų augalų rūšių sąrašus ir t.t. (Hulme, Bremner, 2006). Šveicarijoje išsamių tyrimų apie bitinės sprigės poveikį vietinei augmenijai nėra, tačiau ji jau įtraukta į šalies invazinių augalų sąrašą (Weber, 1999). Latvijoje augalas stipriai išplitęs ir manoma, kad ateityje toliau jos gausės (Priede, 2008). Kanadoje I. glandulifera išplito po visą šalį, okupuodama pakeles bei upių ir eţerų pakrantes. Tam, kad išsaugoti vietinę rūšinę sudėtį imtasi net konkrečių veiksmų bitinės sprigės likvidavimui (tokių kaip: herbicido glifosfato naudojimas, šienavimas, ravėjimas, deginimas liepsna) (Clements et al., 2007). Net šiaurinėje Kanados dalyje, Aliaskoje, bitinė sprigė sugebėjo natūralizuotis, kur iš pradţių taipogi buvo sodinama kaip dekoratyvinis augalas (Clements et al., 2007). Bitinė sprigė uţauga iki 3 m aukščio, todėl Europoje ji yra aukščiausias vienametis augalas (Pyšek, Prach, 1995), kuris yra priskiriamas ir vabzdţių apdulkinamiems ir savidulkiams augalams ( 2n=18 arba 2n=20). Augalo ţiedo nektaro cukraus koncentracija siekia net 48 %, nustatyta, kad vidutiniškai per valandą augalas pagamina net 0,47 mg cukraus (Chittka, Schürkens, 2001). Vienas augalas daţniausiai subrandina iki 2500 sėklų. Sprogstant dėţutei sėklos yra išmetamos iki 3 5 metrų atstumu nuo tėvinio augalo. Tolimasis plitimas daugiausiai vyksta tarpininkaujant ţmogui (išmetant sodų ir darţų atliekas su svetimkraščių augalų antţeminėmis dalimis, kartu išmetamos ir šio augalo sėklos) ar dėl į vandens telkinius pakliuvusių sėklų sklaidymo, kai pavasarinių potvynių metu su gruntu iš upių pakrančių pernešamos ir sėklos. Prie sėklų tolimojo plitimo taip pat aktyviai prisideda ir gyvūnai. Sėklos dygsta pavasarį, Lietuvoje geguţės mėnesio pradţioje. Augalo sėklų dygimas priklauso nuo aplinkos temperatūros, todėl skirtingose geografinėse zonose sėklų sudygimo laikas bei visa augalo fenologija svyruoja laike. Pavyzdţiui Didiţiojoje Britanijoje bitinės sprigės augalas tryliktą savaitę nuo sudygimo (birţelio pabaigoje) pradeda ţydėti ir ţydi maţdaug dvylika savaičių (iki spalio mėn. ar stiprių šalnų) (Perrins et al., 1993), tuo tarpu, nustatyta, kad Danijoje bitinės sprigės ţydėjimas baigiasi 2 3 savaitėm anksčiau (Kollmann, Ban uelos, 2004). Bitinė sprigė yra vienametis augalas, bet jos sėklos gali išlikti gyvybingos ir ilgiau negu 1 metus. Augalo ūgliai yra labai jautrūs šalnoms, tai gali apriboti net geografinį rūšies pasiskirstymą, tačiau greitas daigų ir jaunų augalų vystymosi tempas įgalina išlikti konkurencingose aplinkose. 12

13 1.2 pav. Bitinės sprigės (Impatiens glandulifera L.) reprodukcinė charakteristika. (a) augalo ţiedo vaizdas iš priekio, (b) augalo ţiedo vaizdas iš šono, (c) augalo sėklos vaizdas iš šono (viršuje) ir augalo sėklos skersinis pjūvis (apačioje), (d) nesprogusios augalo kapsulės vaizdas iš šono (viršuje), išsprogusios augalo kapsulės vaizdas iš šono (apačioje) (pav. R. Staniforth). Gimtuosiuose Himalajuose bitinė sprigė paprastai auga lapuočių ir mišriuose miškuose, teikdama pirmenybę šlapesnėms, tačiau neatviroms saulės spinduliams augavietėms, vengia tankios ţolės dangos. Šiaurinėje Indijoje nuo Kašmyro iki Garhvalio regionų ir Pakistane vidutinis bitinės sprigės augaviečių aukštis virš jūros lygio yra nuo 2000 m iki 2500 m (Gupta 1989; Tanner 2007), bet yra uţregistruoti ir tokie atvejai, kur bitinė sprigė auga 4000 m aukštyje virš jūros lygio (Polunin, Stainton, 1984). Europoje bitinė sprigė renkasi taip pat šlapią ir turtingą maistingomis medţiagomis, natūralią aplinką (Pyšek, Prach, 1995), kur vidutinė dirvoţemio ph 6,0 (Janssens et al., 2006). Tai yra pusiau ūksminis augalas, kurį daţniausiai pasiekia daugiau kaip 10 % ir maţiau kaip 100 % didţiausio spindulių kiekio dienos metu. Augavietės priklauso nuo temperatūros, t. y. nuo geografinės platumos ir aukštumos. Bitinė sprigė tai daţniausiai šilto klimato (retesnis šiaurinėje Europos dalyje) augalas (Ellenberg, 1992). Augavietėse 1 m 2 galima aptikti nuo 10,1 iki 14,0 augalų rūšių. Specifinis lapų plotas tai 1 mm 2 tenkantis 1 mg lapų masės. Bitinės sprigės lapų plotas siekia nuo 30 mm / mg -1 ir daugiau, tad augalas yra priskiriamas vieniems iš didţiausią lapų plotą turintiems augalams. Sausosios masės dalis ţaliojoje masėje siekia iki 15 % (Janssens et al., 2006). Lapų fenologija vasarinė, lapija gyvuoja nuo pavasario iki rudens. Bitinės sprigės geba 13

