33(1 2) SODININKYSTĖ IR DARŽININKYSTĖ. Eina nuo 1983 m. Published since 1983

Transcription

1 LIETUVOS AGRARINIŲ IR MIŠKŲ MOKSLŲ CENTRO FILIALO SODININKYSTĖS IR DARŽININKYSTĖS INSTITUTO IR ALEKSANDRO STULGINSKIO UNIVERSITETO MOKSLO DARBAI SCIENTIFIC WORKS OF THE INSTITUTE OF HORTICULTURE, LITHUANIAN RESEARCH CENTRE FOR AGRICULTURE AND FORESTRY AND ALEKSANDRAS STULGINSKIS UNIVERSITY SODININKYSTĖ IR DARŽININKYSTĖ 33(1 2) Eina nuo 1983 m. Published since 1983 Babtai 2014

2 UDK 634/635 (06) Redaktorių kolegija Editorial Board Dr. Audrius SASNAUSKAS (LAMMC SDI, žemės ūkio mokslai, agronomija) prof. habil. dr. Pavelas DUCHOVSKIS (LAMMC SDI, žemės ūkio mokslai, agronomija) dr. Edite KAUFMANE (Latvija, Latvijos valstybinis sodininkystės institutas biomedicinos mokslai, biologija) dr. Aleksandras KMITAS (ASU, žemės ūkio mokslai, agronomija) dr. Pranas VIŠKELIS (LAMMC SDI, žemės ūkio mokslai, agronomija) dr. Giedrė SAMUOLIENĖ (LAMMC SDI, žemės ūkio mokslai, agronomija) prof. habil. dr. Vidmantas STANYS (LAMMC SDI, žemės ūkio mokslai, agronomija) prof. habil. dr. Andrzej SADOWSKI (Varšuvos ŽŪA, biomedicinos mokslai, agronomija) prof. habil. dr. Algirdas SLIESARAVIČIUS (ASU, žemės ūkio mokslai, agronomija) Redakcinė mokslinė taryba Editorial Scientific Council Dr. Audrius SASNAUSKAS pirmininkas (Lietuva), prof. habil. dr. Pavelas DUCHOVSKIS (Lietuva), dr. Kalju KASK (Estija), dr. Edite KAUFMANE (Latvija), prof. habil. dr. Zdzisław KAWECKI (Lenkija), dr. Giedrė SAMUOLIENĖ (Lietuva), prof. habil.dr. Albinas LUGAUSKAS (Lietuva), habil. dr. Maria LEJA (Lenkija), prof. habil. dr. Lech MICHALCZUK (Lenkija), prof. habil. dr. Andrzej SADOWSKI (Lenkija), prof. dr. Ala SILAJEVA (Ukraina), prof. habil. dr. Algirdas SLIESARAVIČIUS (Lietuva), prof. habil. dr. Vidmantas STANYS (Lietuva), prof. dr. Viktor TRAJKOVSKI (Švedija) Redakcijos adresas: Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialas Sodininkystės ir daržininkystės institutas LT Babtai, Kauno r. Tel. (8 37) Faksas (8 37) El. paštas Address of the Editorial Office: Institute of Horticulture, Lithuanian Research Centre for Agriculture and Forestry LT Babtai, Kaunas district, Lithuania Phone Telefax Leidinio adresas internete Leidinys cituojamas CAB Abstracts, EBSCO Publishing, VINITI duomenų bazėse ISSN Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialas Sodininkystės ir daržininkystės institutas, 2014 Aleksandro Stulginskio universitetas, 2014

3 LIETUVOS AGRARINIŲ IR MIŠKŲ MOKSLŲ CENTRO FILIALO SODININKYSTĖS IR DARŽININKYSTĖS INSTITUTO IR ALEKSANDRO STULGINSKIO UNIVERSITETO MOKSLO DARBAI. SODININKYSTĖ IR DARŽININKYSTĖ (1 2). Naminės obels (Malus domestica Borkh.) Vm geno sąlygojamo atsparumo obeliniam rauplėgrybiui (Venturia inaequalis (Cooke) Wint.) požymių in vitro sąlygomis tyrimas Dalia Gelvonauskienė, Gražina Stanienė, Sidona Sikorskaitė-Gudžiūnienė, Inga Stepulaitienė, Perttu Haimi, Audrius Sasnauskas, Vidmantas Stanys, Danas Baniulis Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialas Sodininkystės ir daržininkystės institutas, Kauno g. 30, LT Babtai, Kauno r., el. paštas Rauplės (V. inaequalis) yra viena žalingiausių kultūrinės obels (M. domestica) ligų. Obelims būdingi kiekybiniai ir kokybiniai atsparumo rauplėms požymiai. Genotipų, kurių atsparumą rauplėms sąlygoja Vm genas, rauplėgrybio infekcijos vietoje pasireiškia superjautrumo atsakas, kuris sustabdo rauplėgrybio infekciją. Rauplėgrybio ir obels sąveikai charakterizuoti pasaulyje taikytos skirtingos in vitro sistemos: nuskintų lapų, lapų diskų, in vitro mikroūglių ir audinių. Ankstesni Vm geno sąlygojamo atsparumo tyrimai, atlikti su nuskintais lapais, parodė, kad indukuojamo superjautrumo atsako efektyvumui įtakos turėjo aplinkos sąlygos ir augalo fiziologinė būklė, todėl tokiems tyrimams atlikti tikslinga imti audinius, užaugintus ir užkrėstus rauplėgrybiu kontroliuojamomis in vitro sąlygomis, deja, tokių tyrimų su obels genotipais, kurių atsparumą sąlygoja Vm genas, nebuvo atlikta. Šiuo tyrimu buvo nustatyti Vm sąlygotu atsparumu, paveldėtu iš Malus atrosanguinea 804, išsiskiriančių obels veislių: Orlovim, Čistotel, Pamiat Isajeva, bei hibrido Nr. SR0523 atsparumo atsako in vitro sąlygomis morfologiniai požymiai. Kaip kontrolinės buvo pasirinktos Gala ir Golden delicious veislių obelys. Tyrimu nustatyta, kad Vm sąlygotu atsparumu išsiskiriantiems obels genotipams in vitro sąlygomis būdinga nesuderinama sąveika su V. inaequalis, o nekrozės požymių pasireiškimo dažnis, priklausomai nuo genotipo, sudaro apytiksliai nuo 23 iki 53 %. Jaunesnio ontogenetinio amžiaus lapams (pirmas trečias lapas nuo ūglio viršūnės) būdingas nekrozės atsako pasireiškimo dažnis yra apytiksliai keturis kartus didesnis nei senesnių lapų (ketvirtas šeštas lapai). Lapų paraudimas yra Vm sąlygotu atsparumu išsiskiriančių genotipų lapams būdinga reakcija į rauplėgrybio infekciją, kurios pasireiškimo dažnis atvirkščiai proporcingas nekrozės pasireiškimo dažniui. Reikšminiai žodžiai: chlorozė, konidijų suspensija, morfologiniai požymiai, nekrozė, obelinis rauplėgrybis, superjautrumas, Vm genas. 3

4 Įvadas. Obelinis rauplėgrybis (V. inaequalis) (toliau rauplėgrybis) sukelia vieną žalingiausių naminės obels (M. domestica) ligų rauples, kuri paplitusi visame pasaulyje (MacHardy, 1996). Per pastaruosius dešimtmečius pasaulyje užregistruota daugiau kaip 200 rauplėms atsparių obels veislių (Sansavini ir kt., 2004). Tačiau daugeliui veislių būdingas dalinis atsparumas arba atsparumas kai kurioms rauplėgrybio rasėms: skirtingiems genotipams būdinga skirtinga rauplėgrybio infekcijos latentinio laikotarpio trukmė, infekcijos sričių dydis, sporuliacijos intensyvumas (MacHardy, 1996). V. inaequalis yra askomicetas, kurio pirmajai infekcijos stadijai būdingos biotrofinės savybės patogeno grybiena auga tarp lapo kutikulos ir epidermio ląstelių. Lauko sąlygomis infekcijos metu sudygusios rauplėgrybio konidijos suformuoja apresoriją ir prasiskverbia pro kutikulą tiek ant rauplėms jautrių, tiek ir ant atsparių obels genotipų lapų (Nicholson ir kt., 1973, 1977; Chevalier, Parisi, 1991). Biotrofiniams ligų sukėlėjams būdinga tai, kad jie sugeba užkrėsti augalo audinius nesukeldami augalo ląstelių apsauginės funkcijos, kurią aktyvina kiti mikroorganizmai. Ant jautrių genotipų lapų po lapo kutikula rauplėgrybis formuoja stromą ir po 7 10 dienų suformuoja konidioforus. Nuo tokių ligų sukėlėjų apsisaugoti augalų ląstelės turi indukuojamą apsaugos mechanizmą, kurį aktyvina atsparumo (R) genai. Šis mechanizmas labai specifiškai atpažįsta ligos sukėlėją sąveikaujant R genui ir ligos sukėlėjo avirulentiškumo (Avr) genui pagal principą genas prieš geną (Jones, Dangl, 2006). Sąveika vyksta tarp ligos sukėlėjo sintetinamo efektoriaus, kurį tiesiogiai ar netiesiogiai koduoja Avr genas, ir augalo ląstelės receptoriaus koduojamo R geno. Tokia Avr ir R genų sąveika aktyvina greitą ir efektyvų apsauginį atsaką, kuris vadinamas efektoriaus aktyvintu imunitetu. Toks apsauginis atsakas dažniausiai infekcijos vietoje aktyvina programuotos ląstelių žūties mechanizmą ir pasireiškia kaip superjautrumo atsakas. Obels atsparumą rauplėms lemia du atsparumo tipai: kokybinis ir kiekybinis (Williams, Kuc, 1969; MacHardy, 1996; Gessler ir kt., 2006). Kiekybinį atsparumą užtikrina daugelio genų sąveika. Jis vadinamas poligeniniu atsparumu. Kokybinių atsparumo požymių paveldėjimas yra susijęs su vienu konkrečiu genu, kuris ir lemia atsparumo požymį. Toks atsparumas vadinamas monogeniniu. Monogeninis atsparumas pasireiškia superjautrumo, chlorozės, nekrozės, žvaigždiškosios nekrozės požymiais arba infekcijos požymių iš viso nebūna. Vm sąlygotu atsparumu išsiskiriančių obels genotipų rauplėgrybio infekcijos vietoje pasireiškia superjautrumo atsakas, kuris sustabdo stromos augimą. Šiam atsakui būdingi morfologiniai požymiai, vadinamosios adatos dūrio duobutės, susidarantys dėl lokalizuotos lapų epidermio ląstelių žūties (Chevalier, Lespinasse, 1994). Superjautrumo atsaku pasireiškiantis Vm sąlygotas atsparumas, būdingas M. micromalus ir M. atrosanguinea 804 palikuonims, yra monogeninio tipo atsparumas, susijęs su Vm genu (Dayton, Williams, 1970). Vm geno pagrindu buvo sukurtos rauplėms atsparios obels veislės. Nors šie genotipai yra jautrūs penktai rauplėgrybio rasei (Williams, Brown, 1968), tačiau Vm sąlygoto atsparumo taikymas išlieka aktualus kuriant rauplėms atsparias veisles pagal piramidinio kryžminimo schemą. Pasaulyje rauplėgrybio ir obels sąveikai charakterizuoti taikytos skirtingos sistemos. Daugelis rauplėgrybio patogeniškumo tyrimų atlikta in vivo, panaudojant skiepytus vaismedžius, augintus sode arba vegetaciniuose induose (Chevalier, Lespinasse, 1994; Liebhard ir kt., 2003; Holzapfel ir kt., 2012). Tokie eksperimentai 4

5 yra nepakankamos apimties ir sezoniški, todėl imta taikyti nuskintų lapų testus in vitro. Percival, Boyle (2009), Percival (2010) naudojo skirtingais preparatais purkštų Golden Delicious veislės obelų nuskintus lapus rauplių infekcijai charakterizuoti laboratorijos sąlygomis. Schenato ir kt. (2008) nuskintų lapų testą taikė rauplėgrybio rasinėms identifikuoti, o Liebhard ir kt. (2003) obels hibridų atsparumo požymiams charakterizuoti. Kitose laboratorijose, siekiant charakterizuoti obels veislių atsparumą rauplėgrybiui, taikytas lapų diskų testas. Benaouf ir Parisi (1998) sėkmingai pritaikė lapų diskų testą trims rauplėgrybio rasėms charakterizuoti, panaudodami 16 skirtingų obels genotipų lapų diskus. Rauplių infekcijos požymiai ir rauplėgrybio sporuliacija buvo įvertinti praėjus 21 dienai po užkrėtimo ir nustatyta, kad daugeliu atvejų jie buvo tokie patys, kaip ir lauko sąlygomis. Tik Va geno sąlygotu atsparumu išsiskiriantiems obels klonams, užkrėstiems penkta rauplėgrybio rase, pasireiškė suderinamumo reakcija, kuri nebūdinga lauko sąlygomis. Win ir kt. (2003) atliko Vm sąlygotą atsparumą aktyvinančio rauplėgrybio efektoriaus tyrimus, panaudodami obels lapus. Nuskinti obels lapai, infiltruoti rauplėgrybio kultūros filtratu, buvo inkubuoti klimatinėje kameroje. Su Vm atsparumu susijęs nekrozės atsakas pasireiškė po 16 valandų arba vėliau. Autoriai pabrėžia, kad atsako efektyvumui įtakos turėjo aplinkos sąlygos ir kartais nekrozės atsakas nepasireikšdavo, jei lapai būdavo nuskinti nuo aukštoje temperatūroje (aukštesnėje kaip 30 C) augusių augalų arba nuo ūglių su susiformavusiais pumpurais, būdingais augalui pereinant į ramybės būseną. Todėl tokiems tyrimams būtų tikslinga naudoti audinius, užaugintus ir užkrėstus rauplėgrybiu kontroliuojamomis in vitro sąlygomis. Yepes ir Aldwinckle (1993 a, 1993 b) pirmieji panaudojo mikroūglius ir nuskintus lapus obels atsparumui rauplėms vertinti in vitro sąlygomis. Nustatyta, kad po 21 dienos ant jautrių veislių lapų išryškėja chlorozės požymiai, o po 35 dienų juos pakeičia nekrozės požymiai. Ivanicka ir kt. (1996) palygino atsparumo požymius, būdingus trijų genotipų augalams, augintiems lauko sąlygomis, nuo jų nuskintiems lapams ir in vitro sąlygomis augintiems mikroūgliams. Guillaumès ir kt. (1995) įvertino rauplėgrybio infekcijos požymių, būdingų Gala veislės įsišaknijusiems augalams ir in vitro sąlygomis auginamiems mikroūgliams, skirtumus. Panašius rezultatus gavo Raman ir Goodwin (2001): jie vertino šešių obels genotipų atsparumą rauplėms panaudodami ūglių viršūnes (2 3 cm), subrendusius lapus, in vitro sąlygomis augintų mikroūglių lapų diskus ir kaliaus kultūrą. Visais atvejais, užkrėtus audinius in vitro sąlygomis, rauplėgrybio micelis augo ant lapų paviršiaus kutikulos, tačiau ant rauplėgrybiui atsparių veislių jis augo silpnai ir be sporuliacijos požymių, o ant jautrių veislių lapų po 3 5 savaičių išryškėjo chlorozės, nekrozės ir rauplėgrybio sporuliacijos požymiai. Šie tyrimai parodė, kad rauplėgrybio infekcijai in vitro yra būdingi skirtingi morfologiniai požymiai, kurie gali būti susiję su augalų auginimo in vitro sąlygomis bei augalų ir mikroūglių fiziologiniais skirtumais. Atlikus minėtus in vitro sąlygomis auginamos obels audinių ir rauplėgrybio sąveikos tyrimus buvo charakterizuotas Freedom veislės superjautrumo atsakas. Šiai veislei būdingas Vf geno sąlygotas atsparumas ir superjautrumo atsaką indukuojantis atsparumas, paveldėtas iš Paprastojo antaninio (Yepes, Aldvinckle, 1993 a, 1993 b). Taip pat buvo tirti su Vg genu susiję nekrozės požymiai, būdingi Golden delicious veislei (Yepes, Aldvinckle, 1993 a, 1993 b; Ivanicka ir kt., 1996). Tačiau atliekant tyrimus in vitro sąlygomis nebuvo charakterizuoti superjautrumo atsako požymiai, būdingi genotipams, paveldėjusiems Vm geno 5

6 sąlygotą atsparumą iš M. atrosanguinea 804. Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro Sodininkystės ir daržininkystės institute (LAMMC SDI) atliekami obels genetinių išteklių saugojimo in vitro sąlygomis bei jų biologijos tyrimai. Sukurta atsparių rauplėms obelų hibridų atrankos in vitro sistema embrioniniu obelų vystymosi tarpsniu (Gelvonauskienė, Stanys, 2000, 2002). Atliekami rauplėgrybio indukuojamo superjautrumo atsako bei atsparumo požymių charakterizavimo in vitro sąlygomis tyrimai (tyrimai apžvelgti Baniulio ir kt., 2013). Molekuliniams superjautrumo apsauginio atsako mechanizmo tyrimams atlikti reikalinga patikima modelinė in vitro audinių sistema, kuri užtikrintų kontroliuojamą atsako indukciją ir efektyvų jo pasireiškimą. Iki šiol rauplėgrybio indukuojamo superjautrumo atsako tyrimams lauko sąlygomis dažniausiai buvo naudoti obels genotipai, Vm sąlygotą atsparumą paveldėję iš M. atrosanguinea 804. Darbo tikslas charakterizuoti Vm geno sąlygotu atsparumu (paveldėtu iš M. atrosanguinea 804) išsiskiriančių naminės obels genotipų obelinio rauplėgrybio indukuoto atsako morfologinius požymius in vitro sąlygomis. Tyrimo objektas, metodai ir sąlygos. Tyrimas atliktas m. Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro Sodininkystės ir daržininkystės instituto Sodo augalų genetikos ir biotechnologijos skyriuje. Tyrimams buvo naudoti skirtingo atsparumo rauplėms naminės obels genotipai. Jie buvo pasirinkti atsižvelgiant į žinomus būdingus monogeninio Vm sąlygoto atsparumo rauplėgrybiui požymius ir naudojant obels atsparumo rauplėgrybiui vertinimo lauko sąlygomis duomenis (duomenys neskelbti) (1 lentelė). 1 lentelė. Obelų veislių kilmė ir atsparumas rauplėms Table 1. Origin and scab resistance of apple cultivars Veislė Tėvai Cultivar Parentage Orlovim Paprastasis antaninis hibridas Nr. SR0523 Čistotel Paprastasis antaninis hibridas Nr. SR0523 Pamiat Isajeva Paprastasis antaninis hibridas Nr. SR0523 Hibridas Red Melba Nr. SR0523 ( Wolf River Malus atrosanguinea 804) Gala Golden Delicious Kidd s Orange Red Golden Nežinomi (manoma, Delicious Golden Reinette Grimes Golden ) Unknown (most likely Golden Reinette Grimes Golden Kilmės šalis Origin Rusija Russia Rusija Russia Rusija Russia Olandija Netherlands Naujoji Zelandija New Zealand JAV USA Atsparumo genas Šaltinis Resistance gene Reference Vm Sedov ir kt. (1989) Vm Sedov ir kt. (1989) Vm Sedov ir kt. (1989) Vm Ryabtsev (2000) Jautri rauplėms Scab susceptible Vg (vidutiniškai jautri) Vg (moderately scab susceptible) Schenato ir kt., (2008) Bénaouf, Parisi (1998) 6

7 LAMMC SDI genetinių išteklių kolekcijoje auginamos obelų veislės: in vitro sąlygomis Orlovim, Čistotel, Pamiat Isajeva, hibridas Nr. SR0523, Gala, Golden delicious ; lauko kolekcijoje Orlovim, Gala. Tyrimams buvo naudojamos rauplėgrybio konidijos, surinktos nuo obels lapų lauko kolekcijoje. Jo izoliatai G-1, L-4, E-35 buvo išskirti LAMMC SDI ir auginti ant agarizuotos 4 % salyklo ekstrakto terpės 19 C temperatūroje. M i k r o ū g l i ų a u g i n i m a s. Buvo tirta obels ir rauplėgrybio tarpusavio sąveikos raiška ant obels lapų, nuskintų nuo mikroūglių arba nuo lauko kolekcijoje augančių augalų. Mikroūgliai buvo dauginti ir auginti ant Murashige ir Skoog (MS) terpės (Murashige, Skoog, 1962) su 0,75 mg l -1 benzilamino purino, 3,0 % sacharozės, 0,8 % agaro kontroliuojamomis sąlygomis: temperatūra +22 ± 3 C, apšvietimas fluorescencinėmis lempomis μm m -2 s -1 tankio fotonų srautas, šviesos ir tamsos fotoperiodas atitinkamai 16 ir 8 valandos. L a p ų u ž k r ė t i m a s r a u p l ė g r y b i o k o n i d i j ų s u s p e n s i j a. Tyrimams in vitro sąlygomis atlikti buvo naudoti skirtingo ontogenetinio amžiaus lapai (pirmas šeštas lapai nuo mikroūglio viršūnės). Jie buvo nuskinti nuo keturių ir septynių savaičių amžiaus kultūros mikroūglių. Nuskinti lapai buvo padėti apatine (abaksialine) puse ant 1 % vandens agaro terpės Petri lėkštelėse (lapkočiai įsmeigti į terpę) ir 2 paras laikyti 19 C temperatūroje tamsoje. Po to ant kiekvieno lapo buvo užlašinta po 3 6 lašus (po 2µl) rauplėgrybio konidijų suspensijos (0,25 2, ml -1 ). Lėkštelės su užkrėstais lapais 2 paras laikytos 19 C temperatūroje tamsoje, po to 19 C temperatūroje apšvietus fluorescencinėmis lempomis μmol m -2 s -1 intensyvumu, taikant atitinkamai 16 ir 8 valandų šviesos ir tamsos fotoperiodą. Obels ir rauplėgrybio sąveikos raiškai nustatyti in vitro sąlygomis buvo vertinti lapų morfologiniai pokyčiai ar yra nekrozės, paraudimo, chlorozės požymių. Vertinimai buvo atlikti praėjus 7 ir 14 parų nuo lapų užkrėtimo rauplėgrybiu. Bandymai kartoti 3 kartus, kiekvieną kartą tiriant po lapus. L a p ų p a r u o š i m a s r a u p l ė g r y b i o k o n i d i j ų d y g i m o i n t e n - s y v u m u i t i r t i. Skirtingo atsparumo obelų įtakai ligų sukėlėjo konidijų dygimo intensyvumui nustatyti rauplėgrybiu užkrėstų lapų audiniai buvo fiksuoti ir dažytos konidijos. Audiniai fiksuoti 60 min. 65 C temperatūros etanolio ir acto rūgšties (santykis 96 : 4) mišinyje, konidijos dažytos 40 min. 23 C temperatūros pieno rūgšties ir metileno mėlio (fenolio 29 %, pieno rūgšties 29 %, glicerolio 13 %, metileno mėlio (0,5 %) 29 %) mišinyje (santykis 95 : 5). Konidijų dygimo intensyvumas buvo tirtas praėjus 6 ir 24 valandoms nuo lapų užkrėtimo rauplėgrybio suspensija. Suskaičiuotos nesudygusios, pradėjusios dygti (hifas trumpesnis už konidiją) ir sudygusios (hifas ilgesnis už konidiją) konidijos. Bandymas buvo kartotas 3 kartus, kiekvieną kartą tiriant po konidijas. R a u p l ė g r y b i o k u l t ū r o s f i l t r a t o i n f i l t r a c i j a į l a p u s. Rauplėgrybio L-4 izoliato kultūros sterilus auginimo terpės filtratas buvo infiltruotas į lapus, nuskintus nuo lauko kolekcijoje augančių augalų (antras ketvirtas lapai nuo ūglio viršūnės). Rauplėgrybio filtrato paruošimas ir infiltracijos procedūra buvo atlikti pagal Win ir kt. (2003) aprašytą metodiką. Lapai po infiltracijos buvo padėti abaksialine puse ant 1 % vandens agaro terpės Petri lėkštelėse ir laikyti tomis pačiomis sąlygomis, kaip ir rauplėmis užkrėsti lapai, nuskinti nuo in vitro sąlygomis augusių 7

