熊本大学学術リポジトリ. Kumamoto University Repositor

Transcription

1 熊本大学学術リポジトリ Kumamoto University Repositor Title 新興薬剤耐性菌が産生するメタロ -β- ラクタマーゼの加 水分解機構の解明と非可逆的阻害剤の開発 Author(s) 山口, 佳宏 Citation Issue date Type URL Thesis or Dissertation Right

2 熊本大学学位論文 新興薬剤耐性菌が産生するメタロ -β- ラクタマーゼ の加水分解機構の解明と非可逆的阻害剤の開発 2005 山口佳宏 Probing the hydrolysis mechanism of metallo-β-lactamases and development of their irreversible inhibitors 2005 Yoshihiro Yamaguchi - 1 -

3 Probing the mechanism of hydrolysis of metallo-β-lactamases and development of irreversible inhibitors Yoshihiro Yamaguchi Metallo-β-lactamases (MBLs) are dinuclear Zn(II) metalloenzymes that catalyze the efficient hydrolysis of a wide range of β-lactam antibiotics including carbapenems and extended-spectrum cephalosporins. The emergence of appearance of these antibiotic-resistant bacteria raises a considerable public health concern and awareness regarding the proliferation and treatment of infectious diseases. More than twenty MBLs have been identified in clinical isolates of major gram-negative pathogens. Furthermore, MBLs show little or no susceptibility to clinically used β-lactamase inhibitors such as clavulanic acid, tazobactam, and sulbactam. Although there have been reported several of compounds that inhibit MBLs, at present no clinically useful inhibitors appear to be available. One of the causes for this is the rate of MBL dissemination and diversity, which prevents the development of ΜΒL inhibitors. These facts clearly highlight the urgency and importance of improving our understanding of MBLs to design either new β-lactam antibiotics with improved activity against bacteria or inhibitors that are capable of extending the utility and lifetime of currently used antibiotics. Therefore, the aims of this study were to clarify the common hydrolysis mechanism of MBLs using kinetics and X-ray crystallographic studies and to develop mechanism-based irreversible inhibitors for all MBLs and agents for detecting MBL-producing strains with high sensitivity and selectivity. The new findings obtained in this study are summarized as follows. 1. Knowledge of the ph dependency in hydrolyzing enzymes is indispensable to elucidate the reaction mechanism because the active sites generally contain acidic or basic groups and one protonated form of the acid and base is catalytically active. In ph-jump experiments, IMP-1, a member of the MBL family and named from a Serratia marcescens isolate collected in Japan in 1991, was inactivated in an acidic medium by the dissociation of Zn(II) from the holo-enzyme, where ligands coordinating to Zn(II) ion(s) may be protonated. The ph dependence for the IMP-1 hydrolysis in the presence of large excess of Zn(II) ion revealed that no functional group having a pk a between ph 5 and 9 was present. These results suggest that the pk a value of a bridging OH 2 to two Zn(II) ions (Zn1-OH 2 -Zn2), which acts as a nucleophile to the carbonyl carbon on the β-lactam ring, is lower than 5. It is thought - 2 -

4 that the positive charges of the two Zn(II) ions are the main cause for lowering the pk a for water as a nucleophile and assist in the deprotonation of the bridging OH To probe the role of the well conserved Asp120 in the active site of IMP-1, site-directed mutagenesis was conducted. The two Asp120-mutants, D120(81)A and D120(81)E, in which asparatic acid was replaced by alanine and glutamic acid, were characterized using CD, metal analyses, steady-state kinetics, and X-ray crystallography. In the steady state kinetic experiments, D120(81)A and D120(81)E showed a remarkable reduction in activity, i.e. a decrease in k cat by fold and an increase in K m of several fold to fold. These results suggest that Asp120 in IMP-1 plays important roles in catalysis and substrate recognition. Furthermore, from pre-steady-state kinetic experiments, an anionic intermediate of nitrocefin having an absorption maximum around 650 nm was not observed for the IMP-1 mutants, suggesting that Asp120 in IMP-1 is not a proton donor to the anionic intermediate of nitrocefin. The ph dependence of the hydrolysis for the IMP-1 mutants indicated that Asp120 is not a factor in decreasing the pk a below 5 for the water bridging two Zn(II) ions. The three-dimensional structures of D120(81)E and Glu120(81)E were determined at a resolution of 2.0 and 3.0 Å, respectively. From the X-ray crystallography results, the structure of D120(81)E (the oxygen atom of Glu120(81)OE1 is presumably not coordinated to the bridging OH 2 or OH - ), the oxygen atom of the carboxylate of Asp120 is essential for coordination to the bridging OH 2 or OH - by a hydrogen bond to achieve catalytic activity. Thus, the critical role of Asp120 is to orientate OH 2 or OH -, which acts as a nucleophile to the carbonyl carbon on the β-lactam ring. 3. To develop effective inhibitors against IMP-1, two novel MBL inhibitors, pentafluorophenyl 3-mercaptopropionate (PFMP) and 3-(3-mercaptopropionylsulfanyl)propionic acid pentafluorophenyl ester (MPAP) were synthesized. These compounds have a thiol group for the coordination to Zn(II) ion(s), and an activated ester capable of interacting with the Cys 221 or Lys224 residue in the active site as a nucleophile. From gel-filtration and dialysis experiments, the treatment of IMP-1 with each inhibitor resulted in a nearly 100% inhibition, indicating that both inhibitors inhibited IMP-1 very rapidly and irreversibly. The MALDI-TOF mass spectra of IMP-1 treated with each inhibitor showed an increase in mass, corresponding to the sum of the mass of the acyl moiety that is removed from the pentafluorophenol group from the inhibitor and of IMP-1. Moreover, to identify the site of amino acid attachment and to determine the three-dimensional structure, the - 3 -

5 X-ray crystallography of IMP-1 complexed with MPAP was carried out at a resolution of 2.6 Å. X-ray crystallography revealed that the thiol group bridges between the two Zn(II) ions in the active site and the terminal carbonyl group in the acyl moiety covalently bonds to the side chain N ζ atom of Lys224 to form an amide bond. 4. To devise a fluorometric method for detecting MBL-producing strains rapidly and selectively, a novel fluorescence detecting reagent, N-[2-(5-dimethylamino-naphthalene-1-sulfonylamino)ethyl]-3-mercaptopropionamide (DansylC2SH) was synthesized. This compound contains a thiol group as a Zn(II) ligand and a dansyl group as a fluorophore and both groups are linked via ethylendiamine as a spacer. To examine the ability of the fluorescent detecting agent for IMP-1, the fluorescence emission spectra of DansylC2SH in the absence or the presence of IMP-1 were measured. When a IMP-1 buffered solution was added to a DansylC2SH solution, fluorescence enhancement was observed, indicating that DansylC2SH binds in the active site, and interacts with Trp64(28) near the active site. As mentioned above, these findings shed new light on our understanding of the common hydrolysis reaction mechanism for, not only MBLs, but also binuclear Zn(II) hydrolases that have been discovered recently. The inhibition modes of the inhibitors for IMP-1 designed and synthesized in this study were clarified to be irreversible using kinetics, MALDI-TOF mass, and X-ray crystallographic studies. These inhibitors interacted with IMP-1 to form a covalent bond between the acyl group in the inhibitor and the side chain N ζ atom of Lys224, leading to irreversible inhibition. Thus, the strategy for the design of irreversible inhibitors and X-ray crystal results in this study would help in the design of mechanism-based inhibitors that target, not only all MBLs, but also on other metalloenzymes such as metallo matrix proteases. Moreover, it is expected that the fluorescence detecting reagent, DansylC2SH, represents a lead compound for the further development of detecting agents and specific inhibitors with a high affinity and selectivity for all MBLs