14 plisti į šonus yra labai ribota tiek erdviniu, tiek laiko poţiūriu (terofitinis augalas). Mikorizė (šaknų simbiozė su grybais) priskiriama tarpinei, tarp % iš visų tirtų atvejų (Geuten et al., 2006). Kol pakanda šalnos, būdingas sezoninis atsinaujinimas sėklomis (vegetacijos pabaigoje augalas sunyksta, o išlieka tik sėklos), sėklų bankas, gyvuoja per ţiemą ir sėklos sudygsta vienu laiku vėlyvą ţiemą ar pavasarį (Grime, et al., 2007). Beerling ir Peerins (1993) pastebėjo, kad aukšti, tuščiaviduriai sumedėję augalų stiebai daţnai išlieka per ţiemą iki pat pavasario, tai padeda išsaugoti okupuotas teritorijas nuo kitų augalų rūšių. Morfologinės šio augalo savybės yra gana pastovios, išskyrus didelę šio augalo ţiedų spalvos įvairovę. Ţiedai gali būti balti, roţiniai, alyviniai ar purpuriniai (Caris et al., 2006). Didţioji dalis roţinių, rausvų ir purpurinių spalvų ţiedų suauga (Geuten, 2004). Ţiedų spalvų intensyvumas yra nevienodas tarp rūšies pavienių augalų, todėl augalai su tarpine spalva taip pat yra paplitę. Augalų su visomis tarpinėmis spalvomis buvimas paaiškinamas sprigės, kaip diploidinio augalo kryţmadulka (Valentine, 1971). Intensyvi, ryški ţiedų spalva dominuoja prieš šviesesnes ţiedų spalvas (Viaene et al., 2009). A B 1.3 pav. Bitinė sprigė (Impatiens glandulifera L.) A bendras augalo vaizdas; B augalo šakelės su ţiedu vaizdas (nuotr. E. Kupčinskienė). 14

15 1.2. Sprigių genties ekofiziologinės savybės Europos šalyse Impatiens genties augalų populiacijos yra intensyviai tyrinėjamos dėl savo skvarbumo ir konkurencingumo uţimant augavietes svetimose ţemėse, tuo pačiu išstumiant vietines augalų rūšis. Daugiausiai yra tyrinėjami šių augalų genetiniai ypatumai, susiję su geografija (Chittka, Schürkens, 2001; Hejda, Pyšek, Jarošík, 2009; Hulme, Bremner, 2006). Baltijos šalyse Impatiens genties tyrimai daugiausia apima morfologinius, fitocenologinius ypatumus bei geografinį šių augalų paplitimą (Gudzinskas, Sinkeviciene, 1995; Priede, 2008). Centrinėje Europoje (Čekijoje) atlikti sudėtingi filogenetiniai ir augaviečių tyrimai rodo, kad labiausiai yra paplitusios keturios Impatiens rūšys: I. noli-tangere yra vietinė rūšis, I. glandulifera maţesnio invazinio lygio rūšis, I. parviflora aukšto invazinio lygio ir I. capensis potencialiai invazinė Europoje rūšis. Tyrime ištirtos augavietės, sėklų sudygimo laikas, atsparumas šalčiui ir reakcijos į aplinkos veiksnius (maistinių medţiagų prieinamumas, vandens gausumas bei apšvietimo intensyvumas). Padaryta išvada, kad I. glandulifera yra pranašesnė dėl ankstyvo daigų sudygimo ir didelio suaugusių augalų dydţio. Daroma prielaida, kad tai ir yra pagrindinė šio augalo dominavimo prieţastis. Antra vertus, išsiaiškinta, kad vietinis I. noli-tangere taip pat turi kai kuriuos palankius bruoţus, tokius kaip didelis sėklų bankas, palyginus aukštas šalčio pasipriešinimas, gebėjimas eksploatuoti aukštus maistingus lygmenis ir toleranciją į ţemo lygio maistingas medţiagas bei vandenį, tačiau tai nesuteikia pakankamų pranašumų prieš invazines Impatiens rūšis (Skálová et al., 2011). Šiaurinėje, centrinėje ir vakarų Europoje atlikti tyrimai parodė, kad šio augalo skvarbumas skirtinguose augaviečių tipuose yra nevienodas (Beerling, 1993; Beerling, Perrins, 1993). Nustatyta, kad bitinė sprigė yra įsigalėjusi ir aktyviai išstumia vietines augalų rūšis tik drėgnose augavietėse bei vandens telkinių pakrantėse (Kollmann et al., 2007). Kitas tyrimas atliktas Čekijoje rodo, kad I. noli-tangere yra labai priklausoma nuo aukštos dirvoţemio drėgmės bei medţių sudaromo pavėsio, o tuo tarpu I. glandulifera rūšiai medţių pavėsis nėra būtinas. Iš to galime spręsti apie galimą konkurenciją tarp Impatiens rūšių. Eksperimento metu iš augavietės pašalinus I. parviflora stipriai pagausėdavo I. noli-tangere rūšies individų, tuo tarpu iš augavietės pašalinus I. noli-tangere, I. parviflora rūšies augalų atsakas gausėjant individams buvo silpnas. Didţiausias augalų padaugėjimas buvo uţfiksuotas I. noli-tangere rūšies, kai pašalinama I. glandulifera rūšis ir silpniausias I. noli-tangere atsakant į I. parviflora pašalinimą. Gauti rezultatai parodo gana blogus vietinio I. noli-tangere konkurencijos gebėjimus (Čuda et al., 2011). Manoma, kad kai kurių augalų invazija yra susijusi su invaziniu atsiskyrimu ir adaptacija į vietines sąlygas. Šiai hipotezei patikrinti buvo sulyginti vienos genties grobikiški augalai su vietiniais. Invazinis atsiskyrimas buvo tirtas, 15