8 augalų. Izoliuotų obels lapų atsako į rauplėgrybio filtratą raiška (audinių nekrozė) buvo vertinama po 96 valandų. Bandymas kartotas 3 kartus, kiekvieną kartą tirta po lapus ir infiltracijos vietas. Tyrimo rezultatų skyrelyje pateikti duomenų vidurkis ir standartinė vidurkio paklaida buvo skaičiuojami naudojant Microsoft Excel programą. Statistinė duomenų analizė atlikta vienfaktorinės dispersinės analizės metodu, taikant Fišerio mažiausiai reikšmingo skirtumo kriterijų (Tarakanovas, Raudonius, 2003). Rezultatai. Rauplėgrybiui būdingas genetinis kintamumas, kuris gali turėti įtakos jo izoliatų virulentiškumui. Be to, penktai rauplėgrybio rasei būdinga suderinamumo reakcija, jis gali užkrėsti Vm sąlygotu atsparumu išsiskiriančius obels genotipus (Williams, Brown, 1968). Obels atsparumo rauplėms tyrimams atlikti dažniausiai naudojama 10 6 ml -1 koncentracijos rauplėgrybio konidijų suspensija (Percival, 2010). Buvo tirta LAMMC SDI išskirtų ir atrinktų rauplėgrybio izoliatų G-1, L-4 ir E-35 sąveikos su Vm sąlygotu atsparumu išsiskiriančių veislių Orlovim ir Pamiat Isajeva obelų lapais raiška in vitro sąlygomis. Tirti rauplėgrybio izoliatai neturėjo augimo ir sporuliacijos požymių, būdingų penktajai rauplėgrybio rasei, tačiau aptikta lapų audinių nekrozės požymių. Atliekant tyrimą su abiem obels genotipais, buvo pastebėta, kad L-4 izoliato sukeltos nekrozės pasireiškimo dažnis buvo didžiausias (1 pav.). Remiantis gautais tyrimų rezultatais minėtas rauplėgrybio izoliatas buvo naudotas tolesniems tyrimams atlikti. 1 pav. Skirtingų V. inaequalis izoliatų konidijų suspensijos įtaka nekrozės pasireiškimo dažniui ant Vm geno sąlygotu atsparumu išsiskiriančių obels veislių lapų in vitro sąlygomis (inkubacija 14 parų) Fig. 1. Effect of conidia suspension of different V. inaequalis isolates on level of expression of necrosis on in vitro leaves of Vm resistant apple cultivars (14 day incubation) 8

9 Papildomai buvo tirtas L-4 izoliato gebėjimas sukelti nesuderinamumo reakciją ant sode augintų augalų lapų, taikant sterilaus rauplėgrybio augimo terpės filtrato infiltraciją pagal Win ir kt. (2003). Sterilus filtratas ir vanduo (kontrolė) buvo infiltruoti į Orlovim ir Gala veislių nuskintus lapus. Po 4 parų rauplėgrybio filtrato infiltracija sukėlė lapų audinių nekrozę: ji pasireiškė vidutiniškai ant 79 ± 5 % lapų ir 60 ± 8 % infiltracijos vietų. Ant vandeniu infiltruotų kontrolinių lapų ir rauplėgrybiui jautrios veislės Gala lapų nekrozei būdingų požymių neaptikta. Ant Vm geno sąlygotu atsparumu išsiskiriančių veislių mikroūglių lapų L-4 izoliato, auginto ant 4 % salyklo terpės, indukuotos nekrozės požymiai maksimaliai pasireiškė praėjus savaitei nuo jų užkrėtimo 0, ml -1 koncentracijos konidijų suspensija (2 pav.). Papildoma savaitės trukmės inkubacija maksimaliam nekrozės požymių pasireiškimui ant lapų esminės reikšmės neturėjo. Tyrimo laikotarpiu ant rauplėgrybiui jautrių genotipų ( Gala, Golden delicious veislės) mikroūglių lapų suderinamumo reakcijos ir nekrozės požymių neaptikta. 2 pav. Rauplėgrybio konidijų suspensijos koncentracijos įtaka nekrozės pasireiškimo ant Vm geno sąlygotu atsparumu išsiskiriančių obels veislių: Orlovim, Čistotel, Pamiat Isajeva, selekcinio numerio SR0523 lapų dažniui in vitro sąlygomis Fig. 2. Effect of concentration of conidia suspension on level of expression of necrosis on in vitro leaves of Vm resistant apple cultivars Orlovim, Čistotel, Pamiat Isajeva, No. SR0523 Tiriant mikroūglių lapus, nuskintus nuo in vitro sąlygomis augintų augalų, buvo įvertinta skirtingo atsparumo rauplėms genotipų įtaka rauplėgrybio L-4 izoliato konidijų dygimui pirmaisiais infekcijos etapais (3 pav.). Tyrimo rezultatai parodė, kad nei genotipas, nei inkubacijos trukmė neturėjo įtakos konidijų daigumui: nesudygusios konidijos sudarė vidutiniškai 3 8 %. Tačiau obels genotipas turėjo įtakos konidijų dygimo greičiui. Nustatyta, kad ant Gala veislės lapų konidijos dygo greičiau nei ant 9

10 3 pav. Skirtingo atsparumo rauplėms obelų veislių įtaka V. inaequalis konidijų dygimo greičiui in vitro sąlygomis Fig. 3. Effect of apple cultivars with different scab resistance traits on V. inaequalis conidia germination rate in vitro Orlovim : po 6 valandų inkubacijos pradėjusių dygti konidijų buvo atitinkamai 50 ± 4 ir 81 ± 13 %, o sudygusių atitinkamai 45 ± 4 ir 16 ± 9 %. Po 24 valandų inkubacijos ant Gala veislės lapų pradėjusių dygti konidijų liko 30 ± 6 %, ant Orlovim 44 ± 10 %, o sudygusių konidijų kiekis padidėjo atitinkamai iki 67 ± 5 ir 47 ± 7 %. Buvo tirta rauplėgrybio L-4 izoliato konidijų suspensijos indukuoto nekrozės atsako raiškos dažnis ir mikroūglių kultūros amžiaus įtaka nekrozės pasireiškimui. Gauti tyrimų rezultatai parodė, kad skirtingų obels genotipų rauplėgrybio indukuojamo nekrozės atsako raiškos dažnis po 14 parų inkubacijos buvo skirtingas (4 pav.). Dažniausiai nekrozės požymiai pasireiškė ant Pamiat Isajeva veislės keturių savaičių amžiaus mikroūglių lapų (53 ± 15 %) ir hibrido Nr. SR0523 septynių savaičių amžiaus mikroūglių lapų (40 ± 9 %). Tiriant kitas veisles nustatyta, kad nekrozės požymių pasireiškimo ant lapų dažnis įvairavo apytiksliai nuo 23 iki 29 % nepriklausomai nuo mikroūglių kultūros amžiaus. Statistinė duomenų analizė parodė, kad esminio skirtumo tarp nekrozės požymių pasireiškimo ant skirtingo amžiaus mikroūglių kultūros dažnio nenustatyta (P > 0,05). Iš esmės (P = 0,05) didesnis tik nekrozės požymių pasireiškimo ant Pamiat Isajeva veislės mikroūglių dažnis, palyginti su kitų genotipų keturių savaičių amžiaus mikroūgliais. Tyrimo laikotarpiu ant užkrėstų rauplėgrybiui jautrių genotipų ( Gala, Golden delicious veislės) mikroūglių lapų ir ant visų tirtų kontrolinių genotipų mikroūglių lapų, kurie buvo veikti vandeniu, nekrozės požymių nenustatyta. 10

11 4 pav. Mikroūglių kultūros amžiaus įtaka nekrozės pasireiškimui ant Vm geno sąlygotu atsparumu rauplėms išsiskiriančių obelų lapų in vitro sąlygomis (inkubacija 14 parų) Fig. 4. Effect of age of microshoot culture on level of expression of necrosis on in vitro leaves of Vm resistant apple cultivars (14 day incubation) Buvo įvertinta keturių savaičių amžiaus kultūros mikroūglių lapų ontogenetinio amžiaus įtaka nekrozės pasireiškimui ant pirmo trečio ir ketvirto šešto lapų nuo ūglio viršūnės nepriklausomai nuo genotipo. Statistinė duomenų analizė parodė, kad nekrozės pasireiškimo dažnis šiose grupėse reikšmingai skiriasi (P = 0,01): pirmo trečio lapo grupėje jis buvo 51 ± 21 %, ketvirto šešto lapo grupėje 13 ± 12 %. Ant rauplėgrybiu užkrėstų lapų, be nekrozės požymių, buvo pastebėti spalvos pasikeitimo požymiai chlorozė ir paraudimas. Po 14 parų inkubacijos rauplėgrybiu užkrėstų Vm sąlygotu atsparumu išsiskiriančių obels genotipų chlorozės požymių raiškos dažnis buvo nevienodas: Orlovim ir Čistotel veislių atitinkamai 11 ± 8 ir 13 ± 5 %, o Pamiat Isajeva veislės ir hibrido Nr. SR0523 atitinkamai 6 ± 0,4 ir 5 ± 4 %. Ant rauplėgrybiui jautrių veislių Gala ir Golden delicious mikroūglių lapų taip pat atsirado chlorozės požymių: raiškos dažnis atitinkamai 2 ± 1 ir 10 ± 5 %, o ant visų tirtų kontrolinių genotipų mikroūglių lapų, kurie buvo veikti vandeniu, chlorozės požymių nenustatyta. Tiriant Vm geno sąlygotu atsparumu išsiskiriančius genotipus tomis pačiomis sąlygomis, skirtingas buvo ir lapų paraudimo požymių raiškos dažnis. Nepriklausomai nuo mikroūglių kultūros amžiaus, didžiausias buvo Čistotel veislės paraudusių lapų dažnis apytiksliai 30 ± 1 %, Pamiat Isajeva veislės 5 ± 2 %, o Orlovim veislės ir hibrido Nr. SR0523 atitinkamai 14 ± 4 ir 13 ± 6 %. Ant užkrėstų rauplėgrybiui jautrių genotipų ( Gala ir Golden delicious veislės) ir ant kontrolinių mikroūglių lapų, veiktų vandeniu, paraudimo požymių nepastebėta. Ištirta mikroūglių kultūros amžiaus įtaka paraudimo pasireiškimui ant Vm 11

12 sąlygotu atsparumu išsiskiriančių genotipų lapų. Statistinė duomenų analizė parodė, kad priklausomai nuo mikroūglių kultūros amžiaus iš esmės (P = 0,05) padidėjo tik Orlovim veislės lapų paraudimo požymių pasireiškimo dažnis (nuo 10 ± 0 iki 44 ± 9 %) (5 pav.). 5 pav. Mikroūglių kultūros amžiaus įtaka Vm geno sąlygotu atsparumu išsiskiriančių veislių lapų paraudimo raiškai in vitro sąlygomis Fig. 5. Effect of age of microshoot culture on level of reddening of in vitro leaves of Vm resistant apple cultivars Tiriant kitas veisles esminio skirtumo tarp skirtingo amžiaus mikroūglių kultūros ir paraudimo požymių pasireiškimo dažnio nenustatyta. Ant Pamiat Isajeva veislės keturių savaičių amžiaus mikroūglių lapų paraudimo požymių neaptikta, tačiau jų buvo matyti ant šios veislės septynių savaičių amžiaus mikroūglių kultūros lapų. Aptarimas. Rauplėgrybio superjautrumo apsauginio atsako mechanizmo tyrimams atlikti reikia sukurti patikimą modelinę sistemą, kuri užtikrintų kontroliuojamą atsako indukciją ir efektyvų jo pasireiškimą. Benauouf ir Parisi (1998), Win ir kt. (2003) tyrimais patvirtino, kad Vm geno sąlygotu atsparumu išsiskiriančiam hibridui Nr. 9AR2T196 būdingas superjautrumo atsakas pasireiškia ant nuskintų lapų ir lapų diskų. Kita vertus, Win ir kt. (2003) nurodo, kad atsako efektyvumui turėjo įtakos aplinkos sąlygos ir augalo fiziologinė būklė. Todėl šiuo tyrimu buvo analizuojami griežtai kontroliuojamomis sąlygomis in vitro užaugintų augalų audiniai. Tyrimui buvo pasirinkti keturi Vm sąlygotu atsparumu, paveldėtu iš M. atrosanguinea 804, išsiskiriantys genotipai: Orlovim, Čistotel, Pamiat Isajeva veislės ir hibridas Nr. SR0523 (1 lentelė). Pirmieji trys genotipai yra Paprastojo antaninio veislės palikuonys, gauti sukryžminus šią veislę su hibridu Nr. SR0523, o pastarasis 12

13 yra tiesioginis kryžminimo kombinacijos su M. atrosanguinea 804 palikuonis. Lauko sąlygomis visiems šiems genotipams yra būdingas su Vm geno sąlygotu atsparumu susijęs rauplėgrybio infekcijos indukuojamas superjautrumo atsakas. Ar šiems genotipams būdingas ir iš Paprastojo antaninio paveldėtas Va geno sąlygoto atsparumo lemiamas superjautrumo atsakas, tikslių duomenų nėra. Vertinimas lauko sąlygomis parodė, kad Orlovim veislė ir hibridas Nr. SR0523 tik iš dalies atsparūs penktai rauplėgrybio rasei (aptikta chlorozės ir silpnos sporuliacijos požymių), o tiriant Čistotel ir Pamiat Isajeva veisles suderinamumo reakcijos su rauplėgrybiu nenustatyta (duomenys neskelbti). Tokie duomenys patvirtina prielaidą, kad pastarieji du genotipai yra paveldėję ne tik Vm, bet ir Va geną, kuris užtikrina atsparumą penktai rauplėgrybio rasei. Ankstesnių tyrimų rezultatai parodė, kad monogeninio atsparumo požymiai, nustatyti lauko sąlygomis, gali nesutapti su in vitro sąlygomis pasireiškusiais požymiais: Benaouf ir Parisi (1998) nustatė, kad Va geno sąlygotu atsparumu išsiskiriančių klonų lapų diskus užkrėtus penktos rasės rauplėgrybiu pasireiškė suderinamumo reakcija, paprastai nepasireiškianti lauko sąlygomis. Atlikus šį tyrimą, taikant infiltracijos steriliu rauplėgrybio filtratu testą sode užaugintos Orlovim veislės obels lapams pagal Win ir kt. (2003), buvo gauti analogiški rezultatai, kaip ir atliekant bandymą su mikroūglių lapais in vitro sąlygomis: nors sode augintų obelų lapams buvo būdingas didesnis nekrozės požymių dažnis nei augintų in vitro sąlygomis (atitinkamai 79 ± 5 ir 28 ± 9 %), tačiau abiem atvejais suderinamumo reakcijos nenustatyta. Skirtingiems V. inaequalis izoliatams būdingas nevienodas konidijų dygimo greitis, sporuliacijos intensyvumas, inkubacinio laikotarpio trukmė, adaptacinė geba sąveikauti su tam tikrais skirtingos genetinės atsparumo rauplėms kontrolės genotipais. Ligos sukėlėjo ir augalo sąveikos požymių raišką gali nulemti ligos sukėlėjo infekcinio fono stiprumas. Skirtingi autoriai, atlikdami obels atsparumo rauplėgrybiui tyrimus, naudoja nevienodos koncentracijos konidijų suspensiją: Percival (2010) 10 6 ml -1, Nicholson ir kt. (1977) 1,5 3, ml -1, Win ir kt. (2003) ml -1. Mūsų atliktais tyrimais nustatyta, kad in vitro sąlygomis ant Vm geno sąlygotu atsparumu išsiskiriančių veislių mikroūglių lapų nekrozės požymiai išryškėjo intensyviausiai juos užkrėtus L-4 izoliato konidijų suspensija, kurios koncentracija buvo 0, ml -1. Mūsų atliktas rauplėgrybio ir obels sąveikos charakterizavimo tyrimas dar parodė, kad rauplėgrybio konidijų dygimo greičiui įtakos turi obels genotipas. Nustatyta, kad ant Gala veislės lapų konidijos dygo greičiau ir po 6 valandų sudygusių konidijų buvo apytiksliai tris kartus daugiau nei ant Orlovim veislės (atitinkamai 45 ± 4 ir 16 ± 9 %), o po 24 valandų inkubacijos šis skirtumas sumažėjo apytiksliai iki 1,5 karto (atitinkamai 67 ± 5 ir 47 ± 7 %). Kas slopina konidijų dygimą ir ar tai yra susiję su atsparumo rauplėgrybiui požymiais, nežinoma, tačiau konidijų dygimo ypatumai yra reikšmingi tolesnei infekcijos eigai ir gali turėti įtakos atsparumo požymių pasireiškimui. Tyrimo laikotarpiu ant rauplėgrybiui jautrių genotipų ( Gala, Golden delicious veislės) mikroūglių lapų suderinamumo reakcijos ir nekrozės požymių nenustatyta. Po 14 parų pastebėta tik būdingų chlorozės požymių, kurių raiškos dažnis buvo atitinkamai 2 ± 1 ir 10 ± 5 %. Tokie rezultatai patvirtina ankstesniais tyrimais nustatytus dėsningumus: rauplėgrybiui jautrioms veislėms būdingi chlorozės, nekrozės ir rauplėgrybio sporuliacijos požymiai atsiranda po 3 5 savaičių (Yepes, Aldvinckle, 1993 a, 1993 b; Raman, Goodwin, 2001). Nors Golden delicious veislei būdingas atsparumo 13

14 rauplėgrybiui genas Vg, tačiau jis neužtikrina visiško atsparumo lauko sąlygomis, todėl ši veislė laikoma gan jautria rauplėms (Parisi, Trillot, 1993; Benaouf, Parisi, 2000). Atsparumo rauplėgrybiui požymių nepastebėta ir tiriant in vitro sąlygomis. Po 14 parų inkubacijos šiam genotipui buvo būdingas kiek didesnis chlorozės požymių dažnis nei Gala veislei, jis buvo labai panašus kaip ir Vm geno sąlygotu atsparumu išsiskiriančių veislių: Orlovim ir Čistotel (atitinkamai 10 ± 5, 11 ± 8 ir 13 ± 5 %). Užkrėtus L-4 izoliatu tirtų obelų genotipų mikroūglių lapus, po 14 parų inkubacijos iš esmės didesnis buvo Pamiat Isajeva veislės mikroūglių lapų nekrozės požymių pasireiškimo dažnis (53 ± 15 %), o kitų Vm geno sąlygotu atsparumu išsiskiriančių genotipų lapų nekrozės požymių pasireiškimo dažnis kito apytiksliai nuo 23 iki 29 % (4 pav.). Galbūt tokios genotipo savybės priklauso nuo obels genotipų kilmės. Pamiat Isajeva veislei būdingas kitoks M. atrosanguinea 804 ir Paprastojo antaninio atsparumo rauplėgrybiui genų derinys nei kitoms tos pačios kilmės veislėms: Orlovim ir Čistotel, ar hibridui Nr. SR0523, kuris yra pirmos kartos M. atrosanguinea 804 palikuonis. Ankstesniais tyrimais nustatyta, kad Vf atsparumo paveldėjimo atveju palikuonims būdingas dalinis atsparumo rauplėgrybiui genų paveldėjimas kai kuriems M. floribunda 821 palikuonims būdingi du atsparumo genai: Vf ir Vfh, o tolesnėse kartose paveldimas tik Vf genas (Benaouf, Parisi, 2000). Kaip minėta, nors Čistotel, Pamiat Isajeva ir Orlovim veislės yra tos pačios kilmės, joms būdingi skirtingi atsparumo penktai rauplėgrybio rasei požymiai. Skirtingą tirtų obels veislių audinių reakcijos į rauplėgrybio infekciją genetinę prigimtį patvirtino ir būdingi lapų paraudimo raiškos dėsningumai. Pamiat Isajeva veislės keturių savaičių amžiaus kultūros mikroūglių lapai neparaudo, o septynių savaičių mikroūglių kultūros lapų paraudimo požymių dažnis buvo tik 5 ± 2 %. Orlovim, Čistotel veislių ir hibrido Nr. SR0523 septynių savaičių kultūros mikroūglių lapų paraudo apytiksiai nuo ketvirtadalio iki pusės tirto kiekio. Nors statistinė duomenų analizė parodė, kad esminio skirtumo tarp skirtingo amžiaus mikroūglių kultūros nekrozės požymių pasireiškimo dažnio nenustatyta, tačiau, tyrimo duomenimis, ontogenetinis lapų amžius turėjo įtakos nekrozės požymių raiškai. Keturių savaičių amžiaus kultūros mikroūglių pirmo trečio lapo nuo ūglio viršūnės grupei buvo būdingas apytiksliai keturis kartus didesnis nekrozės požymių raiškos dažnis nei ketvirto šešto lapo grupei (atitinkamai 51 ± 21 ir 13 ± 12 %). Apibendrinant galima teigti, kad Vm geno sąlygotu atsparumu išsiskiriantiems genotipams, auginamiems in vitro sąlygomis, pasireiškia tokie patys superjautrumo atsako požymiai, kaip ir auginamiems lauko sąlygomis. Priklausomai nuo genotipo, nekrozės požymių aptikta apytiksliai ant % tirtų lapų. Taip pat galima teigti, kad, norint užtikrinti didesnį superjautrumo atsako efektyvumą atliekant obels ir rauplėgrybio sąveikos tyrimus, reikėtų naudoti jaunesnio ontogenetinio amžiaus lapus, nes nekrozės atsako pasireiškimo ant jų dažnis yra keletą kartų didesnis nei ant senesnių lapų. Išvados. 1. Nustatyta, kad in vitro sąlygomis obels genotipų, išsiskiriančiu Vm geno sąlygotu atsparumu, paveldėtu iš M. atrosanguinea 804 ( Orlovim, Čistotel, Pamiat Isajeva veislės ir hibridas Nr. SR0523), mikroūglių lapų audiniams būdinga nesuderinama sąveika su V. inaequalis. 2. Rauplėgrybio indukuojamų nekrozės požymių pasireiškimo in vitro sąlygomis 14