6 本論文で使用した略号一覧表 MBL MALDI-TOF MS Metallo-β-lactamase Matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometer MOPS MES WT CD DMSO Tris PDB MW SDA-PAGE PFMP MPAP TFA 3-MPA Hepes PCR NCCLS DansylC2SH 3-Morpholinopropanesulfonic acid 2-Morpholinoethanesulfonic acid Wild-type Circular dichroism Dimethyl sulfoxide Tris(hydroxymethyl)aminomethane Protein Data Bank Molecular weight Sodium dodecyl sulfate-polyachrylamide gelelectrophoresis Pentafluorophenyl 3-mercaptopropionate 3-(3-Mercaptopropionylsulfanyl) propionic acid pentafluorophenyl ester Trifluoroacetic acid 3-Mercapropropionic acid 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid Polymerase chain reaction National committee for Clinical Laboratory Standards N-[2-(5-dimethylamino-naphthalene-1-sulfonylamino)ethyl] -3-mercaptopropionamide CA Carbonic anhydrase - 5 -

7 本論文は学術雑誌に掲載された次の論文を基礎とするものである 1. Dependence of Hydrolysis of β-lactams with a Zinc(II)-β-Lactamase Produced from Serratia marcescens (IMP-1) on ph and Concentration of Zinc(II): Dissociation of Zn(II) from IMP-1 in Acidic Medium Masafumi Goto, Hisami Yasuzawa, Toshihiro Higashi, Yoshihiro Yamaguchi, Akiko Kawanami, Shiho Mifune, Hiromasa Mori, Hitoshi Nakayama, Kumiko Harada, and Yoshichika Arakawa Biol. Pharm. Bull., 26, (2003) 2. Detection of Metallo-β-Lactamase (IMP-1) by Fluorescent Probes Having Dansyl and Thiol Groups Hiromasa Kurosaki, Hisami Yasuzawa, Yoshihiro Yamaguchi, Wanchun Jin, Yoshichika Arakawa, and Masafumi Goto Org. Biomol. Chem., 1, (2003) 3. Probing the Role of Asp120(81) of Metallo-β-Lactamase (IMP-1) by Site-directed Mutagenesis, Kinetic Studies and X-ray Crystallography Yoshihiro Yamaguchi, Takahiro Kuroki, Hisami Yasuzawa, Toshihiro Higashi, Wanchun Jin, Akiko Kawanami, Yuriko Yamagata, Yoshichika Arakawa, Masafumi Goto, and Hiromasa Kurosaki J. Biol. Chem., 280, (2005) 4. Irreversible Inhibition of Metallo-β-Lactamase (IMP-1) by 3-(3-Mercaptopropionylsulfanyl)propionic Acid Pentafluorophenyl Ester Hiromasa Kurosaki, Yoshihiro Yamaguchi, Toshihiro Higashi, Kimitaka Soga, Satoshi Matsueda, Haruka Yumoto, Shogo Misumi, Yuriko Yamagata, Yoshichika Arakawa, and Masafumi Goto Angew. Chem. Int. Ed., 44, (2005) - 6 -

8 目次 第 1 章緒言 1 第 2 章 酸性溶液中における metallo-β-lactamase (IMP-1) からの Zn(II) イオンの解 離とβ-ラクタム加水分解活性の ph 依存性 9 第 1 節序論 9 第 2 節結果 酸性溶液中における IMP-1 の加水分解活性と Zn(II) イオン添加による活性の回復 酸性溶液中における IMP-1 からの Zn(II) イオンの解離 イミペネムに対する加水分解の ph 依存性 14 第 3 節考察 15 第 4 節小括 19 第 3 章 部位特異的変異法 速度論解析 X 線結晶構造解析を用いた metallo-β-lactamase (IMP-1) の Asp120(81) の役割の検討 20 第 1 節 序論 20 第 2 節 結果 Asp-120(81) 変異体 D120(81)A および D120(81)E の構築 IMP-1 変異体の基質加水分解に対する速度論的パラメータの決定 IMP-1 変異体の基質加水分解活性に対する ph 依存性 WT と IMP-1 変異体の前定常状態におけるニトロセフィン加水分解

9 2-5 D120(81)A と D120(81)E の X 線結晶構造解析 アニオンによる D120(81)A の阻害と阻害に対するアニオン依存性 32 第 3 節 考察 33 第 4 節 小括 39 第 4 章 3-(3-Mercaptopropionylsulfanyl)propionic acid pentafluorophenyl ester によ る metallo-β-lactamase (IMP-1) の非可逆的阻害 40 第 1 節序論 40 第 2 節結果 新規阻害剤の IMP-1 に対する阻害能 ゲルろ過法による非可逆阻害性の検討 透析法による非可逆阻害性の検討 阻害剤処理 IMP-1 のレーザーイオン化質量分析装置 (MALDI-TOF MS) による分子量測定 MPAP で処理した IMP-1 の X 線結晶構造解析 47 第 3 節考察 50 第 4 節小括 53 第 5 章 ダンシル基とチオール基を有する蛍光プローブによる metallo-β-lactamase の検出 54 第 1 節 序論 54 第 2 節 結果 DansylC2SH 蛍光量子収率の決定 IMP-1 共存下の DansylC2SH の蛍光スペクトル変化と IMP-1 との解 離定数の決定

10 2-3 Alubmin 及び CA 存在下における DansylC2SH の蛍光スペクトルと IMP-1 存在下の蛍光スペクトルとの比較検討 apo IMP-1 存在下における DansylC2SH の蛍光スペクトルと Zn(II) イオン の効果 トリプトファン励起光 (280 nm) による DansylC2SH 共存下の IMP-1 の蛍光スペクトル変化 DansylC2SH による IMP-1 阻害の検討 62 第 3 節 考察 63 第 4 節 小括 65 第 6 章総括 67 実験の部 71 謝辞 88 参考文献

11 第 1 章緒言 人類が 1940 年代半ばにペニシリンの工業的大量生産に成功して以来 各種の抗生物質の探索や抗菌薬の開発が意欲的に推し進められ 細菌感染症の治療は著しく進歩した β-ラクタム剤は 細菌の外膜の主要な構成要素であるペプチドグリカンの生合成に関与するペニシリン結合蛋白質 (PBP) の transpeptidase 機能を阻害するので 極めて選択毒性に優れ現在も汎用されている 1 だがこれらの薬剤の使用に伴い 耐性を持つ菌株が増加している 細菌の耐性機構は抗菌薬の標的部位の変化 酵素による薬剤の不活化 細胞内への薬剤透過性の低下 細胞外への薬剤排出などが挙げられる そこで耐性菌の克服とより広い抗菌スペクトルを求めて 第 2 3 世代へと抗菌薬の開発が行われた 1980 年代の中頃から グラム陽性菌から陰性菌までに幅広い抗菌力を発揮するカルバペネム薬が臨床で使用され始め β-ラクタム剤の中でも切り札的な存在として扱われた 2 しかし 1990 年代に入ると カルバペネム薬に耐性をもつ病原菌が世界各地で報告され 日和見感染症や院内感染の起炎菌として問題となっている β-ラクタム剤を不活化する酵素 β-lactamase はβ-ラクタム剤を加水分解することにより 抗菌活性を消失させる β-lactamase はアミノ酸配列の相同性から class A から D に分類されており 酵素の活性中心がセリン残基である class A C D の serine-β-lactamase と Zn(II) イオンである class B の metallo-β-lactamase (MBL) の 2 種類が知られている 3 MBL は 1966 年に非病原菌である Bacillus cereus から初めて発見され 年に Pseudomonas maltophilia から L1 が発見された 年に初めて病原菌である Bacteroides fragilis から CcrA 6 Aeromonas hydrophilia から CphA 年に Serratia marcescens から IMP-1 が発見された 8 この時期から MBL 産生菌の迅速な同定法が報告され 9 急速に MBL 産生菌が単離されるようになり 現在までに 20 種類を超える MBL が同定されている 10 さらに MBL は保存されているアミノ酸配列から subclass B1 から B3 まで分類さ - 1 -