16 naudojant Impatiens noli-tangere, Impatiens glandulifera, Impatiens parviflora ir Impatiens capensis augaluose. Ištirti faktoriai įtakojantys prisitaikymą: dygimas, daigo pasirodymas ir daigo atsparumas šalčiui. Rezultatai buvo matuojami laboratorijoje ir bandomajame sode, naudotos sėklos, surinktos iš penkerių natūralių kiekvienos rūšies augalų individų. Nustatyta, kad I. capensis rūšiai, šaltis nėra barjeras, kad ir toliau plistų į Centrinę Europą. Visų keturių Impatiens rūšių invazinio atsiskyrimo skirtumai buvo susieti su klimato savybėmis pavasario pradţioje. Tai rodo, kad augalai gali būti prisitaikę prie vietinių sąlygų. Vietinė adaptacija nustatyta ir vietinėje ir invazinėse rūšyse (Skálová et al., 2011). Dar vieno tyrimo Čekijoje metu buvo gauti stulbinantys rezultatai: a) Čekijos upių pakrantėse bitinė sprigė uţima 77 % visų upių pakrančių ilgio; b) detaliai išanalizuotose upių pakrantėse neaptikta atsitiktinių rūšių; c) nustatytas stiprus bitinės sprigės skvarbumas į šonus nuo upių pakrančių ir palei intakus prieš upės srovę; d) išplitimas iki dabartinės būklės truko apie 20 metų nuo pirmųjų augalų atsiradimo upių pakrantėse. Bitinė sprigė sparčiu tempu plinta ir toliau (Malikova, Prach, 2010). 1.4 pav. Bitinės sprigės (Impatiens glandulifera Royle) paplitimas Čekijos Respublikoje palei upes. Skirtingais simboliais paţymėtas invazijos pradţios laikas kiekvienoje augavietėje. Skaičiais paţymėtos upės: 1 Svitava, 2 Jizera, 3 Vltava, 4 Berounka. (pav. Malikova, Prach, 2010). Invaziniai augalai, tame tarpe ir Impatiens rūšies augalai greičiau okupuoja dirvoţemio plotus, kuriuose yra nemaţai maistingų medţiagų kiekio, kurie yra daugiau paveikti 16

17 ţmonių antropogeninės veiklos, bei plotus, kurie nėra uţimti vietinių augalų rūšių (Hejda, et al., 2011). Tyrimai atlikti Lenkijoje parodė, kad bitinė sprigė yra daug stipriau įsigalėjusi ţmogaus veiklos paveiktose augavietėse nei natūraliose (Chmura, 2006; Castri, 1989). Białowieża miške atliktas tyrimas analizuojant svetimšalių augalų rūšių paplitimą, augimo ypatybes ir biologines tam tikro augalo ypatybes. Nustatyta, kad tarp 118 nesumedėjusių dekoratyvinių augalų net 15 rūšių buvo keliančios grėsmę gimtajai augmenijai. Tarp šių augalų rūšių buvo ir I. parviflora bei I. glandulifera (Adamowski, 2011). Kitas tyrimas, atliktas Lenkijoje, Krokuvoje parodė ne tipišką taksonominę struktūrą. I. glandulifera populiacijos daugiausia buvo surastos šalikelėse, kur jos buvo dominantinės vietinių augalų rūšių atţvilgiu, taip pat gluosnių tankymėse, ir miško kelių pakraščiuose (Kostrakiewicz, Zając, 2011). Nuo 2006 m. Jungtinėje Karalystėje Impatiens rūšies invaziniai augalai taip pat buvo rinkti ir identifikuoti. Šiuo metu I. glandulifera yra įvertinta kaip labiausiai paplitusi negimtoji augalų rūšis, besiplečianti pakrančių augavietėse Jungtinėje Karalystėje (Tanner et al., 2011). Impatiens išstumia vietines augalų rūšis, kurios savo ruoţtu gali išnaikinti savitąją bestuburių fauną m. atliktas tyrimas naudojant bestuburių viliojimo į spąstus ir rankinio ieškojimo metodus. Ištirtos I. glandulifera 9 populiacijos invaziniuose arealuose ir palyginta su 9 populiacijomis iš natūralių arealų. Šis augmenijos faunos tyrimas parodė nemaţus bestuburių populiacijų skirtumus (Tanner et al., 2011) m. ir 1998 m. Didţiojoje Britanijoje buvo atliktas tyrimas, kurio metu atsitiktinai pasirinktoje vietovėje nustatyti skypai m. juose rastos 123 (1,2 %) nevietinių augalų rūšys, tarp kurių viena iš labiausiai paplitusių buvo I. Glandulifera m. pakartotis tyrimas atskleidė, kad nuo 1990 m. iki 1998 m. nevietinių augalų rūšių skaičius padidėjo nuo 1,2 % iki 1,9 %, vėl gi I. Glandulifera rūšies augalai buvo vieni iš labiausiai dominuojančių augalų rūšių (Maskell et al., 2006). Sitasova Slovakijoje, Kosice regione atliko invazinių augalų tyrimą. Buvo aptikti 34 svetimšaliai augalai, tarp kurių dominavimu pasiţymi I. glandulifera bei I. parviflora (Sitasova, 2011). Austrijoje 2010 m. atliktas tyrimas Traisen upės pakraščiuose. 135 Traisen upės pakraščių plotai įvertinti naudojant 200 m 2 rėmus. Buvo aptiktos 27 neofitų augalų rūšys. 7 iš jų invazinės arba potencialiai invazinės, tarp kurių aptikta ir I. parviflora bei I. glandulifera (Lapin, Bernhardt, 2011). Austrijoje taip pat atlikti tyrimai ir Alpių kalnų centrinėje dalyje. Šioje srityje I. glandulifera uţregistruota jau 1980 m., tačiau nuo to laiko ji nevaldomai išplito. Dar didesnė plėtra prognozuojama ateityje (Pagitz, 2011). Vengrijoje atliktas invazinių augalų tyrimas ties Rába upe. Ištirta 122 km upės pakrantės. Nustatyta, kad viena iš labiausiai pakrantėse išplitusių augalų rūšis I. glandulifera. Ši rūšis formuoja dominuojančias pozicijas ir išstumia natūralią vietinę augmeniją. Tai sukelia natūralios vietinės augmenijos išsaugojimo problemas upės pakrantėje (Balogh, Szabó, 2011). Kitą vertus, Vokietijoje 17

