REGULACIJA ULTRASENZITIVNOSTI LINEARNO SKLOPLJENIH PROTEINSKIH KASKAD

Transcription

1 REGULACIJA ULTRASENZITIVNOSTI LINEARNO SKLOPLJENIH PROTEINSKIH KASKAD Seminar iz fizike na dvopredmetnem študijskem programu Fizika (stari program) Aleš Vunjak Mentor: asist. dr. Rene Markovič Maribor, 2016

2 VUNJAK, A.: Regulacija ultrasenzitivnosti linearno porazdeljenih proteinskih kaskad Seminar iz fizike, Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za fiziko, Povzetek: V seminarju je obravnavana ultrasenzitivnost mitogensko aktiviranih proteinskih kaskad. Podrobneje bodo predstavljeni mehanizmi, ki vplivajo na senzitivnost odzivanja sistema na določeno zunanjo stimulacijo. Nazadnje vpeljemo še pozitivno povratno zanko in proučujemo vhodno izhodno karakteristiko tristopenjske proteinske kaskade. Ključne besede: mitogensko aktivirana proteinska kaskada, ultrasenzitivnost, Hillov koeficient, bistabilnost, pozitivna povratna zanka. Abstract: In the seminar we investigate ultrasensitivity of the mitogen activated protein cascades. We study which features of the system affect its sensitivity to some external stimulation. Finally, we introduce a positive feedback loop and study the input-output characteristic of a three tiered cascade. Keywords: mitogen activated protein kinase, ultrasensitivity, Hill coefficient, bistability, positive feedback loop. i

3 Kazalo 1 Uvod Matematični model Ultrasenzitivnost Hillov koeficient N stopenjske kaskade Regulacija ultrasenzitivnosti s pozitivno povratno zanko Zaključek... 9 ii

4 1 Uvod Signalizacija v bioloških sistemih poteka na različnih velikostnih redih in preko različnih mehanizmov. Omogoča preživetje živih bitij ter skrbi za njihovo prilagojenost znotraj habitata [1]. Osnovni člen te kompleksne signalizacijske verige je celica. Njena avtonomnost je omogočena s celično membrano. Celična membrana je neprepustna za večino kemikalij in je opremljena z receptorji, ki delujejo kot senzorji. Senzorji nenehno spremljajo okolico celice in v kolikor zaznajo kakšno spremembo, se informacija preko receptorjev na celični membrani prenese v znotrajcelični prostor [2, 3]. Zaradi tega se v celici sprožajo receptorsko specifične znotrajcelične signalne poti [4]. Tako se raznoliki znotrajcelični signali procesirajo na nizu linearno sklopljenih mitogensko aktiviranih proteinskih kinazah, na t.i. proteinski kaskadi [5]. Običajno so kaskade sestavljene iz treh nizov proteinskih kinaz. Njihova osnovna struktura je v veliki večini evkariotnih celic primerljiva. Kljub veliki podobnosti lahko zaradi razlik v funkcionalnosti povratnih zank proizvedejo veliko množico raznolikih bioloških odzivov [6]. Ena od lastnosti znotrajcelične signalne poti, ki je tema številnih raziskav, je njihova bistabilnost in ultrasenzitivnost. Sama bistabilnost daje mehanizmu lastnosti stikala. Občutljivost stikala, da preide iz neaktivnega v aktivno stanje, je povezana s stopnjo ultrasenzitivnosti kaskade. V seminarju se bomo podrobneje posvetili vlogi pozitivne povratne zanke na odzivne lastnosti kaskade. Proučili bomo njen vpliv na ultrasenzitivnost ter na s to lastnostjo povezano bistabilnost proteinskih kaskad. V nadaljevanju bo najprej predstavljen matematični model (poglavje 2), s katerim bomo numerično simulirali eno proteinsko kinazo. Podrobneje bo predstavljen tudi pomen posameznih parametrov na dinamične lastnosti modela. Temu sledi predstavitev pojma ultrasenzitivnosti ter njene kvantitativne mere (poglavje 3). Pokazali bomo, da je v sistemu niza linearno sklopljenih proteinskih kinaz možen ultrasenzitiven odziv le v primeru, ko imajo posamezne proteinske kinaze že same po sebi ultrasenzitiven odziv (poglavje 4). Prikazali bomo tudi vpliv Hillovega koeficienta posamezne proteinske kinaze na vhodno izhodno karakteristiko proteinske kaskade. Nazadnje bomo v kaskado dodali pozitivno povratno zanko ter pokazali, kako vpliva na ultrasenzitivnost (poglavje 5). 2 Matematični model V naših simulacijah predstavlja proteinska kinaza osnovni znotrajcelični signalizacijski gradnik. Znotraj posameznega gradnika potekata procesa fosforilacije in defosforilacije, ki skupaj določata koncentracijo aktivnih proteinskih kinaz. Koncentracija aktivnih proteinskih kinaz i-te stopnje (z i ) se s časom spreminja kot [7-9]: z i t = z n i = k on,i z H i 1 ztot,i z i k off,i z i, (1) 1