15 dažnis po 14 parų inkubacijos priklauso nuo genotipo genetinės prigimties. Didžiausias nekrozės požymių pasireiškimo dažnis būdingas Pamiat Isajeva veislei 53 ± 15 %. Tiriant kitus Vm geno sąlygotu atsparumu išsiskiriančius genotipus, nekrozės požymių raiškos dažnis kito apytiksliai nuo 23 iki 29 %. Rauplėgrybiui jautrūs genotipai neturėjo nekrozės požymių. 3. Lapų paraudimas yra Vm geno sąlygotu atsparumu išsiskiriantiems genotipams būdinga reakcija į rauplėgrybio infekciją in vitro sąlygomis. Šių požymių raiškos dažnis priklauso nuo obels genotipo ir yra atvirkščiai proporcingas nekrozės požymių raiškos dažniui: mažiausia paraudimo raiška nustatyta ant Pamiat Isajeva veislės mikroūglių lapų. 4. Rauplėgrybio indukuojamų nekrozės požymių raiškos dažnis priklauso nuo ontogenetinio mikroūglių lapų amžiaus: pirmo trečio lapo nuo ūglio viršūnės grupėje nekrozės požymiai pasireiškė apytiksliai ant pusės lapų (51 ± 21 %), ketvirto šešto lapo grupėje tik 13 ± 12 %. Padėka. Tyrimas finansuotas Europos socialinio fondo lėšomis pagal visuotinės dotacijos priemonę, projektas Nr. VP1-3.1-ŠMM-07-K Gauta Parengta spausdinti Literatūra 1. Baniulis D., Gelvonauskienė D., Rugienius R., Sasnauskas A., Stanienė G., Stepulaitienė I., Frercks B., Sikorskaitė S., Lukoševičiūtė V., Mažeikienė I., Šikšnianienė J. B, Morkūnaitė-Haimi Š., Haimi P., Bendokas V., Gelvonauskis B., Šikšnianas T., Stanys V Orchard plant breeding, genetics, and biotechnology research at the Institute of Horticulture, LRCAF. Sodininkystė ir daržininkystė, 32(3 4): Benaouf G., Parisi L Characterization of Venturia inaequalis pathogenicity on leaf discs of apple trees. European Journal of Plant Pathology, 104: Benaouf G., Parisi L Genetics of host pathogen relationships between Venturia inaequalis races 6 and 7 and Malus species. Phytopathology, 90: Chevalier M., Lespinasse Y Histological and cytological studies of the interaction between apple selections carrying the resistance Vm and compatible and incompatible Venturia inaequalis strains. In: H. Schmidt, M. Kellerhals (eds.), Progress in Temperate Fruit Breeding. Kluwer Academic Publishers, Netherlands, Chevalier M., Parisi L A microscopic study of the different classes of symptoms coded by the Vf gene in apple for resistance to scab (Venturia inaequalis). Plant Pathology, 40:

16 6. Dayton D. F., Williams E. B Additional allelic genes in Malus for scab resistance of two reaction types. Journal of American Society for Horticultural Science, 95: Gelvonauskienė D., Stanys V Rauplėms atsparių obelų sėjinukų atrankos metodų palyginimas. Žemės ūkio mokslai, 4: Gelvonauskienė D., Stanys V Screening of scab resistant apple seedlings using isolated cotyledons. Fruit Science, 207: Gessler C., Patocchi A., Sansavini S., Tartarini S., Gianfranceschi L Venturia inaequalis resistance in apple. Critical Reviews in Plant Sciences, 25(6): Guillaumès J., Chevalier M., Parisi L Studies on the relationship between Venturia inaequalis and Malus domestica in vitro plants. Can. J. Plant Pathol., 17: Holzapfel C., Meisel B., Thummler F., Leser C., Treutter D Differential gene expression in leaves of a scab susceptible and a resistant apple cultivar upon Venturia inaequalis inoculation. Trees, 26: Ivanicka J., Kellerhals M., Theiler R. (1996). Evaluation of scab (Venturia inaequalis (Cooke) G. Wint.) on shoots and detached leaves from in vitro and greenhouse grown plants of apple (Malus domestica Mill.) cultivars Golden Delicious and Florina. Gartenbauwissenschaft, 5: Yepes L. M., Aldwinckle H. S b. Patogenesis of Venturia inaequalis on shoot-tip cultures and on greenhouse-grown apple cultivars. Phytopathology, 83(11): Yepes L. M., Aldwinckle H. S.1993 a. Selection of resistance to Venturia inaequalis using detached leaves from in vitro-grown apple shoots. Plant Sci., 93: Jones J. D. G., Dangl J. L The plant immune system. Nature, 444: Lespinasse Y Apple scab resistance and durability. New races and strategies for the future. In: H. Schmidt, M. Kellerhals (eds.), Progress in Temperate Fruit Breeding. The Kluwer Academic Publishers, Netherlands, Liebhard R., Koller B., Patocchi A., Kellerhals M., Pfammatter W., Jermini M., Gessler C Mapping quantitative field resistance against apple scab in a Fiesta Discovery progeny. Phytopathology, 93(4): MacHardy W. E Apple scab biology, epidemiology and management. APS Press, St. Paul, MN, USA. 19. Murashige T., Skoog F A revised medium for rapid growth and bioassays with tabacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15: Nicholson R. L., Van Scoyoc S., Williams E. B, Kuć J Etiolated apples hypocotyls: a useful host tissue in apple scab research. Phytopathology, 63: Nicholson R. L., Van Scoyoc S., Williams E. B, Kuć J Host-pathogen interactions preceding the hypersensitive reaction of Malus sp. to Venturia inaequalis. Phytopathology, 67:

17 22. Parisi L., Trillot M Varietes de pommier: Resistance et sensibilite a la tavelure, a l loidium et aux maladies de conservation. INFOS-CTIFL, 89: Percival G. C., Boyle S Evaluation of film forming polymers to control apple scab (Venturia inaequalis (Cooke) G. Wint.) under laboratory and field conditions. Crop Protection, 28: Percival G. C Effect of Systemic Inducing resistance and biostimulant materials and apple scab using a detachted leaf bioassay. Arboriculture & Urban Forestry, 36(1): Raman H., Goodwin P. B In vitro screening of apple germplasm for resistance against black spot Caused by Venturia inaequalis. Journal of New Seeds, 2(2): Ryabtsev A. S Genotype SR0523 in the breeding of scab-resistant apple. Vestsi Akademii Agrarnykh Navuk Respubliki Belarus, 2: Sansavini S., Donati F., Costa F., Tartarini S Advances in apple breeding for enhanced fruit quality and resistance to biotic stresses: New varieties for the European market. Journal of Fruit and Ornamental Plant Research, 12: Schenato P. G., Valdebenito-Sanhueza R. M., Duarte V Determinacao da presenca da raca 1 de Venturia inaequalis no sul do brasil. Tropical Plant Pathology, 33(4): Sedov E. N., Zdanov G. A., Sedova V. V., Sedyseva G. A., Trunova Z. M., Krasova N. G Selekciya Yabloni (Apple Breeding). Agropromizdat, Moscow. 30. Tarakanovas P., Raudonius S Agronominių tyrimų duomenų statistinė analizė taikant kompiuterines programas ANOVA, STAT, SPILT-PLOT iš paketo SELEKCIJA ir IRRISTAT. Akademija. 31. Williams E. B., Brown A. G A new physiologic race of Venturia inaequalis, incitant of apple scab. Plant Disease Reports, 52: Williams E. B., Kuć J Resistance in Malus to Venturia inaequalis. Annual Review of Phytopathology, 7: Win J., Greenwood D. R., Plummer K. M Characterisation of protein from Venturia inaequalis that induces necrosis in Malus carrying the Vm resistance gene. Physiological and Molecular Plant Pathology, 62:

18 SODININKYSTĖ IR DARŽININKYSTĖ. SCIENTIFIC ARTICLES (1 2). Assessment of traits of Vm resistance to apple scab (Venturia inaequalis (Cooke) Wint.) characteristic to domestic apple (Malus domestica Borkh.) under in vitro conditions D. Gelvonauskienė, G. Stanienė, S. Sikorskaitė-Gudžiūnienė, I. Stepulaitienė, P. Haimi, A. Sasnauskas, V. Stanys, D. Baniulis Summary Apple scab (V. inaequalis) is one of the most damaging diseases of domestic apple (M. domestica). Quantitative and qualitative traits of resistance to apple scab are characteristic to apple. A hypersensitive response is induced at a site of infection of the genotypes with Vm resistance and scab infection is terminated. To study apple and scab interaction, different in vitro systems are used around the world: detached leaves, leave disks, in vitro micro-shoots and tissues. Previous studies using detached leave tests demonstrated that efficiency of the induced hypersensitive response was influenced by the environmental conditions and the physiological state of plants. Therefore, it would be useful to employ the tissues grown and infected under controlled in vitro conditions, however, the application of such approach to the genotypes with Vm resistance has not been assessed so far. Our study was aimed to characterize the morphological traits of scab resistance of Vm resistant pedigree of Malus atrosanguinea 804 including cultivars Orlovim, Čistotel, Pamiat Isajeva and hybrid No. SR0523 under in vitro conditions. Cultivars Gala and Golden delicious were used as scab susceptible control. The study revealed that the genotypes with Vm resistance demonstrated characteristic incompatible reaction to V. inaequalis and the expression of necrotic symptoms constituted approximately 23 to 53 % depending on a genotype. An occurrence of the necrotic symptoms on ontogenetically younger leaves (leaves 1 3 from the shoot top) was approximately four fold higher as compared to older leaves (leaves 4 6). It was observed that leaf reddening was a symptom characteristic to Vm resistant genotypes in response to scab infection, and the occurrence of these symptoms was inversely proportional to the expression of necrotic symptoms. Key words: apple scab, chlorosis, conidia suspension, hypersensitive response, morphological traits, necrosis, Vm gene. 18

19 LIETUVOS AGRARINIŲ IR MIŠKŲ MOKSLŲ CENTRO FILIALO SODININKYSTĖS IR DARŽININKYSTĖS INSTITUTO IR ALEKSANDRO STULGINSKIO UNIVERSITETO MOKSLO DARBAI. SODININKYSTĖ IR DARŽININKYSTĖ (1 2). Latentinio obelų stiebų duobėtumo viruso genetinė įvairovė Lietuvoje Ingrida Mažeikienė, Jūrate Bronė Šikšnianienė Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialas Sodininkystės ir daržininkystės institutas, Kauno g. 30, LT Babtai, Kauno r., el. paštas Obelų stiebų duobėtumo viruso (ASPV) baltyminio apvalkalo (CP) genomui būdingi fragmentai nustatyti aštuoniose įvairaus amžiaus obelyse ( metų), augančiose skirtingose Lietuvos geografinėse vietose. Šis ligos sukėlėjas dažnas Lietuvoje: visos ištirtos obelys iš nesertifikuotų ir senų Lietuvos sodų buvo užsikrėtusios ASPV. Lietuvoje rastų virusų izoliatų nukleotidų sekose buvo 70,49 % identiškų nukleotidų. Nustatytas didelis šio viruso genetinis polimorfizmas mūsų šalyje, ASPV CP sekos homologija 370 nukleotidų ir 99 aminorūgščių atžvilgiu yra atitinkamai 83,1 92,6 ir 94,9 100 %. Tarp devynių identifikuotų ASPV virusų nebuvo rasta dviejų genetiškai identiškų. Filogenetinėje dendrogramoje 31 NCBI duomenų bazėje registruotas ASPV izoliatas pasiskirstė į tris patikimai atsiskyrusias grupes. Lietuvoje augančiose obelyse mes aptikome visų trijų grupių ASPV viruso atmainų. S. Stanevičiaus sodyboje-muziejuje augančiose obelyse rasti ASPV viruso izoliatai turėjo unikalius aminorūgščių pakitimus konservatyvioje viruso genomo dalyje. Ištirtos ir įvertintos Lietuvoje augančiose obelyse paplitusių virusų genomo mutacijos leis tiksliau diagnozuoti ir identifikuoti ASPV. Genų duomenų bazėse pateikti sekų duomenys leis keistis informacija su kitais mokslininkais analizuojant viruso kilmę, pakitimus ir paplitimą. Reikšminiai žodžiai: ASPV, genetinis polimorfizmas, obelis. Įvadas. Obelys Lietuvoje nuo seno yra viena pagrindinių vaisinių kultūrų. Mūsų šalyje galima rasti ilgaamžių 100 metų ir senesnių augalų. Mūsų regionas turi senas sodininkystės tradicijas, o sodinamoji medžiaga į Lietuvos sodus plito tiek iš rytų, tiek iš vakarų. Kartu su augalais keliavo ir latentiniai sėklavaisių virusai, nes virusų kontrolė Europoje pradėta reglamentuoti tik nuo 1981 metų. Su augalu šeimininku atkeliavę latentiniai virusai gali koegzistuoti obelyse visą jų amžių. Obels stiebų duobėtumo virusas (angl. Apple Stem Pitting Virus) yra vienas didžiausių ligų sukėlėjų, dideliu mastu užkrečiantis vaismedžius visame pasaulyje (Šutič ir kt., 1999). ASPV yra Foveavirus genties Flexiviridae šeimos virusas (Martelli, Jelkmann, 1998; Adams ir kt., 2004), pirmą kartą literatūroje aprašytas Smith (1954), atlikus Malus sylvestris virusologinius tyrimus. Pasaulyje pateikiami skir- 19

20 tingi duomenys apie ASPV paplitimą įvairiose šalyse. Graikijoje nustatyta 96 % šiuo virusu užkrėstų obelų (Syrgianidis, 1988), Latvijoje 70 % (Pūpola ir kt., 2011), o Čekijos ir Moravijos regione 28 % (Kundu, 2003). Nustatytas infekcijos lygis priklausė nuo tiriamo sodo pobūdžio ir tyrimo metodo jautrumo. Infekcijos mastai didesni senuose obelų soduose, įveistuose iki 1960 m., kai pasaulyje dar nebuvo taikomi virusologiniai tyrimai, o sodams įveisti naudojama nesertifikuota sodinamoji medžiaga (van den Berg, 2003). ASPV plinta tarp vaismedžių per užkrėstą sodinamąją medžiagą, šaknų kontaktą, inokuliaciją (Yanase ir kt., 1989). Biologiniai šio viruso vektoriai yra nežinomi (Šutič ir kt., 1999). Šio viruso pobūdis yra latentinis ir akivaizdžių simptomų ant augalo dažnai nematyti, tačiau Malus spp., Pyrus spp., Cydonia oblonga, Pyronia veitchii, Crataegus monogyna, Sorbus discolor genotipų reakcija į šią virusinę infekciją yra sumažėjęs augimas ir derliaus nuostoliai (Kundu, Yoshikawa, 2006; Martelli, Jelkmann, 1998; Stouffer, 1989; Yanase ir kt., 1990; Cembali ir kt., 2003). Kuriant ir taikant molekulinius detekcijos metodus, svarbu stebėti virusų genetinį kintamumą. ASPV izoliatų genetinis kintamumas nustatytas visuose penkiuose genuose tiek viruso replikacinėje (Rodoni, Constable, 2008), tiek baltyminio apvalkalo (CP) (Klerks ir kt., 2001), tiek nekoduojančioje 3 genomo dalyje (Kundu, 2008; Schwarz ir Jelkmann, 1998). Apvalkalo baltymą koduojanti seka yra konservatyviausia šio viruso dalis, todėl dažniausiai naudojama infekcijai nustatyti molekuliniais ar imunofermentiniais metodais. Didesnės nukleotidų ar aminorūgščių mutacijos šioje viruso RNR dalyje sumažina detekcijos metodų veiksmingumą arba jie visiškai nustoja veikti. Be to, viruso genomo tyrimai leidžia analizuoti populiacijos struktūras, atlikti filogenetinus bei augalų šeimininkų demografinės istorijos tyrimus. ASPV paplitimas Lietuvoje ir genetinė charakteristika iki šiol nebuvo tyrinėti. Lietuvoje aptinkamų ASPV virusų identifikavimas, genotipų nustatymas bei polimorfizmo tyrimai padėtų nustatyti virusų kilmę ir mutacijas ir leistų stebėti jų migraciją pasaulio mastu. Tyrimo objektas ir metodai. Ty r i m o o b j e k t a s i r v i e t a. Tyrimai atlikti Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialo Sodininkystės ir daržininkystės instituto (LAAMC SDI) bazėje ir SDI Sodo augalų genetikos ir biotechnologijos laboratorijoje 2013 metais. ASPV virusas testuotas skirtingo amžiaus ( metų) obelyse įvairiose Lietuvos vietose (1 lentelė). ASPV diagnostikai atlikti ėminiai buvo imti 2013 metų vasarą. Iki analizės jie buvo laikomi 70 C temperatūroje, siekiant išvengti RNR degradacijos. Viruso paieškai naudotas PGR (polimerazės grandininės reakcijos) metodas. R N R i š s k y r i m a s i r k D N R s i n t e z ė. RNR iš augalų lapų išskirta naudojant NucleoSpin RNA Plant (Macherey Nagel) rinkinį pagal gamintojo pridėtą protokolą. Išskirta RNR naudota komplementariai DNR (kdnr) sintetinti. kdnr sintezė atlikta naudojant RevertAid First Strand cdna Synthesis Kit rinkinį ( Fermentas ) pagal gamintojo protokolą. 20

21 1 lentelė. Obelų, atrinktų ASPV infekcijai nustatyti, charakteristikos Table 1. Characteristics of apple trees, sampled for detection of ASPV Ėminio numeris Number of sample NCBI duomenų bazėje priskirtas numeris Accesion number in NCBI KJ Babtai, Kauno r. Obels augimvietė Growth place of apple tree Genetinių išteklių sodas Orchard of genetic resources KJ Kanopėnų k., Simono Stanevičiaus (1)KJ (2)KJ Raseinių r. sodyba-muziejus Farmhouse-museum of Simonas Stanevičius KJ Prūčių k., Privati sodyba Ignalinos r. Private homestead KJ Panemunėlis, Privati sodyba Rokiškio r. Private homestead KJ Aukštadvaris, Privati sodyba Kėdainių r. Private homestead KJ Vėžaičiai, Privati sodyba Klaipėdos r. Private homestead KJ Motiejūnų k., Privati sodyba Širvintų r. Private homestead 079* be viruso virus free Babtai, Kauno r. Pradinė dauginamoji medžiaga. Augalo Nr Initial planting material. Plant no Augalo amžius (apytikris) metais Age of plant (approximate), years * Neigiama kontrolė / Negative control. 1 Veislė / cultivar Paprastasis antaninis ; 2 veislė / cultivar Tabokinė ; 3 nežinoma veislė / unknown cultivar P G R m e t o d a s. Virusų paieškai naudota ASPV CP baltymui specifiškų oligonukleotidinių pradmenų pora: 5 ATGTCTGGAACCTCATGCTGCAA3 ir 5 TTGGGATCAACTTTACTAAAAAGCATAA3. Vidinei kontrolei naudota pastovios raiškos NADH dehidrogenazės subvieneto5 (nad5) genui specifiškų oligonukleotidinių pradmenų pora: 5 GATGCTTCTTGGGGCTTCTTGTT3 ir 5 CTCCAGTCACCAACATTGGCATAA3. kdnr amplifikavimo reakcija (PGR) vyko 20 μl mišinyje, sudarytame iš 2,5 μl 10 DreamTaq DNR polimerazės buferio, 2 μl 25 mm MgCl 2, 0,4 μl 10 mm dntp mišinio, 2 20 pmol pradmenų, 1U DreamTaq DNR polimerazės ir po 500 ng kdnr. Ėminiai amplifikuoti termocikleryje ( Eppendorf ) tokiu režimu: pirminis dvigrandės kdnr lydymas 95 C temperatūroje 5 min., 35 ciklai fragmentui gausinti dvigrandės kdnr išlydymas 94 C temperatūroje 30 sek., pradmenų 21

22 hibridizacija 58,4 C temperatūroje 40 sek., fragmentų sintezė 72 C temperatūroje 40 sek., galutinė sintezė 72 C temperatūroje 5 minutes. Elektroforezė atlikta 1,5 proc. agarozės gelyje. F r a g m e n t o v a l y m a s, k l o n a v i m a s, s e k o s k a i t a. Amplifikuoti apie 370 bp DNR fragmentai frakcionuoti 1 proc. agarozės gelyje. Fragmentai iš gelio iškirpti ir išgryninti naudojant Cyclo-Pure Gel Extraction Kit (Amresco, JAV) rinkinį pagal gamintojo pridėtą protokolą. Fragmentai įterpti į pjet 1.2 klonavimo vektorius naudojant Thermo Scientific CloneJET PCR Cloning Kit rinkinį pagal standartinį protokolą. Vektorius į E. coli bakterijų kloną J107 įkeltas CaCl 2 metodu taikant terminį šoką. Nuo bakterinės DNR atskirta plazmidinė DNR su ASPV kdnr intarpu paruošta sekvenavimui naudojant Big Dye Terminator 3.1 rinkinį (Applied Biosystem). D u o m e n ų į v e r t i n i m a s. PGR duomenys dokumentuoti ir įvertinti Herolab UV kameroje naudojant E. A. S. Y Win 32 dokumentavimo programą. kdnr fragmentai sekvenuoti genų analizatoriumi LAMMC SDI Sodo augalų genetikos ir biotechnologijos skyriuje. Nuskaitytų nukleotidų sekos įtrauktos į NCBI duomenų bazę. Nukleotidų sekos verstos į aminorūgščių sekas ExPASy vertimo programa. Naujai nuskaitytų nukleotidinės ASPV izoliatų sekos palygintos ALIGN 2.1u programa pagal kdnr matricą (Huang, Miller, 1991). ASPV CP filogenetinė dendrograma iš 30 ASPV CP izoliatų konstruota naudojant PhyML programą (v3.0 alrt). Filogenetinio medžio vaizdas grafiškai pateiktas naudojant TreeDyn (v198.3) programą (Castresana, 2000; Guindon ir Gascuel, 2003; Edgar, 2004; Anisimova ir Gascuel, 2006; Chevenet ir kt., 2006). Trisdešimt viena homologinė ASPV CP aminorūgščių seka tarpusavyje palyginta naudojant Clustal W ir Genamics Expression programas (Thompson ir kt. 1994). Rezultatai. Atlikus kdnr pagausinimą, ASPV virusui specifiškas 370 bp fragmentas buvo rastas visuose aštuoniuose bandiniuose (1 pav.). 1 pav. Agarozės gelyje išryškinti 370 bp fragmentai, specifiški ASPV CP geno sekai. 181 bp fragmentas vidinė kontrolė, pastovios raiškos nad5 mitochondrinis genas. Augalo šeimininko numeriai, augavietė ir amžius pateikti 1 lentelėje. Fig. 1. Specific for ASPV CP gene sequence 370 bp fragments distinct in agarose gel. Internal control is fragment of 181 bp, from constant expression nad5 mitochondrian gene. Sample number, growth place and age of host plants presented in Table 1. Visos tirtos įvairaus amžiaus obelys iš nesertifikuotų ir senų Lietuvos sodų buvo užsikrėtusios ASPV virusu. Neigiamos kontrolės (NK) ėminyje, paimtame iš pradinės 22