18 trejus metus trukusio tyrimo rezultatai parodė, kad bitinė sprigė nedaro rimtos įtakos karpotojo berţo (Betula pendula L.), paprastosios eglės (Picea abies L.) ir europinio kėnio (Abies alba Mill.) daigų augimui (Ammer et al., 2011). Grobikiškų augalų aleliai taip pat buvo tiriami ir Austrijoje. Visų nuostabai I. balfourii, I. glandulifera, I. parviflora augalų rūšys daugiausiai viršijo Juglone indeksą, o tai reiškia, kad šios augalų rūšys yra potencialiai dominantinės (Csiszár, et al., 2011). Rusijoje buvo atliktas mielių paplitimo tyrimas bitinės sprigės bendrijose aplink augalų lapus, ant ţiedų ir ant šaknų. Taip pat buvo vertinamas ir dirvoţemis aplink augalų šaknis. Nustatyta, kad lapų paviršiuje dominuoja raudonos spalvos turinčios rūšys Rhodotorula mucilaginosa ir Rhodotorula glutinis, aptikta ir vienmetė higrofitinė rūšis Cryptococcus magnus. Stebėtina tai, kad dirvoţemyje aplink bitinės sprigės augalų šaknis aptiktos apskritai dirvoţemiams nebūdingų rūšių Saccharomyces paradoxus, Kazachstania barnettii, ir Torulaspora delbrueckii grybų askosporos. Taigi epifitai ir dirvoţemio mielių kompleksai atstovauja dvi visiškai atskiras bendrijas, neturinčias bendrų rūšių. Dideli skirtumai tarp mielių bendrijų ant bitinės sprigės lapų paviršiaus ir dirvoţemyje aplink augalų šaknis aiškiai susiję su tuo, kad vienmečiai higrofitai labai staigiai (po keletos dienų nuo pirmųjų šalnų) ţūva. Dėl to tarpinės grandies sluoksnio (tarp augalų lapų paviršiaus ir dirvoţemio) mikroorganizmai negali plėtotis (Glushkova et al., 2010). Kito tyrimo metu Rusijoje, Maskvoje, pagrindinio botanikos sodo teritorijoje buvo tiriamas I. glandulifera ir I. noli-tangere tankis: a) ties Lihoborka upės pakrantėmis; b) gluosnių pavėsyje; c) pelkėje prie nendrių m. gauti rezultatai parodė, kad I. glandulifera ir I. parviflora tankis buvo ( augalų / m 2 ), priklausomai nuo augaviečių charakteristikos. Stebėtina, kad augavietėse, kur šie invaziniai augalai buvo pašalinti, metai po metų jų tankumas vis didėjo ir 2008 m. buvo jau apytiksliai 700 augalų / m 2 (Vinogradova, 2011). Tai, kad svetimţemiuose augaluose neaptinkama virusinių ir grybelinių ligų, dalinai įtakoja tokių augalų invazijos sėkmę. Danijoje 2003 m. buvo tiriamas virusinės infekcijos poveikis bitinės sprigės augaluose, kurių sėklos buvo surinktos iš 10 skirtingų Europos regionų (šiaurės Šveicarija Ciūrichas, rytų Prancūzija Mulhausas, pietų Čekijos Respublika Česke Budejovice, vakarų Vokietija Hagenas, rytų Vokietija Hale Leipcigas, rytų Olandija Asenas, šiaurės Anglija Durhamas, rytų Danija Kopenhaga, šiaurės Švedija Umea). Augalai augo bendrame eksperimentiniame sode ir buvo uţkrečiami dvejų rūšių Chenopodium (C. amaranticolor Coste et Reynier, C. quinoa Willd.) ir penkių rūšių Nicotiana (N. benthamiana Domin., N. clevelandi A. Gray., N. debneyi Domin., N. rustica L., N. tabacum L. Xanthi ir Samsun ) virusais. I. glandulifera augaluose virusinės infekcijos labai sumaţino antţeminės augalų dalies biomasę. Infekcijomis apkrėstuose augaluose santykinė stiebo biomasė ir augalo pagrindo skersmuo buvo taip pat maţesni, bet nebuvo jokių reikšmingų augalų aukščio ir 18

19 pagrindinių augalų šakų skaičiaus skirtumų. Virusinės infekcijos taip pat neturėjo įtakos I. glandulifera reprodukcinėms savybėms: ţydėjimo laikui, ţiedadulkių gyvybingumui, sėklų dėţučių brandinumui, sėklų skaičiui dėţutėje ir atskirų sėklų masei. Nustatyta, kad virusas nepersiduoda per sėklas. Iš tyrimo metu gautų rezultatų pateiktas pasiūlymas atsiţvelgti į galimą tokių virusinių infekcijų panaudojimą populiacijų dinamikos bei biologinės kontrolės svetimţemių augalų invazijos atvejais (Kollmann, 2007). Ištirti bitinės sprigės bendrą atsaką herbicidams ir kitiems chemikalams natūralioje augavietėje yra sudėtinga, kadangi augalas auga vandens telkinių pakrantėse, kuriose taip pat gyvena daug įvairių organizmų rūšių, taigi tokiose vietose herbicidų ir kitų chemikalų naudojamas yra draudţiamas arba grieţtai ribojamas. Atliktas tik vienas tyrimas du kartus purškiant bitinės sprigės augalus glifosfatais prieš ţydėjimą. Tikėtasi, kad tokiu būdu bus sustabdytas ar prislopintas augalų sėklų brandinimas. Rezultatas šokiravo tuo, kad chemikalais nupurkštų augalų sėklų produktyvumas bei gausa 99 % nesiskyrė nuo kontrolinės grupės augalų (Wadsworth et al., 2000). Vietiniu mąstu Himalajų sprigė yra įvairiapusiškai tyrinėjama, plačiai aprašinėjama, tačiau stebina tai, kad dar iki šiol nėra atlikta jokių tarptautinio mąsto genetinių tyrimų. Metodiškai ir pagal tiriamą populiaciją bitinės sprigės tyrimai yra menki. Vis dar per maţai tyrimų su bitinės sprigės populiacijom atlikta šiaurinėj Europos dalyje. Lietuvoje tokie tyrimai pradėti, Vytauto Didiţiojo Universiteto genetikos laboratorijoje atliktas bitinės sprigės Lietuvos populiacijų genetinis tyrimas RAPD metodu, bei pradėti Baltijos šalių populiacijų tyrimai, tačiau vis dar išsamių galutinių rezultatų nėra. Palyginimui vaistinė česnakūnė (Alliaria petiolata Brassicaceae) yra gerokai plačiau tirinėjama pasauliniu mąstu (1.1.4 pav.) (Durka et al., 2005). Europoje česnakūnė auga natūraliai, o Šiaurės Amerikoje yra invazinis augalas. 19