12 れている 11 Fig. 1 に代表的な MBL で保存されているアミノ酸配列と活性中心を subclass に分けて比較した 本論文においてアミノ酸番号は class B β-lactamase (BBL) numbering に従い番号付けした また ( ) の中は matured 酵素におけるアミノ酸番号を示す 11 例えば IMP-1 の Asp120(81) は BBL numbering では 120 番目 matured IMP-1 では 81 番目のアミノ酸番号を示す A) Subclass B1 (..HxHxD..) BcII DVIITHAHADRIGGI CcrA TFIPNHWHGDCTGGL IMP-1 GSISSHFHSDSTGGI VIM-2 RAVSTHFHDDRVGGV BlaB MNIATHSHDDRAGGL IND-1 AVFATHSHDDRAGDL Subclass B2 (..NxHxD..) CphA EVINTNYHTDRAGGN Subclass B3 (..HxHxDH..) B) L1 LILLSHAHADHAGPV FEZ-1 ILLISHAHFDHAAGS Subclass B1 CcrA 12 Subclass B2 CphA 13 Subclass B3 L1 14 Fig. 1. A) Comparison of alignment of the amino acid sequences between subclasses of MBLs 11. B) Comparison of the active site of the three subclasses

13 MBL の subclass B1 は His116-x-His118-x-Asp120 の配列を有しており BcII では活性中心に 1 つの Zn(II) イオンを含むが それ以外は 2 つの Zn(II) イオンを含む 15 Subclass B2 は Asn116-x-His118-x-Asp120 の配列を有しており 活性中心に Zn(II) イオンを 1 つ含むが 2 つ目の Zn(II) イオンの結合は活性を阻害することが知られている 16 Subclass B3 は His116-x-His118-x-Asp120-His121 の配列を有しており 活性中心に 2 つの Zn(II) イオンを含む 14 Subclass 間の活性中心の構造は subclass B1 については詳細に後述するが subclass B2 では 1 つの Zn(II) イオンが Zn2 サイトに結合し Zn1 サイトには Zn(II) イオンが結合せず また subclass B3 では His121 が Zn2 サイトの Zn(II) イオンに配位していることが X 線結晶構造解析の結果から明らかにされた (Fig. 1B) 13, 14 MBL である IMP family と VIM family は主として日和見感染で問題となる P. aeruginosa や S. marcescens から発見されている 8, 10, 17 IMP 遺伝子 VIM 遺伝子は伝達性プラスミド中に存在するインテグロン構造にカセットとして組み込まれている (Fig. 2) インテグロン構造はカセット組み込み 離脱のためのインテグラーゼとカセット遺伝子発現のための promotor 領域を含むため 水平的に他の細菌に伝播することができる 18 またカセット遺伝子としてアミノグリコシド耐性遺伝子なども含むことから インテグロンを有する細菌は獲得性の多剤耐性菌となる IMP 遺伝子 VIM 遺伝子は日本のみならず世界中に拡散しており また IMP family は IMP-1 から IMP-13 まで VIM family は VIM-2 から VIM-8 まで少しずつアミノ酸配列に変異が入りながら発見されることから 特に警戒する必要がある遺伝子である 10 そのため IMP family および VIM family に有効な阻害剤開発は急務である その他の MBL 産生菌の世界中への拡散は IMP family および VIM family に比べると少ないが 臨床で単離されていることから すべての MBL に有効な阻害剤を開発するために すべての MBL に共通な加水分解機構および基質 阻害剤認識機構を原子 分子レベルで詳細に解明することが重要であると考える - 3 -

14 メタロ -β- ラクタマーゼ遺伝子インテグラーゼ遺伝子アミノグリコシド耐性遺伝子 インテグロン構造 インサーション配列 (IS) 耐性遺伝子カセット インサーション配列 (IS) 伝達性 R- プラスミド 染色体 Fig. 2. 耐性菌 The structure of integron mediated the gene encoded IMP family. CcrA の 3 次元構造と活性中心を Fig. 3 に示す 12 MBL は特徴としてαβ/βαのサンドイッチ構造を持ち β-シートの間に Zn(II) イオンが 1 つまたは 2 つ広くて浅い溝に存在することが X 線結晶構造解析により報告されている 12 この構造は報告されているすべての MBL で見られる また活性部位は広くて浅い溝の底にあるため 様々なβ- ラクタム剤を収容することができる そのためほとんどすべてのβ-ラクタム剤を加水分解することができると考えられている また活性中心近傍には フラップ と呼ばれるヘアピンループが存在し 基質認識に重要であることが知られている (Fig. 3A) Zn(II) イオンに対する活性中心の配位構造は Fig. 3B で示しているように 1 つの Zn(II) イオン (Zn1) は 3 つの His と架橋した水分子とで四面体構造をとっており 他の Zn(II) イオン (Zn2) はもう 1 つの水分子と Asp を頂点として Cys,His と架橋した水分子とでできる三角両錘構造をとっている - 4 -

15 フラップ Fig. 3. A) The overall structure of CcrA (PDB code, 1ZNB 12 ). B) The active site of CcrA MBL の加水分解機構は 単核 Zn 酵素である BcII と 複核 Zn 酵素である CcrA で提案されている Fig. 4 で示すように BcII では Zn(II) イオンに配位した OH 2 が OH - となってβ-ラクタムのカルボニル炭素を求核攻撃し テトラヒドラル中間体形成後, 活性中心にある Asp がプロトンシャトルの役割をし β-ラクタム環が加水分解される 19 一方 CcrA では 2 つの Zn(II) イオンに架橋した OH 2 が OH - になり BcII と同じよう に求核攻撃をする その後 Zn2 がアニオン中間体を安定化し この中間体にプロトンが付加されることによりβ-ラクタム環が加水分解される このとき活性中心にある Asp は求核攻撃の補助をすると考えられている (Fig. 5) 12, しかし 未だ詳細な反応機構は明らかにされていない - 5 -