5 kjer je k on,i aktivacijska in k off,i deaktivacijska konstanta, z tot,i je skupna koncentracija aktivnih in neaktivnih kinaz. Indeks i zavzema vrednosti med 1 in N, kjer je N končno število proteinskih kinaz, ki sestavljajo proteinsko kaskado. Koeficient n H je Hillov koeficient, ki bo podrobneje obravnavan v naslednjem poglavju. Znotrajcelično signalno pot aktivira določen vhodni signal z i 1. V primeru primarne kinaze, t.j. za i = 1, predstavlja vhodni signal koncentracija (x) signalnih molekul, ki jo regulirajo receptorji na celični membrani. Zaradi aktivacije se skupna koncentracija prostih neaktivnih kinaz, ki je na začetku enaka z tot,i, prične manjšati. S tem se veča koncentracija aktivnih kinaz. Hitrost fosforilacije kinaze določa konstanta k on,i. Istočasno poteka tudi proces defosforilacije, kjer aktivne kinaze prehajajo nazaj v neaktivno stanje zi. Hitrost deaktivacije določa konstanta k off,i. Predpostavili bomo tudi, da se skupna koncentracija neaktivnih in aktivnih proteinov znotraj posamezne kinaze ne spreminja. Zato velja, da je z tot,i = z i + zi. Ker so posamezne proteinske kinaze linearno sklopljene, aktivacija i-te kinaze sproži podoben proces v sosednji kinazi. Ta aktivacijski plaz nato poteka vse do končne, N-te proteinske kinaze. Shematski prikaz delovanja sistema je prikazan v obliki pretočnega diagrama na sliki 1. Slika 1. Signalna struktura N stopenjske linearno sklopljene proteinske kaskade. Vhodni signal x je koncentracija signalnih molekul, konstante k on,1 do k on,n so aktivacijske in k off,1 do k off,n deaktivacijske konstante posameznih proteinskih kinaz. Koncentracije neaktiviranih kinaz so označene z z1 do zn in koncentracije aktiviranih kinaz z z 1 do z N. Stacionarno stanje sistema je doseženo, ko je aktivacijski tok po velikosti enak deaktivacijskemu toku. Takrat velja, da se koncentracija aktivnih proteinskih kinaz več ne spreminja s časom, zato je z i = 0. Če omenjeno upoštevamo v enačbi (1), lahko določimo koncentracijo aktiviranih proteinov (z s,i ) v stacionarnem stanju sistema ob dani koncentraciji vhodnega signala (z i 1 ): z s,i = z tot,iz i 1 z i 1 + K i, (2) kjer smo vpeljali konstanto K i, ki podaja razmerje med aktivacijsko in deaktivacijsko konstanto: K i = k off,i k on,i. (3) 2