20 1.5 pav. Tyrime naudotų natūraliai augančių ir ivazinių vaistinės česnakūnės (Alliaria petiolata Brassicaceae) augaviečių ţemėlapis. Europietiškas alelis aptiktas tiktai vietiniuose, natūraliai augančiuose česnakūnės augaluose (paţymėtas ţalia spalva). Amerikietiškas alelis aptiktas tik invaziniuose česnakūnės augaluose (paţymėtas roţine spalva), bendrasis alelis (paţymėtas geltona spalva) aptiktas ir Š. Amerikoje ir Europoje augančiuose 552 individuose (pav. Durka et al., 2005) Bitinės sprigės naudingosios savybės Čekijos Respublikoje bitinės sprigės paplitimas vandens telkinių pakrantėse pasirodė esąs naudingas tam tikroms kamanių rūšims. Stary ir Tkalcu (1998) priskyrė bitinę sprigę prie augalų, kurie yra svarbūs ir vieni produktyviausių nektaro šaltinių tokioms kamanėms, kaip Megabombus ir Bombus spp. Tai ypač svarbu tuomet, kai vasaros sezono pabaigoje gėlės būna jau nuţydėjusios. Šiaurės Amerikoje ir Europoje bitinė sprigė pritraukia fitofagus vabzdţius, pavyzdţiui amarus, taip palaikydama tam tikrų pelkėtų vietovių vabdzdţių įvairovę (Clements et al., 2007). Tipiniai rausvai violetiniai bitinės sprigės ţiedai primena orchidėjas, todėl yra plačiai 20

21 naudojami kaip dekoratyviniai augalai. Vazonuose augančių bitinių sprigių galima nusipirkti medelynuose ar augalų parduotuvėse, o sėklos pardavinėjamos net internetinėje erdvėje. Kai kuriose Azijos šalyse bitinės sprigės sėklų aliejus naudojamas maistui, atliekant masaţus, taipogi deginamas specialiose lempose patalpų apšvietimui. Bitinė sprigė nepasiţymi gydomosiomis savybėmis, todėl nei farmacijoje nei liaudies medicinoje nenaudojama Metodologija, taikoma sprigių genties genetiniams tyrimams Molekulinės biologijos vystymas vyksta labai sparčiu tempu, to pasekoje atsiado daug įvairių ir greitų techninių genomų tyrimų metodų. DNR tyrimus bei molekulinę analizę galime atlikti su visais organizmais, tame tarpe ir augalais panaudojant molekulinius ţymenis (Parker et al., 1998). Molekuliniai ţymenys yra polimorfinės DNR sekos lokalizuotos tam tikrose genomo vietose ir nustatomos naudojant įvairius molekulinės biologijos metodus. Jais nustatomi dviejų ar daugiau idividų ląstelėse esančios genetinės informacijos skirtumai. Molekuliniai ţymenys tai a) organizmų morfologiniai poţymiai; b) baltyminės (biocheminės) sudėtinės dalys: pirminiai metabolitai bei antriniai metabolitai ir c) molekuliniai (ar DNR) ţymenys. Molekuliniai ţymenys taip pat skirstomi į dominantinius ir kodominantinius. Dominantiniai ţymenys identifikuoja ar genas yra, tuo tarpu kodominantiniai ţymenys identifikuoja alelius. Itin intensyvus molekulinių DNR ţymenų panaudojimas genomų tyrimams pradėtas taikyti po 1980 m., kai buvo parengta metodika polimerazinei grandininei reakcijai (PGR; Saiki et al., 1985). Šios krypties darbų standartizacija ir kokybė turi būti labai tiksli (Joshi et al., 2004). Analizė, panaudojant DNR ţymenis yra vienodai lengvai atliekama įvairiose raidos etapuose iš įvairių organizmo dalių, daţniausiai nepriklauso nuo įvairių aplinkos faktorių ir daug tikslesnė bei objektyvesnė, negu naudojant tradicinius fenotipinius ţymenis, todėl dėl šių pranašumų DNR ţymenų metodas labai išpopuliarėjo. Genetinis polimorfizmas arba genetinė įvairovė yra labai svarbus taikomosiose srityse, tokiose kaip genetiniai populiacijų tyrimai ir evoliucija. DNR polimorfizmo tyrimai leidţia įvertinti genetinę įvairovę ir nustatyti ar vyksta genų kaita? Ar rūšys giminingos? Ar populiacijos giminingos? Ar tikrai tai hibridas? Genetinis polimorfizmas tai genetinių savybių įvairovė toje pačioje populiacijoje, pasiţyminčioje dviem ar daugiau genotipais (Sharma et al., 2008). Ţymenų sistemos pasirinkimas priklauso nuo tyrimo tikslo, poreikių ir galimybių. Siekiant įvertinti genetinę įvairovę, tinkamiausi yra neutralūs ţymenys. Ieškant genų ir poţymių sąsajos, reikalingi genus 21