16 S nitrocefin (391 nm) H N S C O N O COO - His O H His Zn1 H His O O NO 2 NO 2 nitrocefin tetrahedral-intermediate S His His His H N C O O Zn1 N OH S H COO - O O NO 2 NO 2 Asp Asp hydrolyzed nitrocefin (491 nm) H S C N S O HN O O OH COO - 2 N H NO 2 +H 2 O His O H His Zn1 His O O Asp Fig. 4. Proposed mechanism of nitrocefin hydrolysis by the mono-zn(ii) MBL (BcII). MBL 阻害剤は 1996 年から trifluoromethyl alcohols and ketones 24 hydroxamates 25 thiols 19, thioester 誘導体 28, cysteinyl peptides 39 biphenyl tetrazoles 40, 41 mercaptocarboxylates 28, 39, 42 43, 1β-methylcarbapenem 誘導体 44 2,3-disubstituted succinic acid 誘導体 45 tricyclic natural products 46 N-arylsulfonyl dydrazones 47 synthetic cephamycin 誘導体 48 が報告されているが いずれも可逆的な阻害剤であり また数種類の MBL しか阻害しない 個々の阻害剤は酵素が違うと阻害の強さが異なることから それぞれ異なった酵素 - 阻害剤結合様式をもつと考えられる MBL 阻害剤を開発するためには これらの酵素の 1) Zn(II) イオンおよび近隣のアミノ酸残基 2) 疎水性残基と阻害剤との結合様式を X 線結晶構造解析などにより分子レベルで活性中心の - 6 -

17 S His His His H N C O O Zn1 S N COO - Cys Zn2 O H - O O Asp NO 2 H O H His NO2 S His His His nitrocefin anion-intermediate H (665 nm) C N S NO 2 O N O O COO - 2 N Zn1 OH - O Asp Zn2 O Cys His H O H + H 2 O S His H C N S O HN O OH O O COO - 2 N Cys NO 2 His His Zn1 H - O Zn2 O His Asp Fig. 5. Proposed mechanism of nitrocefin hydrolysis by the di-zn(ii) MBL (CcrA) 詳細な構造を明らかにした上で設計することが重要である MBL- 阻害剤複合体の X 線結晶構造解析は現在までに CcrA と阻害剤 4-morpholinoethanesulfonic acid (MES) の複合体 49 CfiA と tricyclic natural products の 複合体 46 IMP-1 と阻害剤 mercaptocarboxylate (2-[5-(1-tetrazolyl-methyl)thien-3-yl] -N-[2-(mercaptomethyl)-4-(phenylbutyrylglycine)]) の複合体 42 および 2,3-dissubstituted succinic acid 誘導体の複合体 45 Chryseobacterium meningosepticum 由来である BlaB と D-captopril の複合体 50 Legionella gormanii 由来である FEZ-1 と D-captopril の複 合体 51 について報告されている 新しい阻害剤の開発はこれらの X 線結晶構造解析 の結果に立脚し 合理的に分子設計する必要があると考えられる 感染菌の MBL 産生の有無を確認することは感染症治療の初期段階において極めて - 7 -

18 重要である 現在知られている MBL の検出方法として耐性遺伝子の塩基配列を利用する PCR 法があるが 高度な技術と特殊試薬を必要とするため臨床検査で日常的に行うのは困難である 年に Arakawa Goto らは メルカプト酢酸ナトリウムディスク (SMA) とセフタジジム (CAZ) のディスクを並置するダブルディスク法を報告した 75 これは NCCLS 法 76 に従いミューラーヒントン培地に MacFarland 0.5 の菌液を綿棒で塗布し MBL に対して阻害作用を示す SMA ディスクとセフェム系抗菌剤である CAZ のディスクを並置して一晩置き ディスク周辺の発育阻止帯の変化から MBL の産生の有無を識別する方法である この方法は 臨床検査で比較的簡単に使用することが可能だが長時間を要するという欠点があった これらの背景の下 本研究は日本で発見され その耐性遺伝子がプラスミド上に存在する IMP-1 を対象として以下の研究を行なった 第 2 章では IMP-1 からの Zn(II) イオンの解離機構をイミペネム加水分解活性の ph 依存性で検討し 第 3 章ではすべての MBL の活性中心に保存されている Asp120 の IMP-1 変異体を調製し ph 依存性 速度論的解析および X 線結晶構造解析により Asp120 の役割を明らかにした さらに第 4 章では IMP-1 の三次元構造に基づいて IMP-1 に対し非可逆的に阻害する新規阻害剤を設計 合成し阻害活性ならびに阻害様式を速度論的解析 MALDI-TOF MS X 線結晶構造解析により解明した 第 5 章では簡便にかつ短時間で検査できる蛍光プローブ法で IMP-1 産生菌を同定するために新規蛍光剤を設計 合成し蛍光スペクトル測定および阻害活性測定から新規蛍光剤の特徴づけを行なった 以下に得られた知見を詳述する - 8 -

19 第 2 章酸性溶液中における metallo-β-lactamase (IMP-1) からの Zn(II) イオンの解離 と β- ラクタム加水分解活性の ph 依存性 第 1 節序論 加水分解酵素の研究において 活性の ph 依存性を調べることは詳細な反応機構を知る上で重要な研究手法の 1 つである これは酵素の加水分解反応が 活性中心を構成している酸性または塩基性側鎖をもつアミノ酸の pk a と密接に関係しているためである 特に活性中心に金属イオンを含有する場合 金属イオンのリガンドへの配位はリガンドのプロトン化と金属イオンとの競争反応によって達成される 金属イオンが加水分解反応機構に参加している場合 2 つの点に注意を払う必要がある 第一に 金属イオンの解離がリガンドのプロトン化状態に依存するため ph によるリガンドからの金属イオンの解離の検討を行なう必要があること 第二に 加水分解酵素の反応物 ( 基質 ) への攻撃種は 金属イオンに配位している OH 2 の H + が解離した OH - であると考えられており 金属イオンの配位水の pk a を検討しなければならない つまり 加水分解酵素にとって 如何に攻撃種である OH 2 の pk a を下げるかが重要となる OH 2 の pk a を下げる 1 つの手段として正電荷を持った Zn(II) イオンへの配位がある これが多くの加水分解酵素の活性中心に Zn(II) イオンを含む理由の 1 つである 遊離の OH 2 の pk a は 14.0 であるが Zn(II)-OH 2 の pk a は 10.0 と下がる これは Zn(II) イオンの正電荷に OH 2 の電子が引き付けられる事で H + が解離しやすいと考えられる さらに Zn(II)-OH 2 にリガンドが配位することで Zn(II)-OH 2 の pk a は下がることがわかっ ている 例えば carboxypeptidase A は重要な加水分解酵素であるが その Zn(II)-OH 2 の pk a は 6.1 であると推定されている 52 本研究対象である MBL の多くは複核 Zn 酵素であり β-ラクタム環の加水分解を触媒している β-ラクタム環のカルボニル炭素への求核試薬は 2 つの Zn(II) イオンに架 - 9 -

20 橋して配位している配位水 (Zn1-OH 2 -Zn2) だと考えられている 12, 14 MBL であり単核 Zn 酵素である BcII は前述したように β-ラクタム環の加水分解に 2 つの H + の関与を示し その 1 つは Zn(II) イオンに配位している Zn1-OH 2 で pk a は 5.6 と考えられている 19 もう 1 つの H + はすべての MBL に保存されている Asp で同じ pk a を持つとされた 19 しかし MBL で複核 Zn 酵素である CcrA では 活性の ph 依存性や溶媒同位体効果による評価を行なったが pk a が 5 から 9 の間にある官能基は存在せず 2 つの Zn(II) イオンに架橋した Zn1-OH 2 -Zn2 の pk a は 5.0 以下であることが報告されている 22, 23 これらのことから単核 Zn 酵素の BcII と複核 Zn 酵素の CcrA では違う反応機構 が提案された 53 しかし BcII と CcrA の ph 依存性の研究では Zn(II) リガンドのプロトン化状態のことが考慮されていない このことは (1) リガンドがプロトン化されることで Zn(II) イオンが酵素から脱離し活性が低下したこと (2) 活性種である OH - (Zn-OH - ) がプロトン化され OH 2 (Zn-OH 2 ) になると活性が低下すること 以上 2 つの問題点が重なり 正当な評価ができていないと考えた そこで MBL であり複核 Zn 酵素である IMP-1 の ph 依存性を調べるために 1)pH による IMP-1 からの Zn(II) イオン脱離の検討 2)(1) を基にしたイミペネム加水分解活性の ph 依存性を行なった この結果を基に IMP-1 の加水分解機構のみならず 複核 Zn 酵素の反応機構を解明することが本研究の目的である