23 sodo augalų dauginamosios medžiagos šiltnamyje augančios obels, ASPV virusui specifiško fragmento nerasta. Teigiama kontrolė (TK) plazmidinė DNR, kur vektoriaus konstruktas turi ASPV CP geno intarpą. Panaudojant pastovios raiškos nad5 mitochondrinį geną, kurio 181 bp fragmentas išryškėjo visuose tirtuose bandiniuose, gauta teigiama vidinė kdnr ir PGR reakcijų kontrolė. Tolesniam ASPV viruso genetinės įvairovės tyrimui atlikti CP geno fragmentai buvo iškirpti, išgryninti ir klonuoti į pjet1.2 plazmides. Atliekant sekoskaitą buvo nustatyta, kad S. Stanevičiaus sodybos-muziejaus sode auganti obelis Nr. 113 buvo užsikrėtusi dviem skirtingais ASPV izoliatais. Nukleotidų sekos nuskaitytos trimis pakartojimais, nukleotidų pasikeitimų pakartojimuose nerasta. Nuskaityti devyni ASPV CP geno sekų fragmentai pateikti NCBI (National Central Base Information) duomenų bazėje, kur jiems priskirti identifikaciniai numeriai: KJ670697, KJ670698, KJ670699, KJ670700, KJ670701, KJ670702, KJ670703, KJ ir KJ Lietuvoje identifikuotų ASPV CP viruso nukleotidų sekų palyginimas pateiktas 2 paveiksle. 2 pav. Lietuvoje identifikuotų ASPV izoliatų CP geno fragmento lyginamoji analizė. Rėmelyje parodytas baltymo sintezę stabdantis nukleotidų tripletas (Stop kodonas). * identiški nukleotidai. Fig. 2. Comparative analysis of partial CP gene from ASPV isolates identified in Lithuania. Nucleotide triplet (Stop codon) preventing protein synthesis placed on frame. * identical nucleotides. PGR metodu su specifiniais ASPV oligonukleotidiniais pradmenimis amplifikuoti ir sekvenuoti fragmentai buvo vienodo ilgio 366 nukleotidai Pirmi 23 nukleotidai, kurie yra 5 sekos oligonukleotidinis pradmuo, kaip specifinė ASPV baltyminio apvalkalo konservatyvi seka, iki galo nesutapo tik ASPV_113(2) viruso izoliate. ASPV_113(2) 23

24 sekoje yra bazių pakaitos genų mutacija (tranzicija), 13 nukleotidas pirimidinas (T) pasikeitęs į pirimidiną C. Galima teigti, kad literatūroje pateikta pradmens seka, kaip specifiška ASPV virusui (Menzel ir kt., 2002; Pūpala ir kt., 2011), nėra visiškai specifiška visoms viruso atmainoms Lietuvoje. Paskutiniai 28 nukleotidai nuskaitytoje virusų genomo sekų pabaigoje yra visiškai tapatūs 3 sekos galo pradmens nukleotidų sekai visuose Lietuvoje rastuose izoliatuose. Palyginus Lietuvoje rastus virusų izoliatus tarpusavyje, nustatyti 258 (70,49 %) identiški nukleotidai (2 pav. pažymėti *). Septyniose sekose rastas baltymo sintezę stabdantis nukleotidų tripletas TAA, o iš 113 bandinio išskirtuose dviejuose viruso izoliatuose (ASPV_113(1) ir ASPV_113(2) terminacijos (Stop) kodonas TGA. Ties 301 nukleotidu baigiasi konservatyvi Potex ir Carla virusų apvalkalo baltymo seka. Nuo šitos vietos sekos tampa kintamesnės. 2 lentelė. ASPV virusų, identifikuotų Lietuvoje augančiose obelyse, CP geno tarpusavio sekų tapatumas nukleotidų ir aminorūgščių lygmeniu, % Table 2. Comparison of CP gene sequences identified in Lithuanian apple trees at nucleotide and amino acid level among ASPV isolates (%) n. r./ n. a. a. r. / a. a. ASPV CP, izoliuotų Lietuvoje, ėminių numeriai Sample numbers of ASPV CP Lithuanian isolates (1) 113(2) ,9 a 87,4 a 85,2 a 86,6 a 85,8 a 90,7 a 87,7 a 89,3 a b - 92,3 a 85,5 a 86,6 a 85,2 a 89,9 a 90,2 a 92,6 a b 100 b - 84,7 a 86,1 a 85,2 a 88,8 a 92,3 a 90,7 a b 99 b 99 b - 85,2 a 85,0 a 85,5 a 85,0 a 84,7 a 113(1) 97 b 97 b 97 b 96 b - 87,7 a 88,3 a 85,8 a 85,8 a 113(2) 98 b 98 b 98 b 97 b 94,9 b - 84,7 a 83,1 a 84,7 a b 100 b 100 b 99 b 97 b 98 b - 89,1 a 88,8 a b 100 b 100 b 99 b 97 b 98 b 100 b - 90,2 a b 100 b 100 b 99 b 97 b 98 b 100 b 100 b - CP geno ir nekoduojančios dalies (366 nukleotidai) tapatumas, % / nucleotide identity (%) a of CP gene and noncoded regions (366 nt). CP geno (99 aminorūgštys) tapatumas (%) / identity of CP gene (99 amino acid) (%). b Sekvenuotos ASPV sekos, naudojant ExPASy programą buvo paverstos į aminorūgštis. Nuo 5 galo naudojant trečią rėmelį nuskaitytos aminorūgščių sekos buvo homologiškos ASPV CP sekoms, esančioms NCBI duomenų bazėje. ASPV CP ir nekoduojančios dalies 366 nukleotidų identiškumas (procentais) tarp Lietuvoje identifikuotų izoliatų pateiktas 2 lentelėje. Tarp devynių identifikuotų ASPV virusų neradome dviejų genetiškai identiškų. Vertinant nukleotidų lygmeniu, tapatumas tarp Lietuvoje rastų viruso izoliatų įvairavo nuo 83,1 iki 92,6 %. Koduojamoje CP geno dalyje, lyginant 99 aminorūgštis, rastų ASPV virusų identiškumas buvo nuo 94,9 iki 100 % (2 lentelė). Nepaisant ASPV izoliatų genomo kintamumo nukleotidų lygmenyje, aminnorūgščių atžvilgiu 6 izoliatai, rasti Paprastojo antaninio veislės obelų lapų ėminiuose: 008, 109, 110, 117, 124 ir 125 (augimvietė ir augalo amžius nurodyti 1 lentelėje), buvo identiški. S. Stanevičiaus 24

25 sodyboje-muziejuje (Kanopėnų k., Raseinių r.) rastos unikalios Lietuvoje ASPV viruso atmainos: ASPV_111, ASPV_113(1) ir 113(2). Didžiausi aminorūgščių skirtumai (identiškumas 94,9 %) nustatyti tarp ASPV virusų izoliatų: 113(1) ir 113(2), rastų toje pačioje obelyje. Remiantis trisdešimt vienos ASPV nukleorūgščių sekos, koduojančios viruso apvalkalo baltymo dalį (9 nustatytos Lietuvoje, 22 paimtos iš NCBI duomenų bazės), duomenimis sukonstruotas filogenetinis medis parodytas 3 paveiksle. 3 pav. Filogenetinis medis, sukonstruotas remiantis ASPV homologiškomis nukleino rūgščių sekomis, koduojančiomis viruso apvalkalo baltymo dalį. Filogenetinis medis konstruotas naudojant TreeDyn v198.3 programą, remiantis didžiausios panašumo tarp trisdešimt vieno ASPV CP izoliato tikimybės metodu. Sekų ilgis bp. Skaičiai virš linijos rodo patikimumo procentinę vertę (esant 100 atsitiktinai sugeneruotų pakartojimų), 100 % rodo patikimai atsiskyrusias šakas. ASPV izoliatai pavadinti pagal prieigos numerį NCBI duomenų bazėje. Fig. 3. Phylogenetic tree constructed on the basis of ASPV homologous nucleic acid sequences coding for virus partial coat protein. Phylogenetic tree (performed with TreeDyn v198.3) was constructed using the maximum likelihood method at the nucleotide level of 31 isolates. Sequences length bp. The numbers above the lines represent a bootstrap value (based on 100 replicates); the bootstrap value 100 % indicates branches that separate at high confidence of data. ASPV isolates named by accession numbers in NCBI. 25

26 Skaičiai virš linijos rodo patikimumo procentinę vertę (esant 100 atsitiktinai sugeneruotų pakartojimų): 100 % rodo patikimai atsiskyrusias šakas, mažiau kaip 50 % reikšmės nenurodomos. Tai leidžia atmesti sekvenavimo reakcijos metu pasitaikančias klaidas. ASPV izoliatai susiskirstė į du didelius klasterius: A ir B, esant 98 proc. patikimumo ribai. A klasteris, esant 71 ir 68 proc. patikimumo ribai, persiskyrė dar į du pogrupius: A1 ir A2. Klasteriui A priskirti 23 viruso izoliatai iš įvairių pasaulio šalių (pogrupiui A1 ir A2 atitinkamai 14 ir 9 izoliatai). Lietuvoje rasti 6 ASPV viruso izoliatai, kurie buvo 100 % homologiški vertinant aminorūgščių lygmeniu, sujungti A1 pogrupyje. Visi šie ASPV izoliatai rasti Paprastojo antaninio veislės obelyse. S. Stanevičiaus sodyboje nežinomos veislės obelyje rasti izoliatai: ASPV _113(1) ir ASPV _113(2), buvo patikimai atskirti vienas nuo kito ir sujungti pogrupyje A2. Klasteryje B sujungti 8 ASPV izoliatai, tarp jų ASPV _111 izoliatas, rastas veislės Tabokinė obelyje S. Stanevičiaus sodyboje. # ASPV 22 izoliatai, turintys identišką aminorūgščių seką / ASPV 22 isolates with an identical amino acid sequence: 008_Lithuania, 109_Lithuania, 110_Lithuania, 117_Lithuania, 124_Lithuania, 125_Lithuania, ADI78890_China, HM125160_China, ADI78889_China, ADI78888_China, HM125154_China, FJ619186_China, ACD43643_China, ABY28337_ China, AAY21815_Czech Republic, CBY85732_India, CBX24844_India, CAR94870_ India, CAR82084_India, CBX25660_India, BAB15950_Japan, AEK07896_Latvia. 4 pav. ASPV aminorūgščių pakitimai homologinėse CP sekose. Rėmelyje esanti aminorūgščių seka yra būdinga Potex ir Carla virusų apvalkalo baltymo konservatyviai sekai (Flexi_CP cl02836 pagal NCBI duomenų bazę) Fig. 4. ASPV amino acid changes in homologous CP sequences. Amino acid sequence shown in frame is conservative to Potex and Carla viral coat proteins (Flexi_CP cl02836 by NCBI database) Lyginamoji sekų analizė parodė, kad ASPV viruso izoliatų sekose 85,86 % aminorūgščių yra identiškos (4 pav.). Tarp panašių aminorūgščių rasta 14 pakitimų. Esminiai pakitimai buvo nustatyti dviejuose ASPV viruso izoliatuose, identifikuotose Lietuvoje: 111_Lithua ir 113(2)_Lithua. Bendrai įvertinus CP genomo pakitimus tarp ASPV viruso izoliatų (4 pav.), nustatyta, kad 68,75 % izoliatų, įrašytų į NCBI duomenų bazę, turėjo 100 % identišką 99 aminorūgščių seką. Šie 22 identifikuoti izoliatai rasti ir aprašyti skirtingose šalyse: Kinijoje ADI78890_China, 26

27 HM125160_China, ADI78889_China, ADI78888_China, HM125154_China, FJ619186_China, ACD43643_China, ABY28337_China; Čekijoje AAY21815_Cz R; Indijoje CBY85732_India, CBX24844_India, CAR94870_India, CAR82084_India, CBX25660_India; Japonijoje BAB15950_Japan; Latvijoje AEK07896_Latvia. Tarp jų yra šeši iš devynių skirtingose Lietuvos vietose augančiose obelyse rasti viruso izoliatai: 008_Lithuania, 109_Lithuania, 110_Lithuania, 117_Lithuania, 124_Lithuania, 125_Lithuania. Palyginus ASPV izoliatus (4 pav.) matyti, kad 31,25 % izoliatų turėjo nuo 1 iki 3 aminorūgščių pakitimų analizuotoje viruso baltyminio apvalkalo geno dalyje. Penki izoliatai 111_Lithua, AAM09801_Poland, HM125155_China, HM125153_China ir HM125156_China turėjo po vieną aminorūgščių pakitimą. Lietuvoje rastas izoliatas 113(2)_Lithua turėjo du aminorūgščių pakitimus. Trys aminorūgščių pakitimai rastišiuose izoliatuose: 113(1)_Lithua, AAS78637_Brasil ir CCJ34849_Canada. S. Stanevičiaus sodyboje-muziejuje augančiose obelyse rasti trys ASPV viruso izoliatai (111_Lithua, 113(2)_Lithua ir 113(1)_Lithua), kurie turėjo unikalius aminorūgščių pakitimus konservatyvioje viruso genomo dalyje. Aptarimas. Obelų stiebų duobėtumo virusas yra dažnai pasireiškiantis ligų sukėlėjas Lietuvoje, ypač senose obelyse. Visos ištirtos obelys, augančios skirtingose Lietuvos regionuose (1 pav.), buvo užsikrėtusios ASPV virusu. Mathioudakis ir kt. (2010) duomenimis, Graikijoje šiuo virusu užkrėstų obelų rasta tris kartus daugiau nei kriaušių. Be to, ASPV infekcija obelyse net 96 proc. atvejų rasta kartu su obelų chlorotinės dėmėtligės viruso (ACLSV) infekcija. Atsižvelgiant į gautus duomenis Lietuvoje ir remiantis kitų šalių tyrėjų pastarųjų metų duomenimis (Mathioudakis ir kt., 2010; Pūpola ir kt., 2011; Gadiou ir kt., 2010), galima daryti prielaidą, kad virusinių infekcijų mastas Lietuvos sėklavaisių soduose yra didelis. Be to, tobulėjant detekcijos metodams, virusų diagnostika tampa vis tikslesnė. Pradėjus taikyti PGR metodą, virusais užsikrėtusių augalų skaičius gerokai išaugo. Pūpola ir kt. (2011) pateikia virusologinių tyrimų Latvijos soduose duomenis: ten kartu vertinti ELISA ir PGR detekcijos metodų duomenys. ELISA metodu nustatyta ASPV infekcija obelyse buvo tik 4,5 %, o PGR metodu net 75,4 %. Žinant, kad kelių latentinių virusų infekcija obelyse yra dažna (Pūpola ir kt., 2011, Mažeikienė ir kt., 2012), PGR metodas leidžia tiksliai atskirti vieną virusą nuo kito tame pačiame bandinyje. Darbe panaudota amplifikuotų fragmentų sekoskaita išplėtė tyrimo galimybes ir leido ne tik analizuoti viruso atmainų genetiką, bet ir parodė, kad galima užsikrėsti dviem tos pačios atmainos (A2 šaka dendrogramoje, 3 pav.) skirtingais ASPV virusais vienu metu. Pagal atsiskyrimą filogenetinėje dendrogramoje ir nustatytus aminorūgščių pakitimus (4 pav.) dviguba ASPV infekcija aptikta obelyje, augančioje S. Stanevičiaus sodyboje-muziejuje (kdnr lapų bandinys Nr. 113). Dėl latentinio pobūdžio ASPV virusas vizualiai nepastebimas ir su sodinamąja medžiaga galėjo būti perkeltas iš vieno augalo į kitą. Taip keliaudamas su augalu šeimininku, jis plito į naujas geografines teritorijas ir daug metų išliko nepastebėtas. Dėl šios priežasties seni vaismedžiai, kurių introdukcinė kilmė nežinoma, o virusologinė būklė nenustatyta, yra įdomus tyrimų objektas stebint virusų migraciją ir vertinant mutacijas. Įvairūs obelų sodinamosios medžiagos introdukcijos keliai į senus Lietuvos sodus ir dažna ASPV infekcija senose obelyse (1 pav.) patvirtino mūsų prielaidą, kad ASPV viruso genetinė įvairovė didelė. Iki šiol mūsų šalyje ji nebuvo tyrinėta. 27

28 ASPV viruso detekcijai naudoti specifiniai oligonukleotidiniai pradmenys (Menzel ir kt., 2002; Pūpola ir kt., 2011), apimantys CP geno 3 galo 370 bp fragmentą, kurį nuskaitę naudojome filogenetinei analizei atlikti. ASPV konservatyviausia genomo dalis yra 3 baltyminio apvalkalo (CP) geno gale. Ši geno dalis yra tinkamiausia filogenetinei analizei atlikti. Literatūros duomenimis, nukleotidų sekos identiškumas šioje genomo vietoje kinta nuo 81,1 iki 95,5 %, o aminorūgščių nuo 91,8 iki 99,1 % (Gadiou ir kt., 2010). Lietuvoje identifikuotų 9 ASPV CP sekų homologija 370 nukleotidų ir 99 aminorūgščių atžvilgiu buvo atitinkamai 83,1 92,6 ir 94,9 100 % (2 lentelė). Tai rodo didelį šio viruso genetinį polimorfizmą mūsų šalyje. Lyginamoji analizė parodė, kad ASPV viruso atmainų paplitimas obelyse nepriklauso nuo geografinės vietovės. Toje pačioje šalyje randama skirtingų atmainų viruso izoliatų (Gadiou ir kt., 2010). Lietuvoje rasti viruso izoliatai filogenetinėje dendrogramoje (3 pav.) išsiskirstė į skirtingas tris šakas. Tai rodo, kad Lietuvoje augančiose obelyse mes aptikome visas tris ASPV viruso atmainas. Dendrogramoje matyti, kad viruso genetinė įvairovė nepriklauso nuo geografinės augalų šeimininkų augimvietės. Genetiškai panašių ASPV viruso atmainų randama skirtingose šalyse, nors biologinių šio viruso vektorių, kurie turėtų įtakos greitam infekcijos plitimui, iki šiol nėra nustatyta (Šutic ir kt., 1999). Atlikę tirtų virusų aminorūgščių sekų identiškumo palyginimą su NSBI genų banke registruotomis sekomis iš viso pasaulio (4 pav.), galime daryti išvadą, kad ASPV virusas paplitęs obelų soduose visame pasaulyje ir prisitaikydamas prie naujų sąlygų mutuoja. Viruso RNR struktūra mutuoja daugiau nukleotidų lygmeniu (2 pav.), tačiau galimos ir reikšmingesnės genomo mutacijos aminorūgščių lygmeniu. Mutavusius virusus sunkiau identifikuoti, PGR metodu atliekamai detekcijai naudojami pradmenys gali nebesutapti su viruso genomu ir prarasti specifiškumą. Žinoma, kad kai kurios ASPV atmainos sukelia kriaušių gyslų pageltimo ir vaisių akmenėjimo požymius (Salmon ir kt., 2002) bei obelų vaisių pažeidimus (Battle ir kt., 2004). Atsiradusios naujos virusinių ligų sukėlėjų atmainos gali sukelti naujas, dar nenustatytas sodo augalų ligas bei fiziologinius sutrikimus. Išvados. Obelų stiebų duobėtumo virusas (ASPV) yra dažnas ligų sukėlėjas Lietuvoje nustatyta 100 % šiuo virusu užkrėstų metų amžiaus obelų. Nustatytas didelis šio viruso genetinis polimorfizmas mūsų šalyje, ASPV CP sekos homologija 370 nukleotidų ir 99 aminorūgščių atžvilgiu yra atitinkamai 83,1 92,6 ir 94,9 100 %. Ištirtos ir įvertintos paplitusių virusų genomo mutacijos Lietuvoje augančiose obelyse leis tiksliau diagnozuoti ir identifikuoti ASPV. Genų duomenų bazėse pateikti sekų duomenys leis keistis informacija su kitais mokslininkais analizuojant viruso kilmę, mutacijas ir paplitimą. Padėka. Autoriai dėkoja Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministerijai už finansinę paramą. Gauta Parengta spausdinti

29 Literatūra 1. Adams M. J., Antoniw J. F., Bar-Joseph M., Brunt A. A., Candresse T., Foster G. D., Martelli G. P., Milne R. G., Zavriev S. K., Fauquet C. M The new plant virus family Flexiviridae and assessment of molecular criteria for species demarcation. Archives of Virology, 149: Anisimova M., Gascuel O Approximate likelihood ratio test for branches: A fast, accurate and powerful alternative. Systematic Biology, 55: Batlle A., Laviña A., García-Chapa., M., Sabaté J., Folch C., Asin L Comparative results between different detection methods of virus and phytoplasmas for pear and apple certification program. Acta Horticulturae, 657: Castresana J Selection of conserved blocks from multiple alignments for their use in phylogenetic analysis. Molecular Biology and Evolution, 17: Cembali T., Folwell R. J., Wandschneider P., Eastwel K. C., Howell W. E Economic implications of a virus prevention program in deciduous tree fruits in the US. Crop Protection, 22: Chevenet F., Brun C., Banuls A.L., Jacq B., Chisten R TreeDyn: towards dynamic graphics and annotations for analyses of trees. BMC Bioinformatics, 7: Edgar R. C MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research, 32: Gadiou S., Kundu J. K., Paunovic S., Garcia-Diez P., Komorowska B., Gospodaryk A., Handa A., Massart S., Birisik N., Takur P. D., Polischuk V Genetic diversity of flexiviruses infecting pome fruit trees. Journal Plant Pathology, 92: Guindon S., Gascuel O A simple, fast, and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood. Systematic Biology, 52: Huang X., Miller W A Time-efficient, Linear-Space Local Similarity Algorithm. Advances in Applied Mathematics, 12: Yanase H., Koganezawa H., Fridlund P. R Correlation of pear necrotic spot with pear vein yellows and apple stem pitting and a flexuous filamentous virus associated with them. Acta Horticulturae, 235: Yanase H., Mink G. I., Sawamura K., Yamaguchi A Apple topworking disease. In: A. L. Jones, H. S. Aldwinckle (eds), Compendium of Apple and Pear Diseases. APS Press, St. Paul, MN, USA, Klerks M. M., Leone G., Lindner J. L., Schoen C. D., van den Heuvel J. F. J. M Rapid and sensitive detection of Apple Stem Pitting Virus in apple trees through RNA amplification and probing with fluorescent molecular beacons. Phytopathology, 91: Kundu J. K Detection, distribution and genetic diversities of Apple Stem Pitting Virus and Apple stem grooving virus in the Czech Republic. Acta Horticulturae, 781:

30 15. Kundu J. K., Yoshikawa N Apple Stem Pitting Virus. In: G. P. Rao, A. Myrta, K. S. Ling (eds), Molecular Characterization of Plant Viruses. Studium Press, Houston, TX, USA. 16. Kundu J. K The occurrence of Apple Stem Pitting Virus and Apple stem grooving virus within field-grown apple cultivars evaluated by RT PCR. Plant Protection Science, 39: Martelli G. P., Jelkmann W Foveavirus, a new plant virus genus. Archives of Virology, 143: Mathioudakis M. M., Maliogka V. I., Katsiani A. T., Katis N. I Incidence and molecular variability of Apple stem pitting and Apple chlorotic leaf spot viruses in apple and pear orchards in Greece. Journal Plant Pathology, 92: Mažeikiene I., Mozerytė D., Maliauskaitė D., Šiksnianienė J. B Virologic status of the apple trees at the Institute of Horticulture. Sodininkystė ir daržininkystė, 3: Menzel W., Jelkmann W., Maiss E Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mrna as internal control. Journal of Virological Methods, 99: Pūpola N., Moročko-Bičevska I., Kāle A., Zeltiaš A Occurrence and Diversity of Pome Fruit Viruses in Apple and Pear Orchards in Latvia. Journal Phytopathology, 159: Rodoni B. C., Constable F. E The incidence and strain variation of Apple stem grooving and Apple Stem Pitting Viruses in Australian pome fruit. Acta Horticulturae, 781: Salmon M. A., Vendrame M., Kummert J., Lepoivre P Rapid and homogenous detection of Apple Stem Pitting Virus by RT-PCR and fluorogenic 3 minor groove binder DNA probe. European Journal of Plant Pathology, 108: Schwarz K., Jelkmann W Detection and characterization of European Apple Stem Pitting Virus sources from apple and pear by PCR and partial sequence analysis. Acta Horticulturae, 472: Syrgianidis G. D Problems of virus diseases of delicious fruit trees in Greece. Acta Horticulturae, 235: Smith W. W Occurrence of stem pitting and necrosis in some body stocks of apple trees. Proceedings of the American Society for Horticultural Science, 63: Stouffer R. F Apple stem pitting. In: P. R. Fridlund (eds.), Virus and Virus-like Diseases of Pome Fruits and Simulating Non-infectious Disorders. Washington State University, Pullman, WA, USA, Šutič D. D., Ford R. E., Tošič M. T Virus Diseases of Fruit Trees. In: D. D. Šutič, R. E. Ford, M. T. Tošič (eds.), Handbook of Plant Virus Diseases. FL CRC Press, Boca Raton, FL, USA,