22 identifikuojantys ţymenys specifiškai susiję (sukibę) su atskirais genais. Kadangi didţioji dalis genomo sudaryta iš nekoduojamos DNR, todėl dauguma tradicinių ţymenų sistemų ţymi nekoduojančias sekas, t. y. šie ţymenys yra neutralūs atrankai ir skirtingai negu morfologiniai poţymiai nepriklauso nuo aplinkos sąlygų (Arnholdt-Schmidt et al., 2000). Yra daug genetinių tyrimų metodų (ribotaipingas, APPD, kartotinių paprastų sekų intarpų metodas, genospaudţių metodas, AFLP metodas ar mikrosatelitinių ţymenų metodas ir t.t.), tinkančių genetiniams sprigių genties populiaciniams tyrimams (Smelcerovic et al., 2005). Labai tikslus metodas, apibūdinantis lokusų pakitimus yra DNR sekoskaita, tačiau tai yra labai brangus ir reikalaujantis didelio kruopštumo metodas (Sharma et al., 2008). 22

23 II. METODINĖ DALIS 2.1. Tyrimo objektas, vietos ir metodai Augalinės medţiagos surinkimas Bitinė sprigė (Impatiens glandulifera Royle) buvo renkama 2012 m. liepos rugpjūčio mėnesiais. Atkreiptas dėmesys į tai, kad renkami augalai būtų iš geografiškai skirtingų Europos vietovių: Lietuva (Rusnė), Olandija (Breda), Vokietija: Heepen, Rintel, Bad Zalzuflen, Seeker, Belgija (Gent), šiaurės Liuksemburgas, pietų Liuksemburgas, Čekijos Respublika (Velky Osek), Austrija, Vengrija ir Šveicarija (Locarno) radaviečių (2.1 lentelė; 2.1 paveikslas). Iš viso surinkta 195 augalų individų iš 13 skirtingų populiacijų: po 15 bitinės sprigių augalų iš kiekvienos radavietės. Augalai buvo renkami pirmąją dienos pusę, kad neprarastų drėgmės. Skinami jauni, be matomų mechaninių paţeidimų ir nedeformuoti vabzdţių bei grybų, visiškai išsiskleidę lapeliai. Audiniai transportavimo metu ir iki DNR išskyrimo laikyti uţšaldyti 20 C temperatūroje, prieš tai suvynioti į popierių ir sudėti į plastmasinius maišelius. 23

24 2.1 lentelė Bitinės sprigės (Impatiens glandulifera Royle) radaviečių geografinės koordinatės Geografinės koordinatės: rytų Radavietė ilguma ir šiaurės Aukštuma (virš platuma jūros lygio m) R. ilg. Š. pl. Lietuva 55 17' 21 22' 1,3 Olandija 52 30' 6 15' 10 Vokietija (Rinteln) 51 54' 9 80' 60 Vokietija (Bad Zalzuflen) 51 49' 8 44' 80 Vokietija (Heepen) 51 47' 8 40' 73 Belgija 50 77' 15 93' 160 Liuksemburgas (Š.) 50 22' 4 24' 513 Liuksemburgas (P.) 50 10' Čekija 49 95' 10 10' 56 Vokietija (Seeker) 49 27' 6 10' 82 Austrija 47 68' 16 61' 214 Vengrija 47 50' 15 43' 267 Šveicarija 46 10' 8 47' 542 Populiacijos buvo surastos ar gautos bendradarbiaujant su kitų šalių augalų invazijos specialistais. Augalai buvo aptikti ir renkami atvirų vandens telkinių pakrantėse, pavienių medţių pavėsyje. Geografinis tyrimui rinktų augalų populiacijų radaviečių ţemėlapis pateiktas 2.1 paveiksle. 24

25 2.1 pav. Bitinės sprigės (Impatiens glandulifera Royle) radaviečių ţemėlapis. Visų bitinės sprigės populiacijų geografiniai atstumai pateikti 2.2 lentelėje. Maţiausias gegrafinis atstumas buvo tarp šiaurės Liuksemburgo ir pietų Liuksemburgo populiacijų 25 km, tuo tarpu didţiausias geografinis atstumas buvo tarp Lietuvos ir Šveicarijos populiacijų 1330 km. Maţiausias geografinis atstumas nuo Lietuvos populiacijos buvo iki Čekijos Respublikos populiacijos 758 km. 25

26 2.2 lentelė. Bitinės sprigės (Impatiens glandulifera Royle) geografiniai atstumai kilometrais. 1 Čekijos Respublika, 2 Austrija, 3 šiaurės Liuksemburgas, 4 pietų Liuksemburgas, 5 Vengrija, 6 Bad Zalzuflen, 7 Heepen, 8 Rinteln, 9 Seeker, 10 Šveicarija, 11 Belgija, 12 Olandija, 13 Lietuva Genominės DNR išskyrimas DNR išskyrimo metodai iš augalų gali būti skirtingi pagal audinių suardymo techniką, lizavimo ir ekstrahavimo buferio sudėtį ar DNR valymo nuo priemaišų etapus, tačiau visi taikomi skyrimo metodai susideda iš trijų pagrindinių etapų: ląstelių sienelių tirpinimo, baltymų ir likusių priemaišų pašalinimo ir DNR iškrisdinimo (Parker, 1998). Bitinės sprigės DNR buvo skiriama naudojant genominės DNR skyrimo rinkinį #K0512 (Fermentas). Darbo eiga: 1. Paruošiama 20 ml TE buferio (200 μl TRIS + 40 μl EDTA + H2O). 2. Pasveriama 100 mg lapo audinio ir trinama skystame azote, naudojant grūstuvėlį ir piestelę. Skiriamas didelis dėmesys lapo audinio visiškam sutrynimui, nes šis etapas yra labai svarbus, norint gauti didesnę DNR išeigą, tuo tikslu būtina visiškai suardyti audinio ląstelių sieneles ir membranas. 3. Susidarę milteliai nedelsiant supilami į 1,5 ml mėgintuvėlius su 200 μl TE buferio ir 400 μl lizės tirpalo mišiniu. 4. Mėginėliai gerai sumaišomi ir laikomi 15 min +65 C temperatūros termostate. Taip suardomos ne tik ląstelių membranos, bet ir denatūruojami baltymai. 26