6 Enačba (2) in enačba (3) kažeta, da je stacionarna koncentracija aktivnih proteinov odvisna tako od koncentracije signalnih molekul, kot tudi od časovnih konstant k on,i in k off,i. Indeks i bomo namerno izpustili, ker se bomo osredotočili zgolj na eno proteinsko kinazo. Da bi bolje ponazorili vpliv količin x, k on in k off na dinamiko sistema, smo s programom Berkeley Madonna numerično integrirali enačbo (1). Za vhodni signal x je bila uporabljena stopničasta funkcija, ki jo lahko zapišemo kot: x = 0 ; 0 t < t 0 x 0 ; t 0 t < t 0 + t, 0 ; t 0 + t t (4) kjer je t 0 čas, ob katerem signal x hipno naraste na vrednost x 0 in t časovni interval, v katerem je vrednost vhodnega signala enaka x 0. Vpliv časovnih konstant k on in k off na dinamiko spreminjanja koncentracije aktivnih proteinov je prikazan na sliki 2. Slika 2a prikazuje časovni odziv ene proteinske kinaze ob različnih vrednostih časovne konstante k off in konstantni vrednosti k on = 1 μms 1. Opazimo lahko, da ob prenehanju vhodnega signala manjše vrednosti parametra K izzovejo podaljšanje časa, ki je potreben za prehod kinaze iz aktivnega v neaktivno stanje. Istočasno manjšanje parametra K vodi tudi k večji koncentraciji aktivnih proteinov. To je tudi v skladu z napovedjo (glej enačbo (2)). Slika 2b prikazuje odziv ene proteinske kinaze, kjer so bile uporabljene različne vrednosti za k on ob konstantni vrednosti k off = 1 s 1. Opazimo lahko, da se čas, ki je potreben, da proteinska kinaza doseže stacionarno stanje, z večanjem konstante K v splošnem daljša. Hkrati lahko tudi v tem primeru opazimo vpliv parametra K na koncentracijo aktivnih kinaz v stacionarnem stanju. Le-ta se z večanjem parametra K zmanjšuje. Slika 2. Vpliv konstante K na dinamiko spreminjanja koncentracije (z) aktivnih kinaz v odvisnosti od časa (t) ob vklopu stopničastega vhodnega signala x 0. a) z(t) za različne vrednosti k off ob konstantni vrednosti k on = 1 μms 1. Črna črta: K = 1 μm, rdeča: K = 0,2 μm in modra: K = 0,02 μm. b) z(t) za različne k on ob konstantni vrednosti k off = 1 s 1. Modra črta: K = 0,5 μm, rdeča: K = 2 μm in črna: K = 10 μm. 3

7 Nazadnje smo opravili še numerično simulacijo, kjer na kinazo vodimo tri različno velike stopničaste vhodne signale. Razmerje med k off in k on je zmeraj enako 1 μm. Rezultati so prikazani na sliki 3. Opazimo lahko, da čas, ki je potreben, da sistem doseže stacionarno stanje, ni odvisen od velikosti vhodnega signala. Prav tako od velikosti vhodnega signala ni odvisen deaktivacijski čas. V splošnem je možno opaziti, da večji vhodni signal povzroči tudi večjo koncentracijo aktivnih kinaz v stacionarnem stanju. Slika 3. Časovni potek spreminjanja koncentracije (z) aktivnih kinaz za tri različno velike stopničaste vhodne signale x. Razmerje med k off in k on je zmeraj enako 1 μm. Črna črta: x 0 = 1 μm, rdeča: x 0 = 1,2 μm in modra: x 0 = 1,9 μm. Do sedaj smo predstavili, kako parametra k on in k off ter velikost vhodnega signala x 0 vplivajo na dinamiko ene proteinske kinaze. V nadaljevanju bomo podrobneje predstavili senzitivnost ene proteinske kinaze ter linearno sklopljenih proteinskih kinaz. Zapisali bomo matematični izraz, s katerim kvantificiramo senzitivnost in predstavili pojem ultrasenzitivnosti. 3 Ultrasenzitivnost S pojmom senzitivnosti opredeljujemo, kako občutljiv je dan sistem na zunanje vzbujanje. Običajno uporabljena mera, s katero kvantificiramo to lastnost, je Hillov koeficient [10]. Hillov koeficient odraža stopnjo kooperativnega vezanja molekul, ki je pogojena z nelinearnim procesiranjem signala [11]. Omenjena nelinearnost je v našem matematičnem modelu, ki je zapisan v enačbi (1), vključena z eksponentom n H, ki ga določimo z enačbo [10]: n H = log log 10 x 90 /x 10. (5) V enačbi (5) je x 90 vrednost vhodnega signala, pri katerem izhodni signal v stacionarnem 4