31 29. Thompson J. D., Higgins D. G., Gibson T. J CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22: van den Berg A Certificied Nursery Tree Production in Holland. The Compact Fruit Tree, 36: SODININKYSTĖ IR DARŽININKYSTĖ. SCIENTIFIC ARTICLES (1 2). Genetic diversity of latent Apple Stem Pitting Virus in Lithuania I. Mažeikienė, J. B. Šikšnianienė Summary The specific fragments of the Apple Stem Pitting Virus (ASPV) coat protein (CP) gene investigated in eight apple trees of various ages ( year) from different geographical locations of Lithuania. This pathogen is common in Lithuania, all trees in uncertified and nontested old gardens were infected with ASPV. Identical nucleotides among nine sequences of the virus isolates obtained in Lithuania were %. The genetic diversity among Lithuanian isolates studied was very high. The genetic variability of the partial genome of ASPV CP ranged from 92.6 % to 83 and from 94.9 to 100 %, respectively. We did not find genetically identical isolates at nucleotide level among the nine ASPV isolates newly identified in Lithuania. 31 worldwide ASPV isolates (registered in the NCBI data base) clearly separated into three groups of the constructed phylogenetic tree. We found three ASPV strains in the apple trees growing in Lithuania. Three virus isolates obtained from the trees growing in the Farmhouse-museum of S. Stanevičius had unique ASPV amino acid mutations in the CP gene. The investigated and evaluated common mutation in the ASPV genome, specifically allowed the detection and identification of ASPV in Lithuania. The data of sequences in the domain of the gene bases will allow the exchange of information with other scientists in the analysis of the origin, the prevalence and mutations of the latent virus. Key words: apple tree, ASPV, genetic polymorphism. 31

32

33 LIETUVOS AGRARINIŲ IR MIŠKŲ MOKSLŲ CENTRO FILIALO SODININKYSTĖS IR DARŽININKYSTĖS INSTITUTO IR ALEKSANDRO STULGINSKIO UNIVERSITETO MOKSLO DARBAI. SODININKYSTĖ IR DARŽININKYSTĖ (1 2). Trešnės ir paprastosios vyšnios rudojo puvinio sukėlėjų (Monilinia spp.) rūšių identifikavimas molekuliniais metodais Birutė Frercks, Vidmantas Stanys Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialas Sodininkystės ir daržininkystės institutas, Kauno g. 30, LT Babtai, Kauno r., el. paštas Rudąjį puvinį gali sukelti keturi giminingi ligos sukėlėjai: Monilinia laxa (Aderh. et Ruhl.) Honey, Monilinia fructigena (Aderh. et Ruhl.) Honey, Monilinia fructicola (G. Wint.) Honey ir Monilia polystroma van Leeuwen. Rūšinė Monilinia spp. sudėtis trešnės soduose Lietuvoje iki šiol nebuvo tirta. Šio tyrimo tikslas buvo nustatyti Monilinia rūšis, paplitusias ant trešnės ir paprastosios vyšnios vaisių Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialo Sodininkystės ir daržininkystės instituto (LAMMC SDI) kaulavaisinių augalų kolekcijoje, taikant molekulinius metodus. Šioje kolekcijoje 2013 metais atsitiktine tvarka buvo paimti 72 Monilinia spp. ėminiai nuo trešnės ir paprastosios vyšnios vaisių. Monilinia rūšys tirtuose bandiniuose buvo nustatytos sudėtinės polimerazės grandininės reakcijos (PRG) metodu. Karantininio ligos sukėlėjo M. fructicola LAMMC SDI kaulavaisinių augalų kolekcijoje nebuvo aptikta. Nustatyta, kad šioje kolekcijoje dominuojanti Monilinia rūšis yra M. laxa, kuri palaipsniui išstumia konkuruojantį trešnės ir paprastosios vyšnios vaisių rudojo puvinio sukėlėją M. fructigena. Reikšminiai žodžiai: Monilinia fructicola, Monilinia fructigena, Monilinia laxa, Prunus avium, Prunus cerasus, sudėtinė PGR. Įvadas. Kaulavaisinių moniliozė yra didžiausią žalą šiems ir kitiems erškėtinių šeimos augalams daranti grybinė liga (van Brouwershaven ir kt., 2010). Šia liga augalai gali sirgti per visą vegetaciją. Priklausomai nuo to, kurias augalo dalis pažeidžia, kaulavaisių moniliozė skirstoma į moniliozinę degligę (angl. blossom blight) ir rudąjį puvinį (angl. brown rot). Moniliozinė degligė plinta pavasarį, vaismedžiams žydint. Pirmiausia ant žiedų pasirodžiusios nekrozės dėmės plinta ant jaunų ūglių ir šakelių, o vaismedžiai atrodo lyg apdegę (Pileckis, 1994). Rudasis puvinys pažeidžia nokstančius vaisius ant jų susidaro rudos puvinio dėmės. Paskui, vaisiams liečiantis, sukėlėjas plinta nuo užkrėstų vaisių ant sveikų (Holb, 2008). Dėl šios ligos kiekvienais metais prarandama apie %, o epifitotijos metais kai kuriuose Europos regionuose iki 90 % derliaus (Apostol, Véghelyi, 1994). Lietuvoje kaulavai- 33

34 sinių moniliozė išplito metais kaip moniliozinė degligė. Tuo metu sirgo vidutiniškai 30 % paprastosios vyšnios medžių, o kai kuriuose šalies regionuose sergamumas siekė iki 60 % (Gudynaitė, 1954). Rudasis puvinys Lietuvoje išplito vėliau ir šiuo metu yra labiausiai paplitusi paprastosios vyšnios vaisių grybinė liga (Valiuškaitė ir kt., 2005). Paskutinė paprastosios vyšnios moniliozės epifitotija Lietuvoje nustatyta metais (Gelvonauskienė ir kt., 2013). Kaip rudasis puvinys pažeidžia trešnės veisles, Lietuvoje nebuvo tirta. Rudąjį puvinį gali sukelti keturi giminingi ligos sukėlėjai: Monilinia laxa (Aderh. et Ruhl.) Honey, Monilinia fructigena (Aderh. Et Ruhl.) Honey, Monilinia fructicola (G. Wint.) Honey ir Monilia polystroma van Leeuwen. M. laxa ir M. fructigena yra Europoje labiausiai paplitusios patogenų rūšys (Côté ir kt., 2004; van Brouwershaven ir kt., 2010). M. polystroma morfologiškai labai panašus į M. fructigena, palyginti neseniai identifikuotas ir ypač paplitęs Japonijoje (van Leeuwen ir kt., 2002). Europoje iki šiol jis aptiktas tiktai Vengrijoje (Petroćzy, Palkovics, 2009). M. fructicola, vadinamo Naujojo pasaulio patogenu (Côté ir kt., 2004), paplitimo arealas iki praėjusio šimtmečio paskutiniųjų dešimtmečių apėmė Šiaurės ir Pietų Amerikos bei Australijos žemynus. M. fructicola, palyginti su M. laxa ir M. fructigena, yra agresyvesnis patogenas (Carstens ir kt., 2010). Šios rūšies individai vystosi esant didesniam temperatūrų intervalui, todėl vaismedžių žiedus pavasarį gali pažeisti anksčiau. Be to, šis patogenas, kitaip nei M. laxa ar M. fructigena, gali daugintis ne tik vegetatyviniu, bet ir lytiniu būdu, todėl genetiškai jis gali greičiau prisitaikyti prie pasikeitusių aplinkos sąlygų (Lichou ir kt., 2002). Nustatyta, kad Europos klimato sąlygos yra labai palankios M. fructicola plisti (van Leeuven ir kt., 2001). Dėl morfologinio Monilinia rūšių panašumo ligų sukėlėjams nustatyti vien tik vizualios patikros nepakanka (van Brouwershaven ir kt., 2010). Todėl šiuo metu Europos ir Viduržemio jūros regiono augalų apsaugos organizacija (EPPO) rekomenduoja Monilinia spp. patogenus nustatyti molekuliniais metodais (EPPO, 2012). Buvo sukurti specifiniai pradmenys Monilinia rūšims identifikuoti naudojant standartinės polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodą (Ioos, Frey, 2000). Vėliau buvo sukurtas sudėtinės PGR metodas, leidžiantis identifikuoti kelis patogenus vienos reakcijos metu (Côté ir kt., 2004). Šis metodas sėkmingai taikytas nustatant patogenų izoliatus (Poniatowska ir kt., 2013) ir tiesiogiai tiriant ėminius, paimtus iš lauko (Hrustić ir kt., 2012). M. fructicola Europoje yra priskiriamas karantininiams patogenams (EU, 2000). EPPO jį įtraukė į A1 sąrašą, į kurį įrašytų patogenų neaptinkama šiame regione metais pirmą kartą identifikavus M. fructicola Prancūzijoje (EPPO, 2002 a), vėliau ir kitose Europos šalyse, šis ligos sukėlėjas buvo perkeltas į EPPO A2 sąrašą, į kurį įrašytų patogenų aptinkama kai kuriose EPPO šalyse, jie stebimi, kontroliuojamas jų paplitimas (EPPO, 2012). Šiuo metu M. fructicola yra pastebėtas jau trylikoje iš dvidešimt aštuonių Europos Sąjungos šalių. Neseniai karantininis patogenas M. fructicola molekuliniais metodais identifikuotas kaimyninėje Lenkijoje (Poniatowska ir kt., 2013). Baltarusijoje, tiriant izoliuotas patogenų kultūras mikrobiologiniais metodais, šio ligos sukėlėjo neaptikta (Lesik, 2013). Europos maisto saugos tarnybos (EFSA) apklausos duomenimis, Latvijoje M. fructicola nėra aptikta, tačiau reikia pabrėžti, kad specifinės patikros neatliekamos, patogenas stebimas tik vizualiai (EFSA, 2011). 34

35 Rudojo puvinio, pažeidžiančio paprastosios vyšnios vaisius, sukėlėjo rūšinė sudėtis Lietuvoje paskutinį kartą buvo tirta 2002 metais, taikant mikrobiologinius metodus (Valiuškaitė, 2002), Europoje vos tik pasirodžius M. fructicola patogenui. Darbo tikslas išanalizuoti Monilinia rūšių, paplitusių ant trešnės ir paprastosios vyšnios vaisių LAMMC SDI kaulavaisinių augalų kolekcijoje, sudėtį, taikant molekulinius metodus. Tyrimo objektas, metodai ir sąlygos. Tyrimai atlikti m. Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialo Sodininkystės ir daržininkystės instituto (LAMMC SDI) Sodo augalų genetikos ir biotechnologijos skyriuje. Analizei atlikti ėminiai paimti birželio mėn. paskutinįjį ir liepos mėn. pirmąjį dešimtadienį LAMMC SDI kaulavaisinių augalų kolekcijoje. Trešnės ir paprastosios vyšnios vaisiai, ant kurių buvo matyti rudojo puvinio simptomų, buvo nuskinti atsitiktine tvarka, vienam ėminiui sudaryti imant po 4 5 vaisius nuo kas šešto vaismedžio tiriamajame plote. Iš viso buvo paimti 72 ėminiai. Nuo vaisių nuimtas micelis buvo laikomas -20 C temperatūroje. Patogenų DNR išskirta ir sudėtinė polimerazės grandininė reakcija (PGR) atlikta pagal Côté ir kt. (2004) metodiką. Išskirtos DNR koncentracija nustatyta naudojant NanoPhotometer P300 spektrofotometrą (Implen, GmbH). Visų bandinių koncentracijos suvienodintos iki 50 ng/µl, praskiedžiant steriliu distiliuotu H 2 O. Sudėtinei PGR atlikti naudoti trys specifiniai tiesioginiai Monilinia rūšių pradmenys: M. fructigena MO368-8R (DNR fragmentų dydis 402 bp), M. fructicola MO368-10R (535 bp), M. laxa Laxa-R2 (351 bp), ir bendras visoms tirtoms rūšims atbulinis pradmuo MO368-5 (Côté ir kt., 2004). Kaip neigiama kontrolė vietoj DNR naudotas H 2 O. Kaip teigiama kontrolė naudota M. laxa ir M. fructigena grynųjų kultūrų DNR. Sudėtinės PGR analizė atlikta Mastercycler personal termocikleriu (Eppendorf, Vokietija). Kiekvieno mėginio analizės buvo atliekamos dviem pakartojimais. DNR elektroforezė atlikta 2 % agarozės gelyje, kuriame yra 2 % Tris-EDTA buferio ir 8µl etidžio bromido. Geliai tirti UV šviesoje, naudojant transliuminatorių RH-5.1 (Herolab, Vokietija), ir vizualizuoti, E. A. S. Y. Win 32 kompiuterine programa (Herolab, Vokietija). Trešnės (32 veislės) ir paprastosios vyšnios (17 veislių) atsparumas rudajam puviniui įvertintas vizualiai LAMMC SDI kaulavaisinių augalų kolekcijoje metais pagal 0 5 balų vertinimo skalę: 0 visi vaisiai sveiki, 5 daugiau kaip 75 % vaisių pažeista. Apskaičiuotas atsparumo aritmetinis vidurkis ir standartinis nuokrypis. Pagal atsparumą veislės suskirstytos į 4 grupes: atsparios (pažeidimo balas 0 P < 1), vidutiniškai atsparios (1 P < 2), vidutiniškai jautrios (2 P < 3) ir jautrios (P 3). Rezultatai. LAMMC SDI kolekcijoje iš viso buvo paimti 72 ėminiai: 47 nuo trešnės, 25 nuo paprastosios vyšnios vaisių. Atlikus sudėtinę fragmentų pagausinimo reakciją, nė viename iš tirtų 72 mėginių nebuvo amplifikuotas 535 bp dydžio DNR fragmentas, būdingas M. fructicola patogenui. Visuose mėginiuose buvo aiškiai matyti amplifikuoti 351 bp (būdingas M. laxa patogenui) ir (arba) 402 bp (būdingas M. fructigena patogenui) dydžio fragmentai (1 pav.). Analizuojamuose mėginiuose dominavo M. laxa specifinis fragmentas, identifikuotas 74 % tirtų mėginių. M. fructigena patogenas aptiktas tik penkiuose tirtuose mėginiuose (7 %). Abu patogenai (M. laxa ir M. fructigena) buvo identifikuoti keturiolikoje mėginių (19 %). 35

36 1 pav. Specifiniai Monilinia spp. DNR fragmentai. M bp DNR fragmentų žymuo; ml specifinis M. laxa fragmentas; mf specifinis M. fructigena fragmentas; ml, mf mėginys su abiejų patogenų fragmentais. Fig. 1. Monilinia species-specific DNA fragments. M bp DNA ladder; ml M. laxa-specific fragment; mf M. fructigena-specific fragment; ml, mf sample with both M. laxa- and M. fructigena specific fragments. Siekiant nustatyti, ar Monilinia rūšių pasiskirstymas priklauso nuo augalo rūšies, buvo įvertinti patogenai ant trešnės ir paprastosios vyšnios vaisių atskirai (2 pav.). M. laxa patogeno dažniau buvo randama ant ėminių, paimtų nuo trešnės vaisių. M. fructigena patogeno (tiek vieno, tiek kartu su M. laxa) dažniau buvo aptinkama ant ėminių, paimtų nuo paprastosios vyšnių vaisių (2 pav.). Tarp Monilinia rūšių pasiskirstymo santykio ant trešnės ir ant paprastosios vyšnios vaisių nustatyta stipri teigiama koreliacija (r = 0,99). Todėl galima teigti, jog nepriklausomai nuo augalo rūšies tiriamuoju laikotarpiu LAMMC SDI kaulavaisinių augalų kolekcijoje dominavo M. laxa patogenas (2 pav.). Siekiant ištirti, ar yra ryšys tarp augalo genotipo atsparumo rudajam puviniui ir Monilinia rūšies paplitimo ant tiriamo genotipo, buvo įvertintas analizuojamų trešnės ir paprastosios vyšnios veislių atsparumas šiai grybinei ligai (1 ir 2 lentelės). Trešnės veislių atsparumas įvairavo nuo 0,1 iki 2,5 balo. Iš 32 tirtų trešnės veislių 20 (63 %) buvo atsparios rudajam puviniui. Iš analizuotų trešnės veislių trys (9 %) buvo vidutiniškai jautrios, kitos (28 %) vidutiniškai atsparios šiai grybinei ligai. Paprastosios vyšnios veislių atsparumas rudajam puviniui įvairavo nuo 0,1 iki 3 balų. Paprastosios vyšnios, kaip ir trešnės, didžiausią tirtų veislių dalį (41 %) sudarė atsparios veislės. Penkios paprastosios vyšnios veislės (29 %) buvo vidutiniškai atsparios šiai ligai, keturios (24 %) pagal atsparumo balą buvo priskirtos vidutiniškai jautrių veislių grupei. Kitaip negu trešnės, viena paprastosios vyšnios veislė buvo įvertinta kaip jautri rudajam puviniui. Lyginant trešnės ir paprastosios vyšnios veislių pasiskirstymą į keturias atsparumo grupes, galima teigti, kad tirtos trešnės veislės buvo mažiau pažeistos rudojo puvinio nei paprastosios vyšnios. 36

37 2 pav. Identifikuotų Monilinia rūšių pasiskirstymas ant trešnės ir paprastosios vyšnios vaisių Fig. 2. Distribution of Monilinia species identified on sweet and sour cherry fruit Monilinia rūšių paplitimas trešnės skirtingo atsparumo genotipuose skyrėsi nuo jų pasiskirstymo skirtingo atsparumo paprastosios vyšnios genotipuose. M. laxa patogenas buvo identifikuotas vaisiuose tų trešnės veislių, kurios priklausė visoms keturioms atsparumo rudajam puviniui grupėms (1 lentelė). Šių trešnės veislių atsparumas buvo vidutiniškai 0,86 balo. M. fructigena patogenas aptiktas vaisiuose tik tų veislių, kurios buvo priskirtos atsparių trešnės veislių grupei (atsparumo balas vidutiniškai 0,25). Trešnės veislės, kurių vaisiuose buvo aptikti abu patogenai, taip pat buvo priskirtos atsparių veislių grupei (atsparumo balas vidutiniškai 0,37). Dešimt trešnės veislių buvo analizuota kelis kartus (1 lentelė). Ostuzenka, Rožinės, Siubarovskaya, Sunburst ir Tjucevnaja veislių vaisiuose buvo du tris kartus aptiktas tik M. laxa patogenas, o ant selekcinio numerio 5 vaisių du kartus aptiktas tik M. fructigena patogenas. Atsparių trešnės veislių: Verdisch braune, Radica, Mindaugė ir Krasny Mak, skirtinguose mėginiuose buvo identifikuoti abu patogenai (1 lentelė). Tiriant Monilinia rūšių pasiskirstymą ant skirtingo atsparumo rudajam puviniui paprastosios vyšnios veislių vaisių, M. laxa patogenas buvo identifikuotas vaisiuose tų paprastosios vyšnios veislių, kurios priklausė visoms keturioms atsparumo rudajam puviniui grupėms (atsparumas vidutiniškai 0,95 balo). Kitaip nei tiriant trešnės veisles, M. fructigena patogenas buvo identifikuotas visų atsparumo grupių, išskyrus jautrias, paprastosios vyšnios veislių vaisiuose (atsparumo balas vidutiniškai 1,5). Paprastosios vyšnios veislės, kurių vaisiuose buvo aptikti abu patogenai, priklausė visoms keturioms atsparumo rudajam puviniui grupėms. Vidutinis šių veislių atsparumas buvo mažesnis 1,9 balo. Septynių paprastosios vyšnios veislių, kurių analizė buvo atlikta kelis kartus, vaisiuose buvo identifikuoti abu patogenai, išskyrus atsparią rudajam puviniui veislę Zaranka : jos vaisiuose buvo du kartus aptiktas tik M. laxa patogenas (2 lentelė). 37

38 1 lentelė. Monilinia spp. patogenų paplitimas ant skirtingų trešnės veislių vaisių ir šių veislių atsparumas rudajam puviniui Table 1. Prevalence of Monilinia spp. species identified on sweet cherry accession fruit and resistance to brown rot of these accessions Veislė arba selekcinis numeris Cultivar or selection PGR metodu nustatyti kaulavaisinių moniliozės sukėlėjai * Brown rot blossom blight disease identified by PCR* M. laxa M. fructigena M. laxa ir M. fructigena Atsparumas rudajam puviniui balais Resistance to brown rot (score) Atsparumo grupė** Group of resistance ** Altenburger Melonen ,5 ± 0,25 v. j. Celestė ,3 ± 0,33 v. a. Festivalnaya ,1 ± 0,03 a. Gostinec ,8 ± 0,23 a. Gronkovaya ,5 ± 0,35 a. Jaroslavnaya ,3 ± 0,48 v. a. Krasnyj Mak ,4 ± 0,24 a. Meckenheimer ,0 ± 0 v. a. Melika ,0 ± 0,39 v. a. Merchant ,8 ± 0,25 v. a. Mindaugė ,1 ± 0,02 a. Ostuzenka +, ,2 ± 0,12 a. Radica +, ,1 ± 0,08 a. Rožinė +, +, ,5 ± 0,50 v. a. Sam ,3 ± 0,33 v. j. Severnaya ,1 ± 0,03 a. Siubarovskaya +, ,1 ± 0,03 a. Sunburst +, ,5 ± 0,28 a. Tjucevnaya +, +, ,8 ± 0,15 a. Tverskaya ,7 ± 0,26 a. Vega ,3 ± 0,33 v. j. Verdisch braune +, ,3 ± 0,33 a. Zurba ,3 ± 0,23 a. A. L: Nr ,1 ± 0,03 a. Agila Drogano ,5 ± 0,50 v. a. geltonoji Dniprovka Drogano ,1 ± 0 a. geltonoji Merchant Nr ,1 ± 0 a. Sam Hedelfinger ,6 ± 0,45 a. Nr , + 0,6 ± 0,23 a. Nr ,7 ± 0,33 v. a. Nr ,1 ± 0,05 a. Nr ,0 ± 0 v. a. * + amplifikuotas specifinis Monilinia rūšies DNR fragmentas / * + amplified Monilinia spp. species-specific DNA fragment ** a. atspari, v. a. vidutiniškai atspari, v. j. vidutiniškai jautri / ** a. resistant, v. a. moderately resistant, v. j. moderately sensitive 38