27 5. Į atvėsintus mėgintuvėlius įpilama 600 μl chloroformo, mėginys gerai sumaišomas ir centrifuguojamas 3 min aps./min centrifugoje. Chloroformu pašalinamos ištirpusios baltymų molekulės, kurios centrifuguojant atsiskyrė iš lizės tirpalo. DNR išliko vandeninėje fazėje, o denatūruoti baltymai tarpinėje ir organinio tirpiklio fazėje μl viršutinės mėginio fazės perkeliama į naują mėgintuvėlį, įpilama 500 μl chloroformo. 7. Sandariai uţdaryti mėgintuvėliai intensyviai pavartomi ir centrifuguojami 2 min aps./min centrifugoje. 8. Po centrifugavivo supernatantas buvo perkeltas į mėgintuvėlius su nusodinimo tirpalu (720 μl sterilaus dejonizuoto vandens ir 80 μl nusodinimo tirpalo iš DNR skyrimo rinkinio) ir centrifuguojamas 3 min aps./min greičiu. 9. Supernantas pašalintas nupilant, mėgintuvėliai nusausinami į popierinę servetėlę, o nuosėdos ištirpintos maišant su 100 μl NaCl tirpalo iš DNR skyrimo rinkinio. 10. Į ištirpusias nuosėdas įlašinama po 0,5 μl ribonukleazės A (Rnase A/T1 Mix) ir inkubuojama termostate 30 min esant +37 C temperatūrai. 11. Po inkubacijos į kiekvieną mėgintuvėlį pilama po 10 μl natrio acetato (20 ml H2O 8,1648 g natrio acetato) ir po 350 μl 96 % šalto (-20 C) etanolio. Mėginiai sumaišomi ir laikomi 30 min -20 C temperatūtoje, kad iškristų DNR. 12. Atšaldyti mėginiai centrifuguojami 3 min aps./min greičiu, atsargiai nupilamas supernatantas, DNR nuplaunama 300 μl 70 % etanolio ir centrifuguojama 3 min aps./min greičiu. 13. Nupilant pašalinami etanolio likučiai ir DNR išdţiovinama steriliame bokse. 14. Į kiekviena mėgintuvėlį su išdţiovinta DNR pilama po 100 μl TE buferio, DBR ištirpinama, atsargiai ją pamaišant Išskirtos genominės DNR koncentracijos ir švarumo nustatymas DNR koncentracija ir švarumas nulemia PGR produktų elektroforezės kokybę, todėl svarbu yra įvertinti šiuos rodiklius. Bitinės ir smulkiaţiedės sprigių DNR koncentracija ir švarumas buvo matuojami nanodropu. Švarių DNR tirpalų optinių tankių santykis, esant 260 nm ir 280 nm ilgio bangoms yra ~1,8. Jei tirpale yra baltymų ar fenolio priemaišų, šis santykis būna maţesnis. Baltymų koncentracija neturi viršyti 0,5 mg / ml ribos. Tirpaluose nebuvo daug priemaišų, todėl pakartotinai genominės DNR valyti nereikėjo. 27

28 Išmatavus DNR koncentracijas, tirpalas buvo praskiestas iki 50 ng / μl. Tolimesniam saugojimui originali DNR buvo laikoma šaldiklyje (-20 C temperatūroje), o iki darbinės koncentracijos praskiesta DNR naudojama atlikti polimerazinei grandininei reakcijai Paprastųjų pasikartojančių sekų intarpų (PPSI) analizės sąlygos Bitinės sprigės populiacijų polimorfizmui ištirti naudojome paprastųjų pasikartojančių sekų intarpų metodą (PPSI). Metodas buvo pasirinktas pagal Provan (2007) tyrimo metu Impatiens Glandulifera pritaikytus PPSI molekulinius ţymenis. PPSI mišinys ir reakcijos sąlygos pateiktos 2.1 ir 2.2 lentelėse. DNR buvo gausinima termocikleriuose. 2.3 lentelė. PGR mišinio sudedamosios dalys vienam DNR pavyzdţiui, mikrolitrais. PGR reakcijos mišinio sudedamosios dalys μl Dejonizuotas vanduo 9,07 Taq buferis (100 mm Tris-HCl, ph 8,8; 25 C, 500 mm 2,50 dntp mišinys (25 nm kiekvieno dntp) (Fermentas) 0,25 MgCl 2 (Fermentas) 1,50 Oligonukleotidinis pradmuo 2,00 Taq polimerazė (5u / μl) (Fermentas) 0,20 DNR (10 ng / μl) 2,00 Visas reakcijos mišinio tūris 20,00 Kiekvienas mėginys supurtomas ir centrifuguojamas, dedamas į termociklerį DNR pagausinimui pagal Provan pagausinimo programą. 2.4 lentelė. DNR pagausinimo Provan reţimo programa. Etapas Temperatūra Laikas Pradinė DNR denatūracija 94 C 3 min DNR denatūracija 94 C 1 min Pradmenų prisijungimas 34 C 1 min DNR sintezė 72 C 1 min Galutinė sintezė 72 C 5 min 35 ciklai 28