21 第 2 節結果 2-1 酸性溶液中における IMP-1 の加水分解活性と Zn(II) イオン添加による 活性の回復 酸性溶液中における IMP-1 のイミペネム加水分解活性は 100 µm のイミペネムを含む酢酸緩衝液 (0.2 M, ph 5.1, 0.5 M NaCl) に IMP-1 溶液 (Tris-HCl buffer, 50 mm, ph 7.4, 0.5 M NaCl) を 10 nm になるように加え 298 nm の吸光度の減少から測定した イミペネムの加水分解は 最初の 100 秒の間ですばやく起こったが 時間の経過と共に急速に活性の減少が観察され 100 秒後には時間変化に伴う吸光度変化は一定となり 反応が終了したかのように見えた (Fig. 6) Fig. 6. Time-course of absorbance change at 298 nm at 30 ºC for hydrolysis of imipenem on the addition of 10 nm IMP-1 in 50 mm Tris buffer(ph 7.4) to 100 µm imipenem in 0.2 M acetic acid-sodium acetate buffer(ph 5.1)-0.5 M NaCl. After 900 s, Zn(NO 3 ) 2 was added and the measurement was continued

22 しかし今回用いたイミペネムがすべて分解された場合 その吸光度変化は 1.0 であると予想されるが 400 秒後では 0.1 の吸光度変化しか変化していなかった そこで 900 秒後に Zn(NO 3 ) 2 を 100 µm になるように反応溶液に加えると 酵素活性が回復し 298 nm の吸光度の急速な減少が観察された (Fig. 6) 2-2 酸性溶液中における IMP-1 からの Zn(II) イオンの解離 2-1 から IMP-1 は酸性溶液中でホロ酵素から Zn(II) イオンの解離によって活性が消失することがわかった このことから活性のある Zn 結合型と活性のない Zn 解離型の間に平衡があると考え 酸性溶液中におけるイミペネム加水分解活性の Zn(II) イオン濃度依存性を調べた IMP-1 は ph 4.0 から 9.0 の緩衝液中で 30 ºC で 10 分間 様々な Zn(II) イオン濃度であらかじめインキュベートされ イミペネム加水分解の初速度 v init Fig. 7. Dependence of activity, k 2, for hydrolysis of imipenem by IMP-1 on the concentration of Zn(NO 3 ) 2 at ph

23 から酵素濃度 [E] T で除することで分子活性 k 2 (v init /[E] T ) を得た Fig. 7 は ph 5.0 における Zn(II) イオン濃度に対する k 2 のプロットを示す 外部からの Zn(II) イオンがない時の v 0 は 82 min -1 であったが IMP-1 の分子活性 k 2 は Zn(II) イオン濃度の増加により上昇し Zn(II) イオン濃度が 0.5 µm のときは 320 min -1 となり 20 µm のときほぼプラトーに達した (k 2 = 1500 min -1 ) (Fig. 7) この挙動は酸性溶液中においては Zn(II) イオンが活性中心から解離して 活性のある Zn 結合型と活性のない Zn 解離型の間の平衡が存在するという仮定と一致するこ とを示す 活性から求めた IMP-1 からの Zn(II) イオンの解離定数 K d と飽和活性 k max は Eq. 9 (p74 参照 ) の非線形最小二乗法を使って求めた 得られた速度論的パラメータ K d と k max を Table 1 に示す 解離定数 K d は ph 5.0 から 4.0 に減少するにつれて大きく増加した k max と ph と比較するために K d の常用対数をとった-log K d を ph に対してプロットした (Fig. 8) Fig. 8 で示すように ph に対する-log K d のプロットは ph Table 1. The dissociation constants of Zn(II) from IMP-1 and the limiting k max for the hydrolysis with concentration of Zn(II) determined using imipenem as a reporter substrate. ph k max /min -1 K d /µm log k max p(k d /µm)

24 5.0 以下で傾きが 4.0 の直線を得た さらに Fig. 8 の変曲点から IMP-1 からの Zn(II) イオンの解離に関与している官能基の pk a は 5.3 であることがわかった Fig. 8. Dependence of dissociation constant (K d ) ( ) and limiting rate constant (k max ) ( ) for imipenem by IMP-1 on ph. 2-3 イミペネムに対する加水分解の ph 依存性 活性変化から得られた IMP-1 からの Zn(II) イオンの解離定数 K d を 2-2 で得ることが できたので IMP-1 活性の ph 依存性をそれぞれの ph における K d の 25 倍量の Zn(NO 3 ) 2 の濃度で基質であるイミペネムの濃度を変えて分子活性 k 2 を求めた 使用した緩衝液は ph 4.0~5.6 では酢酸緩衝液 (0.2 M, 0.5 M NaCl) ph 5.6~9.0 では MTEN 緩衝液であった データは Michaelis-Menten の式 (Eq. 10 p74 参照 ) を使って速度論的パラメータ K m と k cat を求めた Fig. 9 で示したように イミペネムの log k cat に対する ph プロットは ph 7.0 と

25 の間で最大となったが ph 4.0 と 5.0 付近で減少した log K m のプロットは ph 4.8 と 6.0 で最小であり ph 4 付近で急激に上昇した これらの結果から log K m /k cat のプロットは ph 6.0 から 8.0 の間でプラトーになり 酸性側と塩基性側で縁となるような ベル型となった Fig. 9. ph profiles of log (k cat /min -1 ) ( ), log (K m /µm) ( ) and log (k cat /K m /min -1 µm) ( ) for the hydrolysis of imipenem by IMP-1 under sufficient concentration of Zn(II) at 30 ºC. 第 3 節考察 加水分解酵素の活性の ph 依存性の研究は 一般的に活性中心は酸性または塩基性 アミノ酸残基を含んでおり それらのプロトン化状態が触媒的な活性発現に重要であ るため 詳細な反応機構を解明する上で必要不可欠である MBL による β- ラクタム