39 2 lentelė. Monilinia spp. patogenų paplitimas ant skirtingų paprastosios vyšnios veislių vaisių ir šių veislių atsparumas rudajam puviniui Table 2. Prevalence of Monilinia species identified on sour cherry accession fruit and resistance to brown rot of these accessions Veislė arba selekcinis numeris Cultivar or selection PGR metodu nustatyti kaulavaisinių moniliozės sukėlėjai Brown rot blossom blight disease identified by PCR* M. laxa M. fructigena M. laxa ir M. fructigena Atsparumas rudajam puviniui balais Resistance to brown rot (score) Atsparumo grupė* Group of resistance* Griot seredko ,1 ± 0 a. Igrushka ,1 ± 0 a. Keleris sportas ,8 ± 0,17 v. j. Liubskaja ,7 ± 0,33 v. a. Nordia ,1 ± 0,02 a. North Star ,8 ± 0,25 v. j. Novodvorskaya ,0 ± 0,02 a. Pietryčių ankstyva +, ,3 ± 0,33 v. j. Roviesnica ,6 ± 0,24 v. a. Samsonovka ,1 ± 0,02 a. Shalunya ,1 ± 0,05 a. Venok ,8 ± 0,25 v. j. Zaranka +, ,3 ± 0,23 a. Zyvica ,8 ± 0,17 v. a. Verknė ,3 ± 0,33 v. a. Nr ,0 ± 0,25 j. Nr ,3 ± 0,33 v. a. * + amplifikuotas specifinis Monilinia rūšies DNR fragmentas / * + amplified Monilinia spp. species-specific DNA fragment * a. atspari, v. a. vidutiniškai atspari, v. j. vidutiniškai jautri, j. jautri / * a. resistant, v. a. moderately resistant, v. j. moderately sensitive, j. sensitive Aptarimas. Pirmosios Lietuvoje Monilinia rūšių analizės, atliktos taikant molekulinius metodus, rezultatai leidžia daryti prielaidą, kad iki šiol karantininio patogeno M. fructicola mūsų šalyje nėra pastebėta. Atliekant šią analizę Monilinia rūšys buvo tirtos ant trešnės ir paprastosios vyšnios vaisių, tačiau tirti patogenai daro žalą ir kitiems kaulavaisiniams (Holb, 2008) ir erškėtinių šeimos augalams: kriaušėms ar obelims (EPPO, 2012). Europoje karantininis patogenas M. fructicola dažniausiai buvo aptinkamas ant persiko (EPPO, 2002 a; EPPO, 2002 b; Duchoslavova ir kt., 2007; De Cal ir kt., 2009; Munda, Viršček Marn, 2010; Poniatowska ir kt., 2013), rečiau ant nektarino (Pellegrino ir kt., 2009), abrikoso (Hilber-Bodmer ir kt., 2010), naminės slyvos (Ondejková ir kt., 2010; Poniatowska ir kt., 2013), trešnės ir paprastosios vyšnios (Duchoslavova ir kt., 2007), obels (Duchoslavova ir kt., 2007; Poniatowska ir kt., 2013) ir netgi ant gervuogių (Hinrichs-Berger, Müller, 2010). Todėl 39

40 siekiant įsitikinti, kad Lietuvoje M. fructicola patogeno nėra, ateityje turėtų būti atlikti platesni tyrimai ne tik su trešnės ir paprastosios vyšnios, bet ir su kitais vaismedžiais, imant ėminius iš daugiau Lietuvos vietovių. Monilinia rūšinės sudėties analizė rodo, kad tiriamuoju laikotarpiu LAMMC SDI kaulavaisinių augalų kolekcijoje tirtų trešnės ir paprastosios vyšnios veislių vaisius dažniausiai pažeidžia M. laxa patogenas. Šis patogenas dominavo ir Vengrijoje (Sződi ir kt. 2012). Ankstesniais tyrimais buvo nustatyta, kad abu patogenai M. fructigena ir M. laxa vienodai pažeidžia paprastosios vyšnios vaisius Lietuvoje (Valiuškaitė ir kt., 2005). Toks Monilinia rūšių disbalansas per tam tikrą laiką nėra naujas reiškinys. Anksčiau daugiausia žalos kaulavaisiniams Europoje darė M. laxa (Larena ir kt., 2005). Ispanijoje, atsiradus invaziniam kaulavaisinių moniliozės sukėlėjui M. fructicola, nustatyta, kad per penkerius metus dėl patogenų konkurencijos tarpusavyje M. fructigena daroma žala kaulavaisiniams sumažėjo, o M. fructicola žala pasiekė M. laxa lygmenį (Villarino ir kt., 2013). Remiantis šio tyrimo rezultatais galima daryti prielaidą, kad Lietuvos agroklimato sąlygos ir LAMMC SDI kaulavaisinių augalų kolekcijoje auginami trešnės ir paprastosios vyšnios genotipai yra palankesni M. laxa patogenui plisti, o M. fructigena patogenas yra palaipsniui išstumiamas. Monilinia spp. patogeno plitimo intensyvumas priklauso nuo augalų atsparumo (EPPO, 2012). LAMMC SDI kaulavaisinių augalų kolekcijoje trešnės ir paprastosios vyšnios atsparumas rudajam puviniui iki šiol nebuvo tirtas. Žinoma, kad Lietuvos agroklimato sąlygomis gamybiniuose soduose paprastosios vyšnios veislė North Star yra labai jautri moniliozinei degligei ir rudajam puviniui (Valiuškaitė ir kt., 2005). Šiuo tyrimu įvertinus paprastosios vyšnios veislių atsparumą rudajam puviniui, North Star veislė buvo priskirta vidutinio jautrumo veislių grupei. Tokiam tyrimų rezultatų skirtumui įtakos gali turėti greta augančių skirtingo atsparumo veislių fonas (derinys) LAMMC SDI kaulavaisinių augalų kolekcijoje. Gamybiniuose soduose genotipų įvairovė maža, todėl sąlygos ligai vystytis yra palankesnės. Įvertinus trešnės ir paprastosios vyšnios veislių atsparumą rudajam puviniui, nustatyta, kad tirtos trešnės veislės buvo atsparesnės nei paprastosios vyšnios veislės. Tiriant Monilinia rūšių pasiskirstymą ant trešnės ir paprastosios vyšnios nustatyta, kad tai nepriklauso nuo augalo rūšies. M. laxa patogeno aptikta daugiausia tiek ant trešnės, tiek ant paprastosios vyšnios vaisių. Šie rezultatai sutampa su kitų mokslininkų gautais rezultatais (Gell ir kt., 2007; Sződi ir kt., 2012). Monilinia rūšių pasiskirstymas ant vienos augalo rūšies skirtingo atsparumo genotipų iki šiol nėra tirtas. Tyrimo metu M. laxa patogenas buvo identifikuotas ant visų keturių skirtingo atsparumo rudajam puviniui grupių trešnės ir paprastosios vyšnios veislių vaisių. M. fructigena sukėlėjas buvo aptiktas tik ant atsparių trešnės veislių vaisių ir ant visų keturių atsparumo grupių paprastosios vyšnios veislių vaisių. Rudajam puviniui atsparių penkių trešnės veislių ir vienos paprastosios vyšnios veislės mėginiuose kelis kartus buvo identifikuotas vienintelis patogenas M. laxa, o vieno, atsparioms veislėms priskiriamo trešnės selekcinio numerio mėginyje du kartus buvo aptiktas tik M. fructigena patogenas. Abu patogenai buvo aptikti keturių trešnės ir šešių vyšnios veislių vaisių mėginiuose, paimtuose nuo skirtingų tos pačios veislės vaismedžių. Iš gautų rezultatų neaišku, ar toks patogenų specifiškumas gali būti siejamas su trešnių arba vyšnių veislių atsparumu. Ankstesniais tyrimais, kurie 40

41 apima vyšnių atsparumo moniliozinei degligei dešimties metų vertinimą, nustatyta, kad vienų veislių atsparumas yra stabilus, o kitų kinta (Gelvonauskienė ir kt., 2013). Veislių atsparumo stabilumas arba kintamumas gali turėti įtakos šio tyrimo rezultatams, nes trešnių ir vyšnių veislių atsparumas rudajam puviniui buvo vertinamas tik trejus metus, kai nepasireiškė kaulavaisinių moniliozės epifitotija. Todėl šiuo metu daryti išvadas, ar veislių atsparumas rudajam puviniui yra stabilus ar kintantis, ir nustatyti ryšį su patogenų specifiškumu yra per anksti. Kita vertus, šiuo tyrimu nustatyta, kad M. laxa yra dominuojantis patogenas LAMMC SDI kolekcijoje. Be to, atsižvelgiant į besiplečiantį karantininio M. fructicola patogeno paplitimo arealą Europoje, sunku prognozuoti jo pasirodymo Lietuvoje tikimybę. Todėl ateityje Monilinia rūšių sudėtis turėtų būti stebima. Išvada. Tiriamuoju laikotarpiu LAMMC SDI kaulavaisinių augalų kolekcijoje ant trešnių ir vyšnių vaisių dominavo M. laxa sukėlėjas. Karantininio patogeno M. fructicola minėtoje kolekcijoje nebuvo aptikta. Padėka. Tyrimai atlikti vykdant programą Žemės ūkio ir miškų augalų genetika ir genotipų kryptingas keitimas. Gauta Parengta spausdinti Literatūra 1. Apostol J., Véghelyi K Results of test crossing in oder to get disease resistant sour cherry varieties. In: H. Schmidt, M. Kellerhals (eds.), Progress in Temperate fruit breeding. Developments in Plant Breeding. Kluwer Academic Publishers, Switzerland, Carstens E., van Niekerk J. M., Laubscher W., Fourie P. H Resolving the status of Monilinia spp. in South African stone fruit orchards. Journal of Plant Pathology, 92: Côt M. J., Tardif, M. C., Meldrum A. J Identification of Monilinia fructigena, M. fructicola, M. laxa, and Monilia polystroma on inoculated and naturally infected fruit using multiplex PCR. Plant Disease, 88: De Cal A., Gell I., Usall J., Viñas I., Melgarejo P First report of brown rot caused by Monilinia fructicola in peach orchards in Ebro Valley, Spain. Plant Disease, 93: Duchoslavova J., Siruckova I., Zapletalova E., Navratil M., Safarova D First report of brown rot caused by Monilinia fructicola on various stone and pome fruits in the Czech Republic. Plant Disease, 91: EFSA Pest risk assessment of Monilinia fructicola for the EU territory and identification and evaluation of risk management options. EFSA Journal, 9(4): (1 155). 7. EPPO a. First report of Monilinia fructicola in France. OEPP/EPPO Reporting Service 2002/

42 8. EPPO b. Monilinia fructicola found in Austria. Reporting Service 2002/1. 9. EPPO A review of pest surveillance techniques for detecting quarantine pests in Europe. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, 42(3): EU Council Directive 2000/29/EC of 8 May 2000 on protective measures against the introduction into the Community of organisms harmful to plants or plant products and against their spread within the Community. Official Journal of the European Communities. Legislation Series, 129: Gell I., Larena I., Melgarejo P Genetic diversity in Monilia laxa populations in Peach Orchards in Spain. Journal of Phytopathology, 155: Gelvonauskienė D., Frercks B., Stepulaitiene I., Stanys V Diversity of resistance to Monilinia laxa and spring frost of sour cherry germplasm. Acta Horticulturae, 976: Gudynaitė O Vyšnių moniliozė Lietuvos TSR ir kova su ja. Žemdirbystės ir dirvožemio instituto darbai, 1: Hilber-Bodmer M., Bünter M., Patocchi A First report of brown rot caused by Monilinia fructicola on apricot in a Swiss orchard. Plant Disease, 94: Hinrichs-Berger J., Müller G First record of Monilia fructicola on blackberry fruits. Journal of Plant Diseases and Protection, 117: Holb I. J Brown rot blossom blight of pome and stone fruits: symptom, disease cycle, host resistance, and biological control. International Journal of Horticultural Science, 14(3): Hrustić J., Grahovac M., Mihajlović M., Delibašić G., Ivanović M., Nikolić M., Tanović B Molecular Detection of Monilinia fructigena as Causal Agent of Brown rot on Quince. Pesticidi i fitomedicina = Pesticides and phytomedicine, 27(1): Ioos R., Frey P Genomic variation within Monilinia laxa, M. fructigena and M. fructicola, and application of species identification by PCR. European Journal of Plant Pathology, 106: Larena I., Torres R., De Cal A., Liñan M., Melgarejo P., Domenichini P Biological control of postharvest brown rot (Monilinia spp.) of peaches by field applications of Epicoccum nigrum. Biological Control, 32: Lesik K Monilinia species causing fruit brown rot, blossom and twig blight in apple orchards in Belarus. Proceedings of the Latvian academy of sciences (Section B), 67(683): Lichou J., Breniaux D., Mandrin J. F Monilioses sur arbres fruitiers. Introduction d une nouvelle espèce: Monilia fructicola. Arboriculture fruitière, 558: Munda A., Viršček Marn M First report of brown rot caused by Monilinia fructicola affecting peach orchards in Slovenia. Plant Disease, 94: Ondejková N., Hudecova M., Bacigálová K First report on Monilinia fructicola in the Slovak Republic. Plant Protection Science, 46(4): Pellegrino C., Gullino M. L., Garibaldi A., Spadaro D First report of brown rot of stone fruit caused by Monilinia fructicola in Italy. Plant Disease, 93:

43 25. Petroćzy M., Palkovics L First report of Monilia polystroma on apple in Hungary. European Journal of Plant Pathology, 125: Poniatowska A., Michalecka M., Bielenin A Characteristic of Monilinia spp. fungi causing brown rot of pome and stone fruits in Poland. European Journal of Plant Pathology, 135(4): Sodo kenkėjai ir ligos S. Pileckis (sudaryt.). Mokslo ir enciklopedijų leidykla, Vilnius, Sződi S., Komjáti H., Turóczi G Characterization of M. laxa and M. fructigena isolates from Hungary with MP-PCR. Horticultural science, 39: Valiuškaitė A Micromycetes infecting stone fruit trees. Biologija, 1: Valiuškaitė A., Raudonis L., Survilienė E Analysis of micromycetes composition of sour cherry fruits in Lithuania. Phytopathologia Polonica, 35: van Brouwershaven I. R., Bruil M. L., van Leeuwen G. C. M., Kox L. F. F A real-time (TaqMan) PCR assay to differentiate Monilinia fructicola from other brown rot fungi of fruit crops. Plant Pathology, 59: van Leeuwen G. C. M., Baayen R. P., Holb I. J., Jeger M. J Distinction of the Asiatic brown rot fungus Monilia polystroma sp. nov. from M. fructigena. Mycological Research, 106: van Leeuwen G. C. M., Baayen R. P., Jeger M. J Pest risk assessment for the countries of the European Union (as PRA area) on Monilinia fructicola. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 31: Villarino M., Egüen B., Lamarca N., Segarra J., Usall J., Melgarejo P., De Cal A Occurrence of Monilinia laxa and M. fructigena after introduction of M. fructicola in peach orchards in Spain. European Journal of Plant Pathology, 137: SODININKYSTĖ IR DARŽININKYSTĖ. SCIENTIFIC ARTICLES (1 2). Identification of sweet and sour cherry brown rot causing (Monilinia spp.) species by molecular methods B. Frercks, V. Stanys Summary Brown rot can be caused by four related pathogenic agents: Monilinia laxa (Aderh. et Ruhl.) Honey, Monilinia fructigena (Aderh. Et Ruhl.) Honey, Monilinia fructicola (G. Wint.) Honey and Monilia polystroma van Leeuwen. The composition of Monilinia species on sweet cherry fruit was not yet investigated in Lithuania. The aim of this study was to establish the Monilinia spp. species common on sweet and sour cherry fruit in the stone fruit collection at the Institute of Horticulture, LRCAF, based on molecular methods. The total of 72 samples were randomly sellected in 2013 in this stone fruit collection. The samples were identified on Monilinia species level using multiplex PCR. A quarantine pathogen M. fructicola was 43

44 not detected in the stone fruit collection at the Institute of Horticulture, LRCAF. Moreover, it was established that the most common Monilinia species in this collection was M.laxa. This pathogen progressively diplaces the rival pathogenic agent M. fructigena cousing brown rot on sweet and sour cherry fruit. Key words: Monilinia fructicola, Monilinia fructigena, Monilinia laxa, multiplex PCR, Prunus avium, Prunus cerasus. 44

45 SCIENTIFIC WORKS OF THE INSTITUTE OF HORTICULTURE, LITHUANIAN RESEARCH CENTRE FOR AGRICULTURE AND FORESTRY AND ALEKSANDRAS STULGINSKIS UNIVERSITY. SODININKYSTĖ IR DARŽININKYSTĖ (1 2). Biochemical composition and antioxidant activity of Japanese quince (Chaenomeles japonica) fruit, their syrup and candied fruit slices Marina Rubinskienė 1*, Pranas Viškelis 1, Jonas Viškelis 1, Ramunė Bobinaitė 2, Maryna Shalkevich 3, Maryna Pigul 3, Dalia Urbonavičienė 1 1* Biochemistry and Technology Laboratory, Institute of Horticulture, Lithuanian Research Centre for Agriculture and Forestry, Kauno st.30, LT-54333, Babtai, Kaunas distr., Lithuania, m.rubinskiene@lsdi.lt 2 Faculty of Natural Sciences, Vytautas Magnus University, LT-44248, K. Donelaičio st. 58, Kaunas, Lithuania 3 Institute for Fruit Growing Belsad, BY , Koroliovo st. 2, Samokhvalovichy, Minsk distr., Belarus The aim of this study was to evaluate biochemical composition and antioxidant activity of Japanese quince fruit and their products as a potential source of biological active compounds. Fresh Japanese quince fruit and their products (syrup and candied fruit slices) were investigated. Dry soluble solids, ascorbic acid and total phenolics content of fresh fruit, freezedried products and sugar syrups were analyzed. The antioxidant activity of the samples was evaluated using the DPPH radical scavenging assay. Surface colour of Japanese quince fruit and their products was measured using a spectrophotometer. Fresh Japanese quince accumulated high amounts of ascorbic acid, 55 mg 100 g -1 in hybrid clone C.47 and 106 mg 100g -1 in Lichtar. The fruit of Japanese quince Lichtar had higher content of phenolic compounds (422.6 mg 100 g -1 ) and stronger antiradical activity (12.35 µmol TE/g). Sugar syrup produced from the hybrid clone C.47 had higher concentration of ascorbic acid (56.4 mg 100 g of syrup). The content of organic acids in syrups was %. The content of ascorbic acid in candied quince slices was mg 100 g -1 of the product. A higher amount of ascorbic acid was retained in candied slices of Lichtar. Candied slices of hybrid clone C.47 had higher content of phenolic compounds (917 mg 100 g -1 ) and stronger antiradical activity µmol TE g -1. Colour value a* and colour tone h of quince fruit and products varied most of all. Among all tested products quince syrups were distinguished for the high lightness (L *) values. Key words: chemical composition, fruit, Japanese quince, products. 45

46 Introduction. Selection of the most suitable plant cultivars and hybrids for industrial processing and expansion of product assortment is very important. The perennial plant breeding process is time-consuming and may last many years. It is highly unlikely that a new, valuable selection product will be developed without the assessment of the potential and quality of the raw material (Rumpunen, 2011). Japanese quince (Chaenomeles japonica) belongs to the rose family (Rosaceae) of the genus Chaenomeles. The flesh of quince fruit is pale yellow and hard. Due to an abundant amount of essential oils ripe quince fruit exudes specific and pleasant aroma. Carbohydrates, amino acids, proteins, tannins and organic acids are important components of the chemical composition of the quince. The soluble solids ( Brix) in Chaenomeles japonica fruit range from 14 to 17, the total sugars from 1.2 to 3.1 % (with fructose and glucose being predominant), the pectin content from 0.7 to 1.3 % and mineral content from 0.38 to 0.46 %. In addition, quince fruit are rich in organic acids ( %) and are naturally low in fat (Kawecki et al., 1999; Thomas et al., 2003; Bieniek et al., 2005). Ascorbic acid content in quince fruit was reported to vary between 18 and 233 mg per 100 g-1, the variation was influenced by environmental factors and fruit genotype (Кибкало, 1989; Bieniek et al., 2005). Quince fruit, due to the high content of pectin and its gelatinising capability in acid environment in the presence of sucrose, are important raw materials in the canned/ preserved food industry. Chaenomeles japonica fruit have been shown to have antimicrobial and antioxidant properties. (Essawi, Srour, 2000; Rumpunen, Kviklys, 2001; Dai et al., 2003). Quince fruit, as a natural source of antioxidants, may be used in foods or nutraceuticals for the disease prevention (Magalhćes et al., 2009; Rop et al., 2011). In the last decade, the development of antibiotic-resistant microorganisms has become a serious problem necessitating the discovery of newer antimicrobial agents. Therefore, it has been a renewed interest worldwide in natural antimicrobial agents such us essential oils and other plant derived biologically active substances (Xianfei et al., 2007). Pleasant flavour, high content of organic acids and fibre makes quince fruit valuable and interesting raw material for the development of various, healthy food products (Rumpunen, 2002). Quince fruit are suitable for juice, wine, liqueur, puree, jam production and also for pectin and aromatic compounds extraction. Syrups, liqueurs, carbonated soft drinks, marmalades and caramels are popular products on the market of the Baltic States and neighbouring countries (Lesinska 1986; Ruisa 1996), thus quince fruit could be more widely used in the production of similar foods. The aim of this study was to evaluate biochemical composition and antioxidant activity of Japanese quince fruit and their products as a potential source of biologically active compounds. Object, Methods and Conditions. Fresh Japanese quince fruit and their products (syrup and candied fruit slices) were investigated at the Institute of Horticulture, Lithuanian Research Centre for Agriculture and Forestry. The object of the research was Japanese quince fruit of Lichtar and hybrid clone C.47. For chemical analysis the whole fruit without the core were used (peel was not separated). Candied fruit slices were sublimated in -78 C freeze dryer ilshin. Lab. Co., Ltd. The individual samples were made after a thorough homogenization of fresh fruit or candied slices in a laboratory grinder. 46

47 Dry soluble solids, ascorbic acid and total phenolics content of fresh fruits (fresh weight FW), freeze-dried products (dry weight DW) and sugar syrups were analyzed according to the standard methods. Ascorbic acid was measured by titration with a 2,6-dichlorophenolindophenol sodium chloride solution (AOAC, 1990). The content of soluble solids was determined using a digital refractometer (ATAGO PR-32, Atago Co. Ltd., Tokyo, Japan). The concentration of phenolic compounds was measured using the Folin-Ciocalteu phenol reagent (Slinkard, Singleton, 1977). The antioxidant activity of the samples was tested using the DPPH free radical scavenging assay (Brand-Williams et al., 1995). Surface colour of Japanese quince fruit and their products was measured using a spectrophotometer MiniScan XE Plus (Hunter Associates Laboratory, Inc., Reston, Virginia, USA). CIEL*a*b* colour parameters were recorded as L* (lightness), a* (+ redness/- greenness), and b* (+ yellowness/ - blueness). The chroma (C* = (a* 2 + b* 2 ) 1/2 ) and hue angle (h = arctan (b*/a*)) were also calculated (CIE L*a*b* Color Scale, 1996; McGuiere, 1992). All investigations were carried out in three replicates. The results of chemical composition were mathematically processed by computer program Microsoft Excel. Results and Discussion. The results of the chemical analysis of fresh Japanese quince fruit are presented in Table 1. The fruit of the hybrid clone C.47 had higher content of total acids (6.12 % FW) and higher content of soluble solids (9.0 % FW) compared to the fruit of Lichtar. On the other hand, the fruit of Lichtar had significantly higher content of ascorbic acid, total phenolics and radical scavenging capacity than the fruit of the hybrid clone C.47. Table 1. Content of bioactive compounds and antioxidant capacity of fresh Japanese quince fruit 1 lentelė. Biologiškai aktyvių medžiagų kiekis ir šviežių japoninių svarainių vaisių antioksidacinė geba Cultivar Veislė Soluble solids Tirpios sausosios medžiagos (%) Titrable acidy Titruojamasis rūgštingumas (%) Ascorbic acid Askorbo rūgštis (mg 100 g -1 ) Total Phenolic content Bendras fenolių kiekis (mg 100 g -1 ) DPPH (µte g -1 ) Lichtar 8.00 ± ± ± ± ± 0.51 C ± ± ± ± ± 0.35 Because of the high acidity and hard pulp, quince fruit are not suitable for direct consumption. In spite of that, they show many outstanding technological and nutritional properties. A high content of ascorbic acid (59 mg in 100 ml of juice, on average) and total phenolics (284 mg in 100 ml of juice, on average) as well as high acidity of the juice, suggests that Chaenomeles japonica fruit are a valuable source of bioactive substances and may be an interesting raw material for the food industry, e. g. to increase food functionality and to manufacture high added value products or 47