8 stanju doseže 90% vrednosti največjega možnega izhodnega signala. Z x 10 je označena vrednost vhodnega signala, pri katerem izhodni signal v stacionarnem stanju doseže 10% vrednosti največjega možnega izhodnega signala [10]. V kolikor je vrednost n H = 1, je potrebna 81-kratna porast vhodnega signala, da se koncentracija aktiviranih proteinov poveča iz 10% na 90%. V primerih, kjer je n H = 1, govorimo, da je sistem senzitiven. V primerih, kjer velja n H < 1, govorimo o nekooperativnem vezanju molekul. V primerih, kjer je n H > 1, je odziv sistema močno kooperativen in govorimo o ultrasenzitivnem odzivu. Numerično določimo n H sistema tako, da za različne konstantne vrednosti vhodnega signala x simuliramo dinamiko sistema. Pri vsaki uporabljeni vrednosti pustimo sistemu dovolj časa, da doseže stacionarno stanje, kjer velja z i 0. V teku simulacije sproti spremljamo, pri katerih vrednostih vhodnega signala je stacionarna vrednost izhodnega signala približno enaka 10% in 90% vrednosti največjega možnega odziva. Dobljene rezultate prikažemo v obliki vhodno izhodne karakteristike. Na abscisno os nanašamo vrednost vhodnega signala in na ordinatno os doseženo stacionarno vrednost odziva sistema. Primer tipične vhodno izhodne karakteristike in shematski prikaz določanja Hillovega koeficienta sta prikazana na sliki 4. Zaradi velikega razpona uporabljenih vrednosti vhodnega signala je abscisna os v logaritemskem merilu. Slika 4. Tipična vhodno izhodna karakteristika izhodnega signala ene proteinske kinaze v odvisnosti od velikosti vhodnega signala. Vodoravni črtkani črti ponazarjata 10% in 90% odziv sistema, navpični črti ponazarjata ustrezni vrednosti vhodnega signala. Graf prikazuje krivuljo za primer n H = 1. V splošnem velja, da večja kot je vrednost Hillovega koeficienta, manjša sprememba vhodnega signala je potrebna, da sistem preide iz neaktivnega v aktivno stanje. S tem postaja sistem tudi vse bolj bistabilen in hitreje preklopi iz neaktivnega v aktivno stanje. Bistabilnost sistema v okviru obravnavane tematike razumemo kot lastnost sistema, ki ima dve stabilni stanji. V prvem so vsi proteini v kinazi neaktivirani. V drugem je koncentracija aktiviranih proteinov največja možna. Sama ultrasenzitivnost kinaze ni pogojena s hitrostjo aktivacije in deaktivacije. Da bi omenjeno prikazali, smo za različne vrednosti parametra K izračunali vhodno izhodno karakteristiko. Vrednost eksponenta n H v enačbi (1) smo postavili na 1. Rezultati simulacije za tri različne vrednosti parametra K so prikazani na sliki (5a). Opazimo 5

9 lahko, da se v splošnem krivulja z večanjem parametra K premika proti levi, vendar se strmina krivulje ne spreminja. Primer vhodno izhodne karakteristike proteinske kinaze za različne vrednosti Hillovega koeficienta je prikazan na sliki 5b. Rezultati so dobljeni z numeričnim integriranjem enačbe (1), kjer smo za eksponent n H uporabili vrednosti 0,5, 1,0 in 2,0. Rezultati zelo lepo prikazujejo, da se z večanjem vrednosti eksponenta n H krči interval vrednosti x, kjer proteinska kinaza prehaja iz neaktivnega v aktivno stanje. Tako je potrebna manjša porast vhodnega signala, da sistem preide v aktivno stanje, kar se odraža v večji strmini krivulje. Slika 5. Izhodni signala (z) ene proteinske kinaze v odvisnosti od vhodnega signala (x). a) z(t) za različne vrednostih K in n H = 1. Črna črta: K = 0,1 μm, rdeča: K = 1 μm in modra: K = 10 μm. b) z(t) za različne vrednosti Hillovih koeficientov n H in K = 1 μm. Črna črta: n H = 0,5, rdeča: n H = 1,0 in modra: n H = 2. V nadaljevanju bomo predstavili dinamiko N stopenjske proteinske kaskade. Posebej se bomo posvetili vplivu kaskadnega mehanizma na senzitivnost končne kaskade za primer, ko je N = 3. 4 Hillov koeficient N stopenjske kaskade V prejšnjem poglavju smo prikazali, kako Hillov koeficient vpliva na odzivnost ene proteinske kinaze. V splošnem nastopajo kinaze v obliki niza linearno sklopljenih proteinskih kinaz, čemur pravimo proteinska kaskada. Vrednost Hillovega koeficienta proteinske kaskade je v splošnem enaka produktu Hillovih koeficientov posameznih proteinskih kinaz [12]. Tako se stopnja senzitivnosti v vsakem členu te znotrajcelične signalizacijske verige veča, v kolikor je n H,i n H,i 1 > 1. Senzitivnost se manjša, če velja n H,i n H,i 1 < 1. Da bi ponazorili to lastnost, smo za dva primera numerično izračunali vhodno izhodno karakteristiko proteinske kaskade za N = 3. V prvem primeru smo vsem proteinskim kinazam dodelili Hillov koeficient n H,i = 1,5 in v drugem primeru vrednost n H,i = 0,8. Dobljene 6