26 剤の加水分解の ph 依存性はいくつか報告されている 19, これらの ph 依存性の測 定法において Zn(II) イオン濃度は 酵素濃度の 10 倍 53 または 500 倍以上 19 緩衝液に 加えられている BcII 活性の ph 依存性を報告した論文では 酸性領域で傾き 2 の直 線が得られ この結果から BcII の加水分解反応機構は 2 つの解離できる残基 Zn(II) イオンに配位した Zn1-OH 2 と 加水分解にとって重要な残基として提案されている Asp が関与していると提案された 54 しかしながら金属酵素にとって 金属イオンは 酵素機能発現には活性中心に保存されるべきであり ph による Zn(II) イオンに配位し ているリガンドのプロトン化状態を調べる必要がある ph 7.4 の条件下にある IMP-1 が ph 5.1 に調整された基質溶液と混合され 反応が 始まると基質に対する活性は 100 秒以内ですばやく減少し 減少した活性はその後維 持された (Fig. 6) しかし 反応が開始してから 900 秒後に Zn(II) イオンを添加したと ころ 酵素活性が回復したことから Zn(II) イオンが酸性溶液中で IMP-1 から解離し たことがわかった (Fig. 6) これは ph 7.4 の酵素溶液が ph 5.0 の緩衝液に移された時 ある速い変化が起こったため 数 100 秒で酵素活性が不安定な活性になったと考えら れる これらのことから 酸性溶液中 30 ºC では最初の 100 秒以内に Eq. 1 が起こっ ていると考えた K d active form non-active form + Zn(II) Eq. 1 酸性領域において 活性から求められた Zn(II) イオンの解離定数 K d の ph 依存性は 4 つのプロトン化が Zn(II) イオンの解離に関与して それら官能基の pk a は 5.3 と考えられる (Fig. 8) この Zn(II) イオンリガンドのプロトン化は 酸性溶液中においてみかけの IMP-1 の不活性化に強く関係していた アミノ酸側鎖の Zn(II) イオンに対する配位は ph に強く支配され 1 つ以上のリガンドが協奏的に金属イオンを捕捉する役割

27 をしている 遊離の His の pk a は 5.97 であるが このことから His のイミダゾール Nδが pk a より低い ph でプロトン化されることで 酵素分子から Zn(II) イオンが解離したと考えられる IMP-1 の Zn 含量は酵素 1 分子あたり 2 つであるが 本研究における活性がない IMP-1 の Zn 含量は不明である しかし IMP-1 を含む MBL では 1 つの Zn(II) イオンだけで活性があると報告されている IMP-1 からの Zn(II) イオンの解離を Eqs. 2, 3 で示す E-Zn 2 E-Zn K d1 E-Zn + Zn Eq. 2 K d2 E + Zn Eq. 3 不活性なフリーの酵素濃度 [E] mono-zn(ii) 型酵素濃度 [E-Zn] と di-zn(ii) 型酵素濃度 [E-Zn 2 ] は Eqs. 4-6 で示す [E] = [Zn] 1 + Kd1 [E] T [Zn] 2 + Kd1 K d2 Eq. 4 [E-Zn] = [E] T [Zn]/K d2 [Zn] 1 + Kd1 [Zn] 2 + Kd1 K d2 Eq. 5 [E-Zn 2 ] = [E] T [Zn] 2 /K d1 K d2 [Zn] 1 + Kd1 [Zn] 2 + Kd1 K d2 Eq. 6 非線形最小二乗法を用いて Eq. 9 の回帰曲線を当てはめたところ (Fig. 7) 実験値と理 論曲線が一致したことから di-zn(ii) 型 IMP-1(E-Zn 2 ) から 2 つの Zn(II) イオンが解離し

28 て フリーの IMP-1(E) になったため IMP-1 活性が不活性化されたと考えられる これらのことから E-Zn2 E-Zn および E をそれぞれ検出することはできなかったが IMP-1 に結合した 2 つの Zn(II) イオンが協同的に IMP-1 から解離したことが示唆された それゆえに 本研究で得られた K d は Eq. 3 の K d2 に対応すると考えられる また酸性領域で ph に対する-log K d のプロットの傾きが 4.0 であったことから プロトンが解離できるアミノ酸残基が Zn(II) イオンと結合していることがわかった もっともプロトン化されそうな残基は 2 つの Zn(II) イオンに配位している Zn1-OH 2 -Zn2 pk a が 5.97 である His のイミダゾールの Nδ pk a が 3.96 である Asp のカルボキシル基の Oδ1 または Oδ2 が考えられる IMP-1 の活性中心には 4 つの His と 1 つの Asp が Zn(II) イオンリガンドとして含まれている しかし遊離の Asp の Oδ1 または Oδ2 の pk a が 3.96 と 5.3 より低いことから IMP-1 に結合した Zn(II) イオンは His のイミダゾールの Nδが その pk a より低い ph でプロトン化されることで 酵素から放出されたと考えられる 過剰の Zn(II) イオン存在下 イミペネムの加水分解に対する log k cat は Fig. 9 で示すように ph に依存した Good buffer である MOPS と MES は Fitzgerald らが CcrA で報告したように これらの化合物が IMP-1 でも阻害したことから活性に影響が出たため使用しなかった 27 log k cat は ph が下がるにつれて減少したが ph 4 と 5 の間の傾きは 0.6 であった この触媒反応において 求核試薬は 2 つの Zn(II) イオンに架橋している Zn1-OH 2 -Zn2 であると予想される Fig. 9 のプロットから IMP-1 の加水分解機構に関与する官能基の pk a は 5 より低いと考えられる この架橋した水分子の pk a の値が低いことが MBL の特徴の 1 つである BcII と CcrA の活性中心は それぞれ Zn(II) イオンをそれぞれ 1 つ 2 つ含んでおり Zn1-OH 2 または Zn1-OH 2 -Zn2 の状態をとっていると考えられている 12, 16, 53 Mono-Zn(II) 酵素である human carbonic anhydrase II の Zn(II) イオンに配位している Zn-OH 2 の pk a は 6.8 であり 酵素に結合していない遊離な Zn-OH 2 イオンの pk a の 10 より低くなっている 59 また CcrA では

29 今回の研究と同様に ph 5 から 9 の間で pk a をもつ官能基はないと報告されている 22, 23 これらのことから Zn(II) イオンに配位した OH 2 の pk a は 2 つの Zn(II) イオンが架橋した Zn1-OH 2 -Zn2 の脱プロトン化を助けることで mono-zn(ii) 酵素より di-zn(ii) 酵素の方が低くなると考えられる 第 4 節小括 本章では MBL である IMP-1 の詳細な反応機構を理解するため IMP-1 からの Zn(II) イオン解離の ph 依存性と活性の ph 依存性について解析した 以下に得られた結果 を要約する (1) IMP-1 は酸性溶液中において Zn(II) イオンが解離することで活性が消失するこ とがわかった (2) IMP-1 からの Zn(II) イオンの解離は ph に依存しており Zn(II) イオンの解離に関 係する官能基は 4 つあり それらの pk a は 5.3 であることがわかった (3) IMP-1 活性の ph 依存性から ph 5 から 9 の間で pk a をもつ官能基は存在せず β- ラクタム環のカルボニル炭素を求核攻撃すると考えられている Zn1-OH 2 -Zn2 の架橋している水の pk a は 5 以下であることがわかった 以上の結果から IMP-1 において β-ラクタム環を求核攻撃する Zn1-OH 2 -Zn2 の架橋している水の pk a が 5 以下であることから 活性種は Zn1-OH - -Zn2 の状態であることがわかった しかし CcrA と同様の結果が得られたことから IMP-1 の詳細な反応機構の解明にはさらなる検討が必要である