48 their ingredients (Ros et al., 2004). It is known that quince fruit show antioxidant activity which results mainly from the presence of a number of phenolic substances and ascorbic acid (Fattouch et al., 2007; Du et al., 2013). In our study, the fruit of Lichtar had higher content of phenolic compounds (422.6 mg 100 g -1 FW) and ascorbic acid (100.4 mg 100 g -1 FW) and had stronger free radical scavenging capacity (12.35 µmol TE g -1 ) than the fruit of the hybrid clone C.47 (Table 1). Two products were made of the quince fruit: syrup (quince juice extracted with sucrose) and freeze-dried, candied quince slices. The total soluble solids content in both syrups (made from Lichtar and clone C.47 fruit) was 50 %. A higher content of ascorbic acid (56.4 mg 100 g -1 ) was determined in the syrup made from the fruit of hybrid clone C.47. The ascorbic acid content in the Lichtar syrup was lower by 37 %. However, the syrup made from Lichtar had a significantly higher content of the total phenolics ( g -1 ) and a higher free radical scavenging capacity (9.95 µmol TE g -1 ) (Table 2). The titratable acidity of the quince syrups was very similar, 3.09 % (C.47) and 3.18 % ( Lichtar ). The ascorbic acid content was well retained in the freeze-dried, candied quince slices (Table 2). The ascorbic acid content in the dried candied products was mg 100 g -1 dry weight. A higher ascorbic acid content was determined in the candied slices of Lichtar, whereas the candied slices of hybrid clone C.47 had a higher content of the total phenolics (917 mg 100 g-1 DW) and a higher radical scavenging capacity (30.89 µmol TE g -1 ). The results of the total phenolics and the radical scavenging activity in the dried candied products are somewhat contrary to the ones determined in the fresh fruit of Lichtar and hybrid clone C.47. Table 2. Content of bioactive compounds and antioxidant capacity of Japanese quince products 2 lentelė. Antioksidacinė geba ir biologiškai aktyvių medžiagų kiekis japoninio svarainio produktuose Cultivar Veislė Product Produktas Lichtar Syrup Sirupas Candied fruit slices Vaisių cukatos C.47 Syrup Sirupas Candied fruit slices Vaisių cukatos Titratable Ascorbic acid acidy Askorbo rūgštis Titruojamasis (mg 100 g rūgštingumas -1 DW) (% DW) Total phenolic content Bendras fenolių kiekis (mg 100 g -1 DW) DPPH (µte g -1 ) 3.18 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

49 The colour parameters of the samples (CIEL*a*b* system) are presented in Figure 1. High L* values indicate that the flesh of quince fruit is very light: L* = ± 2.95 ( Lichtar ) and ± 1.78 (hybrid clone C.47). On the other hand, the lightness values (L*) of dried, candied quince slices were even higher. The quince syrups had the darkest colour (lowest L* values). Fig. 1. CIELab colour parameters of fresh Japanese quince and their products 1 pav. Japoninio svarainio vaisių ir jų produktų CIELab spalvos rodikliai The L* values of the syrups were 2.5 times lower than those of the candied quince slices. Chroma C* is an expression of the purity or saturation of a single colour. Significant differences in chroma C* values of fresh fruit and products were detected. The syrups had the lowest C* values 1.41 (C.47) and 1.57 ( Lichtar ). This indicates that the hue angle (h ) of the syrups moves from the yellow colour zone to the red zone, although staying far from the fully red colour (0 ). The yellowness (b*) values of fresh quince skins were times higher than the yellowness values of the flesh. The syrups had the lowest b* values (were the least yellow). However, there were no significant differences between the yellowness values of the syrups made from Lichtar and hybrid clone C.47. The candied fruit slices were yellower (higher b* values) than the pulp of fresh fruit. However, there were no significant differences between the yellowness values of freeze-dried, candied slices of the cultivar and the selection hybrid clone. The freeze-dried candied quince slices were lighter, redder 49

50 and yellower than the pulp of fresh quince. The redness/greenness value (a*) of fresh fruit and their products varied most of all. The negative a* value of the quince pulp and syrups indicate the presence of green colour. Conclusions. 1. The results of the study indicate that quince fruits are an extremely rich source of ascorbic acid and phenolic compounds. The fruits of Lichtar accumulated higher amounts of ascorbic acid and phenolic compounds (100.4 ± 9.51 mg 100 g -1 and ± 8.74 mg 100 g -1, respectively) than the hybrid clone C Candied quince slices contained high amount of ascorbic acid. Higher content of ascorbic acid was found in the candied fruits of Lichtar (124 ± 6.19 mg 100 g -1 DW). However, the syrup made from the fruits of hybrid clone C.47 had higher content of ascorbic acid (56.4 ± 4.87 mg 100 g -1 ). Furthermore, candied slices of C.47 had higher content of phenolic compounds (917 ± mg 100 g -1 DW) and higher free radical scavenging capacity (30.89 ± 0.42 µmol TE g -1 ). 3. Freeze-dried, candied quince slices were lighter than peel or pulp of fresh fruits and yellower and redder than the pulp of fresh fruits. The syrups made from quince fruits were the darkest (had the lowest L* values) among the investigated products. Acknowledgement. This work was supported by a grant from the Research Council of Lithuania, No. VPI-3.1-ŠMM-10-V Gauta Parengta spausdinti References 1. AOAC Vitamin C (ascorbic acid) in vitamin preparations and juice. In: K. Helrich (ed.), Official Methods of Analysis, 15 th ed. AOAC Inc., Arlington, VA. 2. Bieniek A., Kawecki Z., Lojko R., Stanys V Owocodajne drzewa i krzewy chłodniejszych stref klimatycznych. Olsztyn, Brand-Williams W., Cuvelier M. E., Berset C Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebensmittel-Wissenschaft und Technologie, 28: CIE L*a*b* Color Scale. HunterLab Applications Note (7). 5. Dai M., Wei W., Shen Y. X., Zheng Y. Q Glucosides of Chaenomeles speciosa remit rat adjuvant arthritis by inhibiting synoviocyte activities. Acta Pharmacologica Sinica, 24: Du H., Wu J., Li H., Zhong P. X., Xu Y. J., Li C. H., Kui-Xian Ji K. X., Wang L. C Polyphenols and triterpenes from Chaenomeles fruits: Chemical analysis and antioxidant activities assessment. Food Chemistry, 141: Essawi T., Srour M Screening of some Palestinian medicinal plants for antibacterial activity. Journal of Ethnopharmacology, 70:

51 8. Fattouch S., Caboni P., Coronea V., Tuberoso C. I. G., Angioni A., Dessi S., Marzouki N., Cabras P Antimicrobial activity of Tunisan quince (Cydonia oblonga Mill.) pulp and peel polyphenolic extracts. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55: Kawecki Z., Lojko R., Pilerek B Mniej znane rośliny sadownicze i warzywnicze w ziołolecznictwie domowym. Olsztyn, Lesinska E Characteristics of East Asian Quince Fruits Chemical Composition and Estimation of Their Technological Usability for Fruit and Vegetable Processing: doctoral thesis. Zeszyty Naukowe Akademii Rolniczej Im. Hugona Kollataja W Krakow, 100: (in Polish). 11. Magalhćes A., Silva B., Pereira J., Paula B., Andrade P., Valentćo P., Carvalho M Protective effect of quince (Cydonia oblonga Miller) fruit against oxidative hemolysis of human erythrocytes. Food and Chemical Toxicology, 47: McGuiere R. G Reporting of objective color measurements. HortScience, 27(12): Rop O., Balik J., Řezniček V., Jurikova T., Škardova P., Salaš P., Sochor J., Mlček J., Kramařova D Chemical characteristics of fruits of some selected quince (Cydonia oblonga Mill.) cultivars. Czech Journal of Food Sciences, 29: Ros J. M., Laencina J., Hellı n P., Jordán M. J., Vila R., Rumpunen K Characterization of juice in fruits of different Chaenomeles species LWT. Food Science and Technology, 37(3): Ruisa S Studies on Japanese quince (Chaenomeles japonica) in Latvia. In: Rpt , Balsgård-Dept. Hort. Plant Breeding, Swedish Univ. Agr. Sci., Rumpunen K Chaenomeles: Potential new fruit crop for Northern Europe. In: J. Janick and A. Whipkey (eds.), Trends in new crops and new uses. ASHS Press, Alexandria, VA Rumpunen K., Kviklys D Combining ability and patterns of inheritance for plant and fruit traits in Japanese quince (Chaenomeles japonica). In: K. Rumpunen (eds.), Diversity in the plant genus Chaenomeles. Acta Agr. Sueciae, Agraria, Rumpunen K Pros and cons of Japanese quince (Chaenomeles japonica) an underutilized pome fruit. Acta Horticulture, 918: Slinkard K., Singleton V. L Total phenol analysis: Automation and comparison with manual methods. Amer. J. Enol. Vitic., 28: Thomas M., Guillemin F., Guillon F., Thibault J. F Pectins in the fruits of Japanese quince (Chaenomeles japonica). Carbohydrate Polymers, 53(4): Xianfei X., Xiaoqiang C., Shunying Z., Guolin Z Chemical composition and antimicrobial activity of essential oils of Chaenomeles speciosa from China. Food Chemistry, 100: Кибкало В Ягоды пяти вкусов. Харьков,

52 SODININKYSTĖ IR DARŽININKYSTĖ. MOKSLO DARBAI (1 2). Japoninio svarainio (Chaenomeles japonica) vaisių, jų sirupų ir cukatų biocheminė sudėtis ir antioksidacinis aktyvumas M. Rubinskienė, P. Viškelis, J. Viškelis, R. Bobinaitė, M. Shalkevich, M. Pigul, D. Urbonavičienė Santrauka Tyrimo tikslas buvo įvertinti japoninio svarainio vaisių ir jų produktų biocheminę sudėtį ir antioksidacinį aktyvumą. Tirti švieži svarainių vaisiai ir jų produktai (sirupas ir vaisių skiltelių cukatos). Vaisiuose, liofilizuotose cukatose ir sirupuose buvo nustatytas tirpių sausųjų medžiagų, askorbo rūgšties ir bendras fenolinių junginių kiekis. Bandinių antioksidacinis aktyvumas buvo nustatytas taikant DPPH radikalų sujungimo metodą. Japoninių svarainių vaisių ir jų produktų spalvos rodikliai buvo matuojami spektrofotometru. Japoninių svarainių vaisiai sukaupė didelį kiekį askorbo rūgšties 55 mg 100 g -1 (selekcinis numeris C.47) ir 106 mg 100 g -1 ( Lichtar veislė). Daugiau fenolinių junginių (422,6 mg 100 g -1 ) ir stipresnę antioksidacinę gebą (12,35 µmol TE/g) turėjo Lichtar veislės svarainių vaisiai. Iš selekcinio numerio C.47 vaisių pagamintame cukraus sirupe buvo daugiau askorbo rūgšties (56,4 mg 100 g sirupo). Organinių rūgščių sirupuose nustatyta atitinkamai 3,09 ir 3,18 %. Šimte gramų liofilizuotų skiltelių cukatų aptikta 116 ir 124 mg askorbo rūgšties. Didesni askorbo rūgšties kiekiai išliko Lichtar veislės liofilizuotų vaisių skiltelėse. Selekcinio numerio C.47 vaisių cukatų skiltelėse buvo daugiau fenolinių junginių (917 mg 100 g -1 ), jų antioksidacinė geba buvo stipresnė 30,89 mmol TE g -1. Iš spalvos rodiklių labiausiai skyrėsi svarainių vaisių ir jų produktų koordinatės a* vertė ir spalvos tonas h. Iš svarainio produktų sirupas išsiskyrė didesniu šviesumo (L *) rodikliu. Reikšminiai žodžiai: cheminė sudėtis, japoninis svarainis, produktai, vaisiai. 52

53 LIETUVOS AGRARINIŲ IR MIŠKŲ MOKSLŲ CENTRO FILIALO SODININKYSTĖS IR DARŽININKYSTĖS INSTITUTO IR ALEKSANDRO STULGINSKIO UNIVERSITETO MOKSLO DARBAI. SODININKYSTĖ IR DARŽININKYSTĖ (1 2). Botaninių ir homeopatinių ekstraktų įtaka saldžiosios paprikos (Capsicum annuum L.) vaisių kokybei Rasa Karklelienė, Audrius Radzevičius, Eugenijus Dambrauskas, Nijolė Maročkienė, Danguolė Juškevičienė, Edita Dambrauskienė, Pranas Viškelis Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialas Sodininkystės ir daržininkystės institutas, Kauno g. 30, LT Babtai, Kauno r., el. paštas Bandymai atlikti metais Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filiale Sodininkystės ir daržininkystės institute. Kaip tyrimo objektas buvo pasirinktos saldžiosios paprikos veislės: Reda ir Alanta. Augalai buvo purkšti botaninių ekstraktų (Zytron ir Funres 4 kartus) bei homeopatinių ekstraktų: Silicea (pradiniame etape 2 kartus) ir Carbo vegetabilis (augalų vegetacijos viduryje 2 kartus), skirtingos koncentracijos tirpalais kas 10 dienų. Nustatyta jų įtaka saldžiosios paprikos vaisių derliui ir biocheminei sudėčiai. Gauti rezultatai parodė, kad didžiausią derlių (7,1 7,2 kg m -2 ) išaugino paprikos augalai, purkšti Funres botaniniu ekstraktu. Nustatyta, kad paprikos vaisiai kaupia vidutiniškai 6,9 9,8 % tirpių sausųjų medžiagų. Daugiausia askorbo rūgšties kaupė Alantos veislės paprikos, purkštos 4 kartus botaniniais ekstraktais: Funres ir Zytron ( ,5 mg 100 g -1 ). Reikšminiai žodžiai: derlius, ekstraktai, kokybė, paprika. Įvadas. Saldžiųjų paprikų Lietuvoje vartojama kasmet vis daugiau, plečiami jų auginimo plotai. Rinka kelia vis didesnius reikalavimus vaisių kokybei (Maročkienė, 2006). Lietuvoje yra sukurtos dvi saldžiųjų paprikų veislės: Reda ir Alanta (Maročkienė, 2002; Maročkienė ir kt., 2009; Karklelienė ir kt., 2013). Šiandien žmonės labiau domisi aplinkos apsaugos problemomis, kurias sukelia žemės ūkio veikla, todėl ypač daug dėmesio skiriama sveikatos apsaugai nuo pavojų, kylančių dėl įvairių cheminių priemonių naudojimo. Svarbu parinkti tinkamas auginimo technologijas (Buczkowska, Michałojć, 2012). Paprikos vaisiai kaupia daug cukrų, organinių rūgščių, baltymų, riebalų, mineralinių medžiagų, karotinoidų ir kt. (Maročkienė, 2006). Vaisinių daržovių derlius ir kokybė priklauso nuo auginimo sąlygų, veislių atsparumo, auginimo technologinių priemonių ir kt. (Dorais ir kt., 2001; Survilienė, Duchovskienė, 2008). Auginant vaisines daržoves Lietuvos klimato sąlygomis, jos dažniau serga įvairiomis ligomis, todėl prarandama didelė dalis derliaus. Pomidorų ir paprikos auginimas tampa nerentabilus, todėl atliekami tyrimai, kaip pagerinti derlių ir vaisių kokybę naudojant augalinius ekstraktus. Panaudojus įvairius ekstrak- 53

54 tus gali kisti fotosintezės procesai augale ir vykti kiti pokyčiai (Sakalauskienė ir kt., 2012). Gerai žinoma, kad fotosintezės procesų veiksmingumas augaluose priklauso nuo optimalių šilumos sąlygų, tačiau trūksta žinių apie fotosintezės biocheminių procesų pakitimus panaudojus botaninius ir homeopatinius ekstraktus. Homeopatinės priemonės, veikdamos simptomų visumą, gydo organizmą. Toks gydymo būdas padeda pačiam organizmui pasveikti. Homeopatija yra perspektyvi alternatyva cheminių medžiagų naudojimui, nes medžiagos netoksiškos ir neteršia aplinkos (Kaviraj, 2006). Darbo tikslas įvertinti LAMMC filiale Sodininkystės ir daržininkystės institute sukurtų saldžiosios paprikos veislių vaisių kokybę ir derlių panaudojus botaninius ir homeopatinius ekstraktus. Tyrimų objektas, metodai ir sąlygos m. LAMMC filiale Sodininkystės ir daržininkystės institute atlikti saldžiosios paprikos tyrimai panaudojant botaninių ekstraktų (Zytron ir Funres 4 kartus) bei homeopatinių ekstraktų: Silicea (pradiniame etape 2 kartus) ir Carbo vegetabilis (augalų vegetacijos viduryje 2 kartus), skirtingos koncentracijos tirpalus (skiedimo lygis: Si6 + CV6; Si30 + CV30; Si200 + CV30) augalams nuo ligų ir kenkėjų apsaugoti. Zytron augalinės kilmės augalų biostimuliatorius, pagamintas iš citrusinių augalų sėklų (20 % v. m.) ekstrakto. Funres augalinės kilmės augalų biostimuliatorius, pagamintas iš Mimosa tenuiflora (60 % v. m.) ir citrusinių augalų sėklų (20 % v. m.). Silicea mineralinės kilmės homeopatinis vaistas, pagamintas iš Acidum Silicicum (silicio rūgšties, H 2 SiO 3 ). Carbo vegetabilis organinės kilmės homeopatinis vaistas, pagamintas iš beržo medienos anglies. Augalai purkšti po 4 kartus kas 10 dienų (pirmą kartą purkšta praėjus 15 d. po pasodinimo). Tirtos dvi saldžiosios paprikos (Capsicum annuum L.) veislės: Alanta ir Reda. Alanta (autorė N. Maročkienė) saldžiosios paprikos vidutinio ankstyvumo veislė, skirta auginti šiltnamiuose. Augalai 0,75 0,80 m aukščio. Vaisiai cilindro formos, stamboki, sultingi, švelnaus skonio, augantys žali, sunokę oranžiniai. Vidutinis vaisiaus ilgis 9,0 10,0 cm, skersmuo 8,0 9,0 cm, vaisiaus masė 220,0 250,0 gramų. Reda (autorės N. Maročkienė, M. Baranauskienė) vidutinio ankstyvumo veislė. Augalai vidutiniškai 79,0 cm aukščio, formuoja dvi tris pagrindines šakas. Vaisiai nupjauto cilindro formos, patrauklūs, sunokę ryškiai raudoni, vidutiniškai 10,1 cm ilgio, 6,9 cm skersmens, 185,0 g masės, geros biocheminės sudėties. Saldžioji paprika auginta pagal institute priimtą integruotą augalų auginimo technologiją polietileno dvišlaičiuose nešildomuose šiltnamiuose (Jankauskienė, Survilienė, 2003) m. daigai pasodinti birželio 5 d., o 2013 m. birželio 6 dieną. Paprikos augalai į nuolatinę augimo vietą pasodinti 0,3 0,7 m atstumais. Derliaus apskaitomojo laukelio plotas 2,1 m 2. Bandymas kartotas tris kartus. Vegetacijos metu svertas vaisių derlius, atlikti biocheminiai tyrimai. Tirpių sausųjų medžiagų kiekis matuotas refraktometru (LST ISO 2173: 1996), cukrų kiekis daržovėse nustatytas Bertrano metodu (AOAC, 1990), askorbo rūgšties (vitamino C) kiekis titruojant indikatoriumi 2,6-dichlorfenolindofenolio natrio druskos tirpalu (LST ISO : 2000). Rezultatai matematiškai apdoroti Microsoft Excel programa (Tarakanovas, Raudonius, 2003). Duomenų patikimumui įvertinti naudota statistinė programa Anova. M e t e o r o l o g i n ė s s ą l y g o s m. birželio mėnesio vidutinė oro temperatūra buvo 1,3 C žemesnė, o 2013 m. 2,1 C aukštesnė nei daugiametis vidurkis, 54

55 todėl 2013 m. paprikos daigai buvo stipresni ir suformavo daugiau vaisinių žiedynų. Kritulių kiekis augalams didelės reikšmės neturėjo. Liepos rugsėjo mėnesiais oro temperatūra buvo panaši ir vaisių formavimasis bei nokimas šiais mėnesiais beveik nesiskyrė. 1 lentelė. Meteorologinės sąlygos augalų vegetacijos metu metais (pagal imetos prognozavimo sistemos duomenis) Table 1. Meteorological conditions during plant vegetation, Mėnuo Month Birželis June Liepa July Rugpjūtis August Rugsėjis September Oro temperature Air temperature, C Krituliai Precipitation, mm daugiametis vidurkis daugiametis vidurkis 2012 m m m m. multiannual average multiannual average 14,6 18,0 15,9 99,6 35,8 71,2 18,7 18,3 17,3 135,4 63,6 75,3 16,4 17,8 16,4 81,0 76,2 75,8 13,1 11,9 12,0 59,8 86,0 30,0 Rezultatai ir jų aptarimas. Įvertinus dvejų metų paprikos vaisių suminį derlių visuose variantuose, nustatyta, kad šiek tiek derlingesnė yra Alantos veislė. Jos augalai išaugino vidutiniškai 6,4 7,2 kg m -2 suminį derlių, o Redos veislės augalai 5,6 7,1 kg m -2. Tą patvirtina ir ankstesni tyrimų rezultatai: m. vidutiniais duomenimis, saldžiosios paprikos Alantos veislės augalai išaugino 8,47 kg m -2 derlių (Maročkienė ir kt., 2009). Buvo pastebėtas botaninio ekstrakto Funres poveikis paprikos augalų derlingumui. Įvertinus rezultatus, nustatytas abiejų veislių augalų suminio derliaus padidėjimas (7,1 7,2 kg m -2 ). Augalus nupurškus Zytron botaniniu ekstraktu, visų veislių derlius sumažėjo, palyginti su kontroliniu variantu (1 pav.). Saldžiosios paprikos biocheminę sudėtį lemia veislė, vaisių spalva ir auginimo sąlygos. Šios daržovės vertinamos kaip vitaminų, karotino ir mineralinių medžiagų šaltinis (Dobrzańska J., Dobrzański A., 2001; Maročkienė ir kt., 2009). Atlikti tyrimai pasaulyje ir Lietuvoje rodo, kad saldžiosios paprikos vaisiai kaupia daug askorbo rūgšties mg 100 g -1 (Wojdyla ir kt., 2009; Maročkienė ir kt., 2009). Palyginę mūsų tyrimų visų variantų rezultatus, pastebėjome, kad Alantos veislės vaisiuose askorbo rūgšties kiekis mažiau kito negu Redos veislės vaisiuose. Daugiausia askorbo rūgšties Alantos veislės vaisiai sukaupė (181,5 mg 100 g -1 ) augalus nupurškus Zytron botaniniu ekstraktu, mažiausiai jos kaupė (164,0 mg 100 g -1 ) kontrolės vaisiai (1 pav.). Redos veislės vaisiuose askorbo rūgšties kiekis įvairavo nuo 145,0 iki 172,0 mg 100 g