10 vhodno izhodne karakteristike so prikazane na sliki 6. V primeru, kjer so bile vrednosti Hillovih koeficientov enake 1,5 (glej sliko 6a), lahko opazimo, da se strmina krivulje z vsako naslednjo kinazo povečuje. To pomeni, da se veča tudi Hillov koeficient. Prav tako se pričetek faze naraščanja krivulje z vsako naslednjo kinazo sproža pri nižjih koncentracijah vhodnega signala. Odziv sistema postaja vse bolj podoben stikalu. V primeru, kjer so bili Hillovi koeficienti posameznih kinaz enaki 0,8 (glej sliko 6b), je možno opaziti ravno nasprotno. Strmina krivulje se z vsako naslednjo kinazo zmanjšuje. Zanimivo je, da se vsaka naslednja kinaza tudi v tem primeru prične odzivati pri vse nižjih koncentracijah vhodnega signala. Vendar potrebno povečanje velikosti vhodnega signala, da se kinaza popolnoma aktivira, narašča. Slika 6. Izhodni signal (z) proteinske kaskade za N = 3 v odvisnosti od vhodnega signala (x). a) z(x) za n H = 1,5. Črna črta: i = 1, modra: i = 2 in rdeča: i = 3. Ultrasenzitivnost kaskade se v tem primeru poveča. b) z(x) za n H = 0,8. Črna črta: i = 1, rdeča: i = 2 in modra: i = 3. V tem primeru se ultrasenzitivnost kaskade zmanjša. Hillove koeficiente posamezne stopnje za oba primera smo določili tudi numerično in jih primerjali s teoretično pričakovanimi vrednostmi. Rezultati so zajeti v tabeli 1. Iz rezultatov lahko tudi sklepamo, da s kaskadnim mehanizmom ne moremo doseči ultrasenzitivnega odziva, kadar je Hillov koeficient posameznih kinaz enak 1. V nadaljevanju bomo predstavili, kako lahko tudi v takšnem primeru ultrasenzitiven odziv vendarle dosežemo. n H = 1,5 n H = 0,8 i n H,teo n H,num n H,teo n H,num 1 1,500 1,502 0,800 0, ,250 2,215 0,640 0, ,375 3,322 0,512 0,500 Tabela 1. Teoretične vrednosti Hillovih koeficientov (n H,teo ) in numerično pridobljene vrednosti Hillovih koeficientov (n H,num ) za posamezne stopnje proteinskih kinaz. 7

11 5 Regulacija ultrasenzitivnosti s pozitivno povratno zanko V bioloških sistemih so pogoste pozitivne povratne zanke [10]. V splošnem se pri povratni zanki del izhodnega signala določene kinaze v proteinski kaskadi vodi nazaj na vhod določene kinaze. Za primer tristopenjske proteinske kaskade bomo opazovali njeno vhodno izhodno karakteristiko, če ji dodamo pozitivno povratno zanko. Povratno zanko bomo uvedli med izhodom končne kinaze in vhodom primarne kinaze, kakor to prikazuje slika 7. Zaradi dodane povratne zanke se del izhodnega signala na končni kinazi prišteje k vhodnemu signalu primarne kinaze. Slika 7. Signalna struktura 3 stopenjske proteinske kaskade s pozitivno povratno zanko. Vhodni signal je x, konstante k on,1 do k on,3 so aktivacijske in k off,1 do k off,3 deaktivacijske konstante. Neaktivirane kinaze so označene z z1 do z3, aktivirane kinaze pa z z 1 do z 3. Tristopenjska kaskada, ki v osnovi ni ultrasenzitivna, to lahko postane, če vsebuje pozitivno povratno zanko. V ta namen je potrebno matematični model, zapisan v enačbi (1), nadgraditi. Dinamiko posamezne kinaze zapišemo kot [13]: z 1 t = k on x 1 + z 3 f z z tot z 1 k off z 1, tot (6) z 2 t = k on z 1 z tot z 2 k off z 2, (7) z 3 t = k on z 2 z tot z 3 k off z 3, (8) kjer je f jakost pozitivne povratne zanke. Večja kot je njena vrednost, večji del izhodnega signala se vodi nazaj na vhod, kjer se prišteje k obstoječemu vhodnemu signalu x. Vhodno izhodna karakteristika, dobljena s simulacijo, je predstavljena na sliki 8. Vidimo, da se z večanjem jakosti pozitivne povratne zanke strmina krivulje povečuje. Zaradi tega je kaskada vse bolj ultrasenzitivna, kar povečuje občutljivost izhodnega signala v odvisnosti od vhodnega. Poudariti je treba, da je vrednost Hillovega koeficienta posameznih proteinskih 8