30 第 3 章部位特異的変異法 速度論的解析 X 線結晶構造解析を用いた metallo-β-lactamase (IMP-1) の Asp120(81) の役割の検討 第 1 節序論 MBL の活性中心には必ず Asp120 が保存されているが その役割は詳細に解明されていない 前述したように MBL の活性中心にある Asp120 は 単核 Zn 酵素である BcII ではプロトンシャトルとして 複核 Zn 酵素である CcrA や L1 では Zn1-OH 2 -Zn2 の求核攻撃の方向付けを行なうアミノ酸として加水分解機構に関わっていると提案されている 12, 19, 20-23, 60 しかし複核 Zn 酵素の CcrA は 計算化学によって Asp120 と Zn(II) イオンに配位した Zn1-OH 2 -Zn2 のプロトン化状態が調べられ 第 1 章で述べた反応機構 (Fig. 5) とは違った Fig. 10 で示した反応機構を提案している 61, 62 S His His His H N C O O Zn1 H S N COO - H O H O Zn2 H O O Asp Cys His NO 2 NO 2 S His His His H C N O O Zn1 OH S N O 2 N COO - H O Cys H Zn2 H His O O Asp NO 2 Fig H 2 O S His O HN O OH H His O His H C N Zn1 S Zn2 H O O Asp O COO - 2 N Cys His alternately proposed mechanism of nitrocefin hydrolysis by di-zn(ii) MBL deduced from calculation chemistry (Merz et al.) 61, 62. NO

31 MBL であり複核 Zn 酵素である IMP-1 は 第 2 章の結果に示したように CcrA や L1 と同じような ph 依存性を示すことから それらと同じ反応機構であると考えられた しかし IMP-1 とニトロセフィンの前定常状態における反応において CcrA や L1 で見られるようなニトロセフィンのアニオン中間体が 665 nm 付近に観察できないことから IMP-1 の反応機構は CcrA や L1 よりもアニオン中間体へのプロトン化が速いか またはそれらとは別の反応機構である可能性が報告された 63 そこで 本研究は IMP-1 の Asp120(81) の詳細な役割を解明するために 1)IMP-1 の Asp120(81) を Ala または Glu に置換した酵素の調製 2)IMP-1 変異体の定常状態における速度論的パラメータ K m と k cat の算出 3)IMP-1 変異体のニトロセフィン加水分解活性の ph 依存性 4)IMP-1 変異体の前定常状態におけるニトロセフィンのアニオン中間体の検出を行い WT と同様に CcrA と L1 と IMP-1 変異体とを比較 検討することで MBL の活性中心に保存されている Asp120 の役割を詳細に解明することが目的である

32 第 2 節結果 2-1 Asp120(81) 変異体 D120(81)A および D120(81)E の構築 部位特異的変異法は pkf19k/imp を鋳型として Mutan Super TM Express Kit (TaKaRa) を使って行った IMP-1 変異体の CD スペクトルは 200 nm から 250 nm の間で WT の CD スペクトルと同じパターンを示したことから 変異による 2 次構造の変化はなかった D120(81)A と D120(81)E の Zn(II) 含量は原子吸光法により 酵素 1 分子当たりそれぞれ 2.2 と 2.3 であった 変異による Zn(II) イオンとの親和性の低下が期待されたが 大きな変化は見られなかった 2-2 IMP-1 変異体の基質加水分解に対する速度論的パラメータの決定 部位特異的変異による基質特異性と活性の変化を調べるため 基質としてセファロスポリン系のセファロリジンとニトロセフィン カルバペネム系のイミペネム ペニシリン系のベンジルペニシリンを用いて加水分解活性を測定した 結果を Table 2 に示す セファロリジンを基質としたとき WT に比べて D120(81)A と D120(81)E の k cat はそれぞれ 1/ /400 に減少し D120(81)A と D120(81)E の K m はそれぞれ 19 倍 34 倍に増加した イミペネムを基質としたとき WT に比べて D120(81)A と D120(81)E の k cat はそれぞれ 1/40 1/60 に減少し D120(81)A と D120(81)E の K m はそれぞれ 70 倍 14 倍に増加した ニトロセフィンを基質としたとき WT に比べて D120(81)A と D120(81)E の k cat はそれぞれ 1/60 1/1800 に減少し D120(81)A の K m はそれぞれ 1.5 倍に増加したが D120(81)E の K m は逆に 1/15 に減少した ベンジルペニシリンを基質としたとき WT に比べて D120(81)A と D120(81)E の k cat はそれぞれ 1/3900 1/

33 Table 2. Kinetic parameter for the hydrolysis of various β-lactam antibiotics by WT and the IMP-1 mutants, D120(81)A and D120(81)E. The concentration of added Zn(NO 3 ) 2 is 1 mm. ND indicates not determined. (A) WT Antibiotic k cat / min -1 K m / µm k cat / K m / µm -1 min -1 Cephaloridine 5400 ± ± ± 190 Imipenem 7400 ± ± ± 14 Nitrocefin ± ± ± 300 Benzyl penicillin ± ± ± 30 (B) D120A Antibiotic k cat / min -1 K m / µm k cat / K m / µm -1 min -1 Cephaloridine 0.21 ± ± ± ( added Zn 2+ ) 1.3 ± ± ± Imipenem 190 ± ± ± ( added Zn 2+ ) ND ND ND Nitrocefin 450 ± ± 3 17 ± 1.1 ( added Zn 2+ ) 250 ± ± ± 0.6 Benzyl penicillin 10.0 ± ± ± ( added Zn 2+ ) ND ND ND (C) D120E Antibiotic k cat / min -1 K m / µm k cat / K m / µm -1 min -1 Cephaloridine 14.0 ± ± ± ( added Zn 2+ ) 13.3 ± ± ± 0.13 Imipenem 122 ± ± ± 0.02 ( added Zn 2+ ) 220 ± ± ± 0.13 Nitrocefin 16 ± ± ± 1.3 ( added Zn 2+ ) 33 ± ± ± 5.3 Benzyl penicillin 32 ± ± ± ( added Zn 2+ ) ND ND ND に減少し D120(81)A と D120(81)E の K m はそれぞれ 10 倍 3 倍に増加した また Zn(NO 3 ) 2 を含む緩衝液中での速度論的パラメータは Zn(NO 3 ) 2 を含まないときと比べると ほとんどの場合に大きな差は見られなかった しかし D120(81)A D120(81)E のベンジルペニシリンに対する活性 (k cat と K m ) と D120(81)A のイミペネムに対する活性 (k cat と K m ) では Zn(NO 3 ) 2 の添加によって K m があまりにも大きかった

34 ため別々に求めることができなかった D120(81)A のイミペネムに対する活性と D120(81)A と D120(81)E のベンジルペニシリンに対する活性は 緩衝液中の Zn(NO 3 ) 2 による加水分解活性の方が 酵素のそれらより速かったため解析することができなかった これらのことから 120(81) 位の Asp を Ala Glu に変異させた酵素は ニトロセフ ィンを基質としたときの K m を除いて これら 4 種の基質に対して k cat は激減し K m は増加することによって 酵素活性が大きく低下した 2-3 IMP-1 変異体の基質加水分解活性に対する ph 依存性 第 2 章において IMP-1 は酸性溶液では Zn(II) リガンドがプロトン化されるため Zn(II) イオンが酵素から解離し 活性が消失することを明らかにした そこで IMP-1 変異体の Eq. 9 (p74 参照 ) で表される Zn(II) イオンの解離定数 K d を 酸性領域 (ph 4.4~5.6) で基質にニトロセフィンを使い Zn(II) イオン濃度を変化させ それぞれ得られた分子活性 k 2 から求めた (Table 3) D120(81)A と D120(81)E からの Zn(II) イオンの解離定数 K d は ph が減少するにつれて増加した また WT や D120(81)E の K d より D120(81)A の K d の方が全般的に大きかった (Table 1) Table 3. The dissociation constant of Zn(II) from WT and the IMP-1 mutants, D120(81)A and D120(81)E with concentration of Zn(II) determined using nitrocefin as the substrate. D120A D120E ph K d /µm k max /min -1 K d /µm k max /min ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