56 1 pav. Saldžiosios paprikos vaisių suminio derliaus įvertinimas Fig. 1. Estimation of sweet pepper fruit total yield Babtai, m. 2 pav. Askorbo rūgšties kiekis saldžiosios paprikos (Capsicum annuum L.) vaisiuose Fig. 2. Amount of ascorbic acid of sweet pepper fruit Babtai, m. 56

57 Biocheminės sudėties tyrimai parodė, kad paprikos vaisiai kaupia vidutiniškai 7,75 8,5 % tirpių sausųjų medžiagų ir 7,27 8,47 % bendrojo cukraus (2 lentelė). 2 lentelė. Saldžiosios paprikos vaisių biocheminiai rodikliai Table 2. Biochemical indices of sweet pepper Variantas Variant Babtai, m. Tirpios sausosios medžiagos Soluble solids, % Bendras cukrus Total sugars, % veislės cultivars veislės cultivars Reda Alanta Reda Alanta 8,05 7,95 7,81 7,34 Kontrolė Control Si6 + CV6 8,10 7,85 7,37 7,24 Si30 + CV30 8,00 8,30 8,03 7,85 Si200 + CV200 7,95 8,50 8,22 8,12 Zytron 7,75 8,00 7,77 7,27 Funres 8,40 8,30 8,47 8,27 R 05 / LSD 05 0,432 0,763 0,513 1,076 Įvertinus šių dviejų rodiklių reikšmes, tarp variantų ir skirtingų veislių esminių skirtumų nenustatyta. Kitų tyrėjų duomenimis, kai kurios veislės kaupia iki 10,29 % tirpių sausųjų medžiagų tai priklauso ne tik nuo veislės genetinių savybių, bet ir nuo auginimo sąlygų (Jadczak, Grzeszczuk, 2008). Išvados. 1. Nustatyta, kad Funres botaninis ekstraktas didina, o Zytron mažina paprikos vaisių derlių. 2. Daugiausia askorbo rūgšties kaupia Alantos veislės paprikos vaisiai ( ,5 mg 100 g -1 ) augalus nupurškus Funres ir Zytron (4 k.). 3. Tirpių sausųjų medžiagų ir bendrojo cukraus abiejų veislių vaisiai kaupia nuo 7,27 iki 8,5 %. Padėka. Autoriai dėkoja Lietuvos mokslo tarybai (projekto Nr. SVE-02/2011) už finansinę pagalbą moksliniams tyrimams atlikti. Gauta Parengta spausdinti

58 Literatūra 1. AOAC Sucrose in fruits and fruit products. In: K. Helrich (eds.), Official Methods of Analysis, 15 th ed. AOAC Inc., Arlington, VA, Buczkowska H., Michałojć Z Comparison of qualitative traits, biological value, chemical compounds of sweet pepper fruit. Journal of Elementology, 17(3): Dobrzańska J., Dobrzański A Papryka pod szkłem i folia. Warszawa. 4. Dorais M., Papadopoulos M. A., Gosselin A Greenhouse tomato fruit quality. Horticultural reviews, 26: Jadczak D., Grzeszczuk M The estimation of yielding and biological value of some cultivars of sweet pepper grown in the climatic conditions of western Pomeranian region of Poland. Proceedings of the Fourth Balkan Symposium on Vegetables and Potatoes, 2: Jankauskienė J., Survilienė E Daržovių auginimas šiltnamyje. Akademija. 7. Karklelienė R., Radzevičius A., Juškevičienė D., Maročkienė N., Bobinas Č Daržo augalų selekcijos tyrimų apžvalga. Sodininkystė ir daržininkystė, 32(3 4): Kaviraj D. V Homeopathy For Farm And Garden. Mark Moodie Publications, Oaklands Park, Newnham-on-Severn, Gloucester, UK. 9. Klocke P., Baumgartner S Use of homeopathic preparations in experimental studies with healthy plants. Homeopathy, 98: LST ISO 2173:1996. Vaisių ir daržovių produktai. Tirpių sausųjų medžiagų kiekio nustatymas. Refraktometrinis metodas, LST ISO :2000. Vaisiai, daržovės ir jų gaminiai. Askorbo rūgšties kiekio nustatymas, 2 dalis. Įprastiniai metodai (tpt ISO : 1984[E]), Maročkienė N., Karklelienė R., Bobinas Č Saldžiosios paprikos veislės Alanta biologinių ūkinių savybių įvertinimas. Sodininkystė ir daržininkystė, 28(1): Maročkienė N Saldžiosios paprikos produktyvumas nešildomuose pavasariniuose šiltnamiuose. Sodininkystė ir daržininkystė, 25(1): Maročkienė N Saldžiosios paprikos veislė Reda. Sodininkystė ir daržininkystė, 21(1): Sakalauskienė S., Karklelienė R., Radzevičius A., Bobinas C., Brazaitytė A., Sakalauskaitė J., Viškelis P., Samuolienė G., Duchovskis P., Pinikienė J Effect of Ocimum basilicum L. biological preparation on tomato fruit quality grown in greenhouse. Acta horticulturae (ISHS), 952: Survilienė E., Duchovskienė L Kenksmingų organizmų tyrimų aktualijos daržininkystėje. Sodininkystė ir daržininkystė, 27(3): Tarakanovas P., Raudonius S Agronominių tyrimų duomenų statistinė analizė taikant kompiuterines programas ANOVA, STAT, SPLIT PLOT iš paketo SELEKCIJA ir IRRISTAT. Akademija. 18. Wojdyła T., Pobereżny J., Rogozińska I Changes in vitamin C content in selected fruits and vegetables supplied for sale in the autumn-winter period, EJPAU 11(2), #13. Available Online: 58

59 SODININKYSTĖ IR DARŽININKYSTĖ. SCIENTIFIC ARTICLES (1 2). Botanical and homeopatic extracts influence on fruit quality of sweet pepper (Capsicum annuum L.) R. Karklelienė, A. Radzevičius, E. Dambrauskas, N. Maročkienė, D. Juškevičienė, E. Dambrauskienė, P. Viškelis Summary Investigation was carried out at the Institute of Horticulture, Lithuanian Research Centre for Agriculture and Forestry in The objective of investigation was sweet pepper cultivars Reda and Alanta. The plants were sprayed with botanical ( Zytron and Funres four times) and homeopathic extracts Silicea (two times in early plant stage) and Carbo vegetabilis (two times at the middle of plant vegetation) of different solution concentrations every 10 days. It was established that the preparations influenced the yield and biochemical composition of sweet pepper fruit. The obtained results showed that the plants sprayed with the biological extract Funres had the highest yield ( kg m -2 ). It was established that the average amout of soluble solids in the sweet pepper fruit reached % respectively. The highest amount of ascorbic acid ( mg 100 g -1 ) was detected in the fuit of cultivar Alanta, which had been sprayed four times with the botanical extracts Zytron and Funres. Key words: extracts, yield, quality, sweet pepper. 59

60

61 LIETUVOS AGRARINIŲ IR MIŠKŲ MOKSLŲ CENTRO FILIALO SODININKYSTĖS IR DARŽININKYSTĖS INSTITUTO IR ALEKSANDRO STULGINSKIO UNIVERSITETO MOKSLO DARBAI. SODININKYSTĖ IR DARŽININKYSTĖ (1 2). Šviesą emituojančių diodų ir aukšto slėgio natrio lempų poveikis agurkų daigams auginant skirtinguose substratuose Aistė Bagdonavičienė 1, Julė Jankauskienė 1, Aušra Brazaitytė 1, Pavelas Duchovskis 1, Algirdas Novičkovas 2, Laurynas Dabašinskas 2 1 Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialas Sodininkystės ir daržininkystės institutas, Kauno g. 30, LT Babtai, Kauno r., el. paštas a.kasiuleviciute@lsdi.lt 2 VU Medžiagotyros ir taikomųjų mokslų institutas (MTMI), Saulėtekio al. 9 III, Vilnius Tyrimo objektas agurkų hibridas Mandy F 1. Bandymui atlikti naudoti skirtingi substratai: durpių substratas ir vermikulito ir durpių substratas (santykis 3 : 2), Taip pat tyrimams naudotos lempos, sudarytos iš raudonos 665 nm ir mėlynos 451 nm bangos ilgių šviesą emituojančių diodų (LED). Mėlynos sudedamosios dalies fotonų srauto tankio dalis buvo 9 proc. nuo bendro 200 µmol cm -2 s -1 lempos fotonų srauto tankio. Kontroliniai augalai auginti po aukšto slėgio natrio lempomis (HPS). Tyrimo metu buvo palaikomas 16 val. fotoperiodas, 22/18 ± 2 C dienos/nakties temperatūra ir proc. santykinė oro drėgmės. Nustatyta, kad agurkų daigai, augę po raudonos ir mėlynos spektro dalies šviesą emituojančiais diodais vermikulito ir durpių substrate, buvo žemesni, suformavo mažiau lapų, jų lapų plotas, žalia ir sausa masė buvo mažesni, nustatytas mažesnis chlorofilo a ir b santykis. Tačiau šiame substrate augę daigai, palyginti su augusiais po aukšto slėgio natrio lempomis, vystėsi sparčiau. Tyrimo pabaigoje šių agurkų žiedynas pasiekė VIII organogenezės etapą. HPS lempų šviesa lėtino agurkų daigų vystymąsi, auginant skirtinguose substratuose žiedynas pasiekė tik VI VII organogenezės etapą. Apibendrinant gautus rezultatus galima teigti, kad puslaidininkiniai šviesos šaltiniai, vermikulito ir durpių substratas spartina agurkų daigų vystymą, daigai užauga neištįsę, kompaktiški ir kokybiški. Reikšminiai žodžiai: agurkai, daigai, durpės, fotosintezės pigmentai, LED, mėlyna ir raudona šviesa, sausa masė, vermikulitas, žalia masė. Įvadas. Visame pasaulyje durpių, kaip pagrindinių substrato sudedamųjų dalių, paklausa didėja, o pasiūla mažėja (Lohr ir kt., 1984). Nuo 1960 metų daržovėms auginti įvairiuose vegetaciniuose induose pradėti naudoti skirtingi substratai (Nelson, 2003). Augalui augant substrate atsiradę oro ir vandens santykio pokyčiai per ilgą 61

62 laiką gali turėti didelį poveikį augalų augimui ir vystymuisi (Bilderback ir kt., 2005). Organinio substrato sudedamųjų dalių skilimo likučiai gali turėti įtakos vandens kaupimuisi ir tokiu būdu mažinti aeraciją. Auginimo terpė gali būti ir mineralinės kilmės, be durpių, augalams daiginti galima naudoti ir vermikulitą (Vaughn ir kt., 2011), kuris nesuyra. Organinio ir mineralinio substratų mišinys gali sumažinti fizikinius pokyčius ir užtikrinti geras fizikines savybes, išlaikyti poringumą ir struktūrinį vientisumą (Bilderback ir kt., 2005). Vermikulitas yra nebrangus mineralas, labai stabilus kintant pramonės ir aplinkos sąlygoms (Drelich ir kt., 2011). Vermikulito įtaka ir naudojimo įvairiems augalams daiginti ir auginti būdai tiriami visuose žemynuose (Olle ir kt., 2012). Naujų mokslinių tyrimų rezultatai rodo, kad vermikulitas, padengtas vario nanodalelėmis, yra nauja antibakterinė medžiaga. Atsiranda naujų galimybių tirti vermikulito panaudojimą įvairiose srityse (Drelich ir kt., 2011). Kitas svarbus aplinkos veiksnys (be substrato), kuris reguliuoja įvairius augalų augimo ir vystymosi procesus, yra šviesa (Lau, Deng, 2010). Tai vienintelis natūralus energijos šaltinis fotosintezei vykti, be to, įvairūs šviesos fizikiniai parametrai augalus veikia kaip informacijos šaltiniai, lemiantys augalų augimo ir vystymosi kryptingumą (Urbonavičiūtė ir kt., 2008; Olle, Viršile, 2013; Duchovskis ir kt., 2013). Visos šviesos spektro dalys yra svarbios augalų gyvenime (Franklin, 2004). Tinkamai parinkus dirbtinio apšvietimo spektrą, užtikrinamas normalus augalų augimas. Keičiant šviesos spektrą, galima paveikti augimo ir vystymosi procesų pusiausvyrą, biomasės kaupimąsi, stiebo ilgėjimą. Todėl kuriant pažangias daržovių daigų auginimo technologijas, reikia žinoti, koks gali būti augalų fotoatsakas (Urbonavičiūtė ir kt., 2008; Olle, Viršile, 2013; Duchovskis ir kt., 2013). Raudona ir mėlyna šviesa yra pagrindinės šviesos spektro sudedamosios dalys, tinkamiausios agurkų, pomidorų ir paprikos daigams auginti. Raudona šviesa svarbi fotomorfogenezės procesams augaluose vykti ir skatina augimą bei vystymąsi, o mėlyna šviesa skatina chlorofilų sintezę, mažina augalų tįsimą ir didina sausųjų medžiagų kiekį antžeminėje dalyje (Olle, Viršile, 2013). Tiriant naujas technologijas ieškoma būdų, kaip šviesa valdyti augalų fotofiziologinius procesus ir nukreipti juos ūkiui naudinga linkme (Brazaitytė ir kt., 2009; Brazaitytė ir kt., 2010; Sirtautas ir kt., 2014). Šiuo tyrimu siekiama įtraukti raudoną ir mėlyną šviesas į esamas agurkų daigų auginimo technologijas, augalus auginant skirtinguose substratuose. Darbo tikslas palyginti puslaidininkinių lempų, sudarytų iš raudonų ir mėlynų šviesą emituojančių diodų, ir aukšto slėgio natrio lempų poveikį agurkų daigams, auginamiems skirtinguose substratuose. Tyrimo vieta, metodai ir sąlygos. Tyrimai atlikti Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro (LAMMC) filialo Sodininkystės ir daržininkystės instituto Augalų fiziologijos laboratorijos fitotrono komplekse su agurkų (Cucumis sativus) hibridu Mandy F 1. Tirti skirtingi substratai: durpių substratas; vermikulito ir durpių substratas (santykis 3 : 2). Agurkų daigai auginti puodeliuose (talpose), pripildytuose paruošto substrato (ph 6 6,5). Iki sudygimo buvo palaikoma 23/19 ± 2 C dienos/ nakties temperatūra, fotoperiodas 16 valandų. Agurkams sudygus, dienos/nakties temperatūra buvo 22/18 ± 2 C, fotoperiodas 16 valandų. Tyrimams naudotos lempos, sudarytos iš raudonos 665 nm ir mėlynos 451 nm bangos ilgių puslaidininkinių šviesos diodų (LED), sukonstruotos ir pagamintos 62

63 Vilniaus universiteto Taikomųjų mokslų institute. Lempą sudaro radiatorius ir nuo drėgmės poveikio apsaugotas elektrinis modulis su 22 vnt. raudonos (spektro smailės bangos ilgis λ = 665 nm; Luxeon Rebel LXM3-PD , Philips Lumileds Lighting Company, JAV) ir 2 vnt. mėlynos (spektro smailės bangos ilgis λ = 451 nm; Luxeon Rebel LXML-PR , Philips Lumileds Lighting Company, JAV) spinduliuotės šviesos diodais (Samuoliene ir kt., 2011). Mėlynos spektro sudedamosios dalies fotonų srauto tankio dalis yra 9 proc. nuo bendro ~200 µmol cm -2 s -1 lempos fotonų srauto tankio. Kontroliniai augalai auginti po aukšto slėgio natrio lempomis (HPS), kurių fotonų srauto tankis ~200 µmol cm -2 s -1 (SON-T Agro, Philips, JAV). Matuotas daigų poskilčio aukštis (cm), poskilčio skersmuo (cm), visas augalo aukštis (cm). Sausosios medžiagos nustatytos išdžiovinus antžeminę (spintos modelis) dalį 105 ± 2 C temperatūroje iki nekintamos masės (g), džiovinta 24 valandas. Augalo lapo asimiliacinis plotas (cm 2 ) matuotas naudojant lapų ploto matuoklį WinDias (Delta-T Devices Ltd, UK). Chlorofilų a, b ir karotinoidų kiekis augalų lapuose nustatytas spektrofotometriniu metodu 100 proc. acetono ekstrakte pagal Wetshein (Гавриленко, 1957), naudojant spektrofotometrą Genesys (ThermoSpectronic, JAV). Augalo organogenezės etapas nustatytas pagal F. Kuperman (Kyперман, Ржанова, 1985). Biometriniams rodikliams įvertinti iš biologinių pakartojimų buvo imama po dešimt augalų (n = 10). Chlorifolų ir karotinoidų kiekiui nustatyti buvo daroma po tris analitinius matavimus (n = 3). Statistinei analizei atlikti apskaičiuoti vidurkiai. Naudojant statistinę programą STATISTICA 7 apskaičiuoti standartiniai nuokrypiai nuo vidurkio esant 95 ir 99 proc. tikimybės lygiui. Rezultatai. Nustatyta, kad vien tik durpių substrate po LED lempomis augusių agurkų daigų poskilčių aukštis buvo du kartus mažesnis nei augalų, kurie augo po aukšto slėgio natrio lempomis (HPS) (1 pav.). 1 pav. Agurkų daigų poskilčio aukštis Fig. 1. Hypocotyl length of cucumber, cm 2 pav. Agurkų daigų poskilčio skersmuo Fig. 2. Hypocotyl diameter of cucumber, cm 63

64 Vermikulito ir durpių substratas teigiamai veikė daigų poskilčio aukštį švitinant augalus šviesą emituojančiais diodais: jis buvo tris kartus iš esmės mažesnis negu daigų, augusių po aukšto slėgio natrio lempomis skirtinguose substratuose (1 lentelė). Agurkų daigų poskilčio skersmeniui skirtingas apšvietimas neturėjo esminės įtakos (1 lentelė). Auginant daigus po HPS lempomis, iš esmės mažesnis poskilčio skersmuo buvo tų daigų, kurie augo vermikulito ir durpių substrate (2 pav.). 3 pav. Agurkų daigų aukštis Fig. 3. Height of cucumber transplants, cm Po HPS lempomis durpių substrate augę agurkų daigai buvo ištįsę, o daigai, augę vermikulito ir durpių substrate, buvo daugiau nei perpus žemesnis (3 pav.). LED lempos iš esmės lėtino agurkų daigų, augintų vermikulito ir durpių substrate, tįsimą (3 pav.; 1 lentelė). 4 pav. Agurkų daigų lapų skaičius, vnt. Fig. 4. Leaf number of cucumber (units) 5 pav. Agurkų daigų lapų plotas Fig. 5. Leaf area of cucumber, cm 2 64

65 6 pav. Agurkų daigų žalia masė Fig. 6. Fresh weight of cucumber, g 7 pav. Agurkų daigų sausa masė Fig. 7. Dry weight of cucumber, g 8 pav. Agurkų daigų šaknų žalia masė Fig. 8. Root fresh weight of cucumber, g 9 pav. Agurkų daigų šaknų sausa masė Fig. 9. Root dry weight of cucumber, g Tyrimo metu nustatyta, kad daigai, augę po raudonos ir 9 proc. mėlynos spektro dalies šviesą emituojančiais diodais (LED) vermikulito ir durpių substrate, suformavo iš esmės mažiau lapų, jų lapų plotas buvo iš esmės daugiau kaip du kartus mažesnis nei daigų, augusių tik durpių substrate (4, 5 pav.; 1 lentelė. Tyrimas parodė, kad po HPS lempomis vermikulito ir durpių substrate augę agurkų daigai užaugino iš esmės mažiau žalios ir sausos masės (6, 7 pav.; 1 lentelė) nei durpių substrate augę daigai (6, 7 pav.). Nustatyta, kad skirtingas apšvietimas neturėjo esminės įtakos agurkų daigų žaliai ir sausai masei, auginant augalus durpių substrate. 65

66 1 lentelė. Fiziologinių rodiklių ir tiriamo poveikio patikimumo lygmuo Table 1. Significance of physiological indices and interactions based on analysis of treatments Fiziologiniai rodikliai Physiological indices Variantas Treatments D DV S LED D S D LED DV S DV LED ns ** ns ** ns ** Poskilčio aukštis Hypocotyl length Poskilčio skersmuo * ns ns ns ** ns Hypocotyl diameter Agurkų daigų aukštis ** ns ** * ** ** Height of cucumber transplants Lapų skaičius ** ns ** ns ** ** Leaf number Lapų plotas ** ns * ns ** ** Leaf area Žalia masė ** ** ns ns ** * Fresh weight Sausa masė ** ns ns ns ** ns Dry weight Šaknų žalia masė ns * ns ns ns ns Root fresh weight Šaknų sausa masė ns ns ns ns ns ns Root dry weight Chlorofilo a ir b kiekis ns ns ns ns ns ns Chlorophyll a and b content Karotinoidų kiekis * ** ns ** ns ** Carotenoid content Chlorofilo a ir b santykis ns ns ns ns ns ns Chlorophyll a and b ratio D durpės; DV durpės ir vermikulitas (3 : 2); S HPS; LED 665 nm nm. D Peat; DV Peat + Vermiculite (3 : 2); S HPS; LED 665 nm nm. * patikimumas iki P 0,05, **patikimumas P 0,01; ns nepatikima. * significant at P 0.05, **significant at P 0.01; ns non-significant. Po LED lempomis augę agurkų daigai šaknyse sukaupė iš esmės daugiau žalios masės nei augę po HPS lempomis, tačiau sausųjų medžiagų kaupimuisi skirtingas apšvietimas neturėjo esminės įtakos (8, 9 pav.; 1 lentelė). Agurkų daigų šaknų žalios ir sausos masės kaupimuisi skirtingas substratas esminės įtakos neturėjo (8, 9 pav.; 1 lentelė). Nustatyta, kad aukšto slėgio natrio lempų šviesa turėjo teigiamos įtakos fotosintezės pigmentų kiekiui agurkų daigų lapuose. Po LED lempomis vien tik durpių substrate augę agurkų daigai sukaupė mažiau fotosintezės pigmentų nei augalai, augę po aukšto slėgio natrio lempomis (10, 11 pav.). Vermikulito ir durpių substratas, švitinant augalus šviesą emituojančiais diodais, teigiamai veikė chlorofilo a ir b kaupimąsi, tačiau esminių skirtumų nenustatyta (1 lentelė). 66

67 10 pav. Chlorofilo a ir b kiekis agurkų daigų lapuose Fig. 10. Chlorophyll a and b content in leaves of cucumber transplants, mg g pav. Karotinoidų kiekis agurkų daigų lapuose Fig. 11. Carotenoid content in leaves of cucumber transplants, mg g pav. Chlorofilo a ir b santykis agurkų lapuose Fig. 12. Chlorophyll a and b ratio cucumber transplants Šviesą emituojantys diodai (LED) neigiamai veikė karotinoidų kaupimąsi agurkų daiguose. Karotinoidų kiekis agurkų daigų, augusių po šviesą emituojančiais diodais, lapuose buvo iš esmės mažesnis negu daigų, augusių po aukšto slėgio natrio lempomis, lapuose, auginant skirtinguose substratuose. Chlorofilo a ir b santykio agurkų daigų lapuose skirtumai, veikiant daigus skirtinga šviesa ir auginant skirtinguose substratuose, buvo neesminiai (12 pav.; 1 lentelė). 67