12 kinaz pri tej simulaciji enaka 1, zato same po sebi nimajo ultrasenzitivnih lastnosti. Pokazali smo torej, da s pozitivno povratno zanko dosežemo, da sistem iz enega stabilnega stanja preide v drugo stabilno stanje pri tem manjši spremembi vhodnega signala x, čim večja je jakost pozitivne povratne zanke. Sistem tako postaja vse bolj bistabilen. Slika 8. Izhodni signal (z) za proteinsko kaskado s pozitivno povratno zanko pri N = 3 (slika 7) za različne jakosti povratne povezave f v odvisnosti od vhodnega signala x. Črna črta: f = 1, rdeča: i = 10 in modra: i = 100. Hillov koeficient posamezne proteinske kinaze je enak 1. 6 Zaključek V seminarju smo obravnavali znotrajcelično signalizacijo, ki jo v izvršilnem delu sestavlja t.i. mitogensko aktivirana proteinska kaskada. Predstavili smo shemo in osnove delovanja takšne kaskade ter za izvedbo numeričnih simulacij uporabili relativno preprost matematični model. V nadaljevanju smo za proteinsko kaskado pokazali, da se njena senzitivnost lahko poveča le, če za produkt Hillovih koeficientov velja n H,i n H,i 1 > 1. Nazadnje smo v proteinsko kaskado vezali pozitivno povratno zanko in pokazali, da je tudi v intrinzično senzitivnem sistemu (n H,i n H,i 1 = 1) možno izzvati ultrasenzitivnost, ki jo je možno regulirati z jakostjo povratne zanke. Dodana vrednost ultrasenzitivnosti je tudi v tem, da omogoča izločanje šuma iz vhodnega signala in njegovo ojačenje [13]. Obe lastnosti dodatno zagotavljata robustno prehajanje med aktivnim in neaktivnim stanjem, oziroma ohranjanje enega izmed zasedenih stanj. Zanimivo bi bilo izvesti analizo vpliva bolj kompleksnih sklopitvenih struktur na dinamiko sistema. Takšen pristop bi nam omogočal vpeljavo tako pozitivnih kot negativnih povratnih zank in zaradi tega bolj poglobljeno razumevanje interakcij, ki potekajo v tej znotrajcelični signalizacijski poti. 9

13 Literatura in viri [1] C. Adami, C. Ofira in T. C. Collier, Evolution of biological complexity, PNAS 9, (1986). [2] Home science tool, Cell Anatomy. Pridobljeno , iz [3] R. A. Bowen, Hormones and control system. Pridobljeno , iz [4] J. W. Kimball, Kimball's Biology Pages. Pridobljeno , iz [5] G. Pearson, F. Robinson, T. B. Gibson, B. E. Xu, M. Karandikar, K. Berman, M. H. Cobb, Mitogen activated protein (MAP) kinase pathways: regulation and physiological functions, Endocr. Res. 22, (2001). [6] N. I. Markevich, J. B. Hoek in Boris N. Kholodenko, Signaling switches and bistability arising from multisitep fosphorylation in protein kinase cascades, J. Cell Biol. 164, (2004). [7] R. Heinrich, B. G. Neel in T. A. Rapoport, Mathematical models of protein kinase signal transduction, Mol. Cell. 9, (2002). [8] M. Chaves, E. D. Sontag in R. J. Dinerstein, Optimal length and signal amplification in weakly activated signal transduction cascades, J. Phys. Chem. B. 108, (2004). [9] J. Nakabayashi in A. Sasaki, Optimal phosphorylation step number of intracellular signaltransduction pathway, J. Theor. Biol. 233, (2005). [10] S. Choi, Introduction to systems biology (Humana Press, Totowa, New Jersey, 2007). [11] Q. Zhang, S. Bhattacharya in M. E. Andersen, Ultrasensitive response motifs: basic amplifiers in molecular signalling networks, Open Biol. 3, (2013). [12] B. N. Kholodenko in M. R. Birtwistle, Four dimensional dynamics of MAPK information processing systems, Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 1, (2009). [13] J. E. Ferrell in S. H. Ha, Ultrasensitivity part III: cascades, bistable switches, and oscillators, Trends Biochem. Sci. 39, (2014). 10