29 2.2 pav. Bitinės sprigės (Impatiens glandulifera Royle) DNR pagausinimas atliekamas termocikleryje. PPSI tyrimas buvo išbandytas su 6 oligonukleotidiniais PPSI pradmenimis: ISSR1, ISSR2, ISSR3, ISSR4, ISSR5, ISSR6 (2.4 lentelė). Tolimesniam tyrimui buvo atrinkti keturi geriausiai fragmentus išskirstę pradmenys, kadangi ISSR1 ir ISSR3 pradmenų spektrai buvo vienodi. ISSR3 pradmuo buvo pasirinktas, nes fragmentai buvo ryškesni, o tuo tarpu ISSR1 pradmuo atmestas. Kadangi ISSR6 pradmens išskirstytų fragmentų buvo labai maţai arba visai nebuvo, pradmuo taip pat atmestas. Kiekvienam oligonukleotidiniam pradmeniui termocikleryje pritaikyta vienoda, specifinė pradmenų prisijungimo temperatūra PGR produktų pagausinimo programoje. 29

30 2.5 lentelė. PPSI tyrime išbandyti oligonukleotidiniai pradmenys, jų sekos, DNR pagausinimo reţimo pradmenų prisijungimo temperatūros ir DNR atkarpų dydţiai. Pradmuo Pradmens seka Temperatūra DNR atkarpų dydis, bp ISSR1 GGCC (AG) 8 35 C ISSR2 GGCC (AC) 8 35 C ISSR3 CCGG (AG) 8 35 C ISSR4 CCGG (AC) 8 35 C ISSR5 GCGC (AG) 8 35 C ISSR6 GCGC (AC) 8 35 C PGR produktų elektroforezė Pagausintos DNR atkarpos buvo atskiriamos elektroforezės eigoje, 1,5 % agarozės gelyje (Agarozė Top Vision TM LE GQ,,,Fermentas, Lietuva), pavyzdţiams išryškinti naudotas etidţio bromidas, koncentracija 5 mg/ml (Roth, Vokietija). Darbo eiga: 1. Ruošiant 1,5 % agarozės gelį, agarozės milteliai ištirpinami 0,5 x TBE buferyje (,,Fermentas, Lietuva). 2. Kaitinama mikrobangų krosnelėje, kol tirpalas pasidaro skaidrus ir vientisos išvaizdos. 3. Agarozės tirpalas supilamas į paruoštą formą, įstatomos šukutės, laukiama, kol sustings. 4. Sustingus geliui,,šukutės ištraukiamos. 5. Paruoštas gelis įstatomas į elektroforezės vonelę, pripildytą 0,5 x TBE buferio. 6. Į šulinėlius įnešoma 20 μl APPD PGR produkto, sumaišyto su 2 μl bromfenolio mėlio daţais. Į kraštinius šulinėlius įlašinama po 3 μl DNR atkarpų dydţio standarto GeneRuler TM 100 bp DNA Ladder Plus(,,Fermentas, Lietuva). 7. Prieš paleidţiant elektros srovę į buferį įpilama 25 μl etidţio bromido. 8. Nustatoma 110 V elektros srovė. 9. Elektroforezė vykdoma apie 3 val. 10. Geliai fotografuoti UV transliuminatoriuje (Herolab transliuminator, Vokietija), naudojant Win 32 sistemą. 30

31 2.2 pav. Bitinės sprigės (Impatiens glandulifera Royle) PGR produktų elektroforezė agarozės (1,5 %) gelyje. Elektroforezė vykdoma apie 3 val Elektroforezės duomenų statistinė analizė Elektroforezės rezultatai fotografuojami ir analizuojami. Fragmentų ilgis išmatuotas pagal 100 bp DNR ilgio standartus (Gene ruler DNA Ladder Plus,,,Fermentas, Lietuva). Kiekvieno pavyzdţio DNR PPSI analizė atliekama 2 3 kartus. Palyginant pakartotiniuose eksperimentuose gautus PPSI fenotipus, tolesnei analizei atrenkamos tik aiškios, lengvai atskiriamos ir patikimai atsikartojančios juostos. Vienodo dydţio DNR fragmentai laikomi identiškais (Williams, 1990). Neatsikartojantys, neaiškūs ar blogai gelyje elektroforezės metu atsiskyrę DNR fragmentai nevertinami. 31

32 2.2 pav. Bitinės sprigės (Impatiens glandulifera Royle) penkiolikos augalų individų iš Vengrijos augavietės (IV1 IV15) tyrimo, atlikto PPSI metodu naudojant oligonukleotidinį pradmenį ISSR 3, rezultatai. DNR amplifikacijos produktai atskirti 1.5 % agarozės gelyje. IV1 IV15 takeliuose matomi DNR fragmentai, gauti po atitinkamų genominės DNR pagausinimo. M 100 bp standartinis (MBI Fermentas) DNR fragmentų dydţio ţymuo. Nurodyti fragmentų dydţiai bazių poromis (bp). Naudojant Popgen 1.32 (angl. Population genetic analysis) kompiuterinę programą tarprūšinei ir vidurūšinei genetinei įvairovei įvertinti apskaičiuotas DNR polimorfizmo lygis (P), N a stebimų alelių skaičius, N e efektyvių alelių skaičius pagal Kimura ir Crow (1964), H genetinė įvairovė pagal Nei (1973), I - Shannon o indeksas (1972), apskaičiuoti genetiniai atstumai pagal Nei (1978). Genetiniai atstumai įvertinti atlikus UPGMA (angl. Unweight Pair Group Method with Arithmetic Mean) klasterinę analizę pagal M. Nei ir W. Li algoritmus (Nei, Li, 1979). Dendrogramos nubraiţytos naudojant MEGA 5.03 kompiuterinę programą (Tamura et.al., 2007). GenaAIEx 6 (Genetic Analysis in Exel) (Peakall, Smouse, 2006) kompiuterine programa atlikta principinių koordinačių analizė (angl. Principal Coordinates Analysis), molekulinės genetinės įvairovės analizė AMOVA (angl. Analysis of Molecuar Variance) (Excoffier et al., 1992; Mengoni ir Bazzicalupo, 2002), apskaičiuotas tarppopuliacinę genetinę įvairovę apibrėţiantis komponentas ΦPT bei fiksacijos indeksas FST. 32