35 IMP-1 変異体からの Zn(II) イオンの解離定数 K d を得ることができたので 次に IMP-1 変異体の活性における ph 依存性をそれぞれの ph における K d の 25 倍量の Zn(NO 3 ) 2 の濃度で基質であるニトロセフィンの濃度を変えて測定した 使用した緩衝液は ph 4.0 から 5.6 において酢酸緩衝液 (0.2 M 0.5 M NaCl) ph 5.6 から 9.0 において MTEN 緩衝液であった ただし MTEN 緩衝液において Zn(NO 3 ) 2 濃度は D120(81)A では 40 µm D120(81)E では 20 µm とした ph に対する WT と IMP-1 変異体の log k cat のプロット は Fig. 11 に示した ph 4.8 以下でニトロセフィンが沈殿し出したことから k cat と K m は Lineweaver-Burk プロットから得た WT と D120(81)A の log k cat のプロットは 測定された ph では変化は見られなかった しかし D120(81)E に対するプロットでは ph が 5.2 から 9.0 の範囲でわずかに上昇していることがわかった さらに ph が 5.2 から 4.6 になるにつれて D120(81)E の log k cat が激減することがわかった これは第 3 節で考察する Fig. 11. ph Dependence plots for the hydrolysis of nitrocefin at 30 ºC for WT and the IMP-1 mutants, D120(81)A and D120(81)E. Data points were obtained in MTEN buffer (ph ) and acetic acid-sodium acetate buffer (ph ) in the presence of an excess of Zn(II) ion

36 2-4 WT と IMP-1 変異体の前定常状態におけるニトロセフィン加水分解 WT または D120(81)A と等量のニトロセフィンとの反応は ニトロセフィンの吸収 391 nm ニトロセフィンの加水分解物 491 nm ニトロセフィンアニオン中間体 650 nm の吸光度変化を stopped-flow で測定した 391 nm の吸収の減少と 491 nm の吸収の増加は ほとんど対称であり 650 nm の吸収増加はいずれも観察されなかった (data not shown) D120(81)A の反応時間は WT に比べて 1000 分の 1 だった A) B) Fig. 12. A) Pre-steady-state studies by stopped-flow for D120(81)E using nitrocefin as a substrate, product and intermediate were determined at 391, 491 and 650 nm respectively. B) rapid-scan studies for D120(81)E at 25 ºC. The spectra were collected with the following experimental parameters: center, 420 nm; scan range, nm; time interval, 2 s; number of spectra, 16. しかし D120(81)E では 391 nm の吸収の減少と 491 nm の吸収の増加は Fig. 12A で 示すように非対称であった ニトロセフィン生成物の増加 (491 nm) はニトロセフィン の減少 (391 nm) より速く終了しているように見えた これを理解するために 8 µm の

37 ニトロセフィンと 8 µm の D120(81)E を Tris 緩衝液 (50 mm, ph 7.4, 0.5 M NaCl, 3.23 % DMSO) で混合させ rapid-scan によって 2 秒毎にスペクトル測定を行った Fig. 12B で示すように 本来の 491 nm のニトロセフィン加水分解物の吸収の増大でなく 460 nm の吸収の増大が観察できた この 460 nm の化学種はニトロセフィンと D120(81)E を等量混合させたとき 少なくとも 50 分間は変化しなかった しかしながら 40 µm のニトロセフィンと 4 µm の D120(81)E の混合では 491 nm の吸収の増大が観察された そこでこの 460 nm の極大吸収をもつ化学種の本質を調べるために ニトロセフィン加水分解物を 0.2 M の塩酸で分光学的滴定を行った ニトロセフィン加水分解物への塩酸の滴下では ph が 2.3 に達した時 31 nm の blue shift を生じさせ 460 nm にモル吸光係数 ε 260 = 18,000 M -1 cm -1 である極大吸収が現れた (Fig. 13A) またニトロセフィンの加水分解物への D120(81)E の滴定では 491 nm の極大吸収が 460 nm の極大吸収に変化することがわかった (Fig. 13B) これらのことから 460 nm の化学種は D120(81)E に結合したプロトン化されたニトロセフィン加水分解物であることが明らかとなった A) B) Fig. 13. A) Spectrophotometric titration of nitrocefin with 0.2 M HCl. B) Spectra change of the nitrocefin hydrolysis product with D120(81)E

38 2-5 D120(81)A と D120(81)E の X 線結晶構造解析 D120(81)A と D120(81)E の結晶構造は 既知である IMP-1- 阻害剤複合体 (PDB file, 1DD6) の IMP-1 構造を基にして分子置換法により決定した 42 両方とも空間群は P1 で 結晶格子に 4 つの独立した構造 A B C D が存在していた 収集したデータと精密化データは Table 4 でまとめた D120(81)A と D120(81)E の構造は それぞれ 2.0 Å と 3.0 Å で R working 21.2 % と 22.4 % R free 21.8 % と 29.5 % で精密化できた Table 4. X-ray data collection and structure refinement. D120(81)A D120(81)E A. Data collection statistics Unit cell parameter a (Å) b (Å) c (Å) α (deg) β (deg) γ (deg) Space group P1 P1 Molecules / asymmetric unit 4 4 Resolution (Å) (outer shell) ( ) ( ) No. observed reflections No. unique reflections Overall completeness (%) (outer shell) 94.5 (67.4) 85.7 (62.3) R sym (%) (outer shell) 6.0 (18.1) 5.8 (11.9) B. Refinement statistics R working (%) R free (%) rms deviation from ideal Bonds (Å) Angles (deg.) R sym = I-<I> / I R working = F o - F c / F o, where F o and F c are the observed and calculated structure factors, respectively. The R free was determined from 5 % of the data

39 IMP-1 変異体の全体構造は MBL によく保存されているαβ/βαドメインで構成されており WT の構造とほとんど同じであった D120(81)A の 4 分子について以下のようなアミノ酸残基の位置を決定した :molecule A, Ser38(3)-Val61(25) と Gly65(29)-Lys298(221) ; molecule B, Ser38(3)-Val61(25) と Gly65(29)-Lys298(221) ; molecule C, Ser38(3)-Val61(25) と Val66(30)-Lys298(221);molecule D, Ser38(3)-Asn62(26) と Gly65(29)-Lys298(221) 一方 D120(81)E の 4 分子は以下のようなアミノ酸残基が含まれていた :molecule A, Leu39(4)-Asn62(26) と Val66(30)-Ser297(220);molecule B, Leu39(4)-Asn62(26) と Gly65(29)-Glu296(219) ; molecule C, Ser38(3)-Gly63(27) と Val66(30)-Glu296(219);molecule D, Ser38(3)-Gly63(27) と Gly65(29)-Glu296(219) 上記以外のアミノ酸残基は disorder していた D120(81)A と D120(81)E の単位胞に含まれている非対称な 4 つの独立した構造の C-αの重ね合わせは それぞれ 0.23 Å と 0.49 Å の root mean square deviations (r.m.s.d.) を与えた IMP-1 変異体 ( それぞれの molecule A を選んだ ) と WT の C-αは WT で disorder していた 62(26)-65(29) を除いて重ね合わせられ WT と D120(81)A の間で 0.35 Å の r.m.s.d WT と D120(81)E の間で 0.56 Å の r.m.s.d. が得られた IMP-1 変異体と WT との間で 1 Å 以上動いたアミノ酸残基は以下の通りである ;D120(81)A, Glu50(14)(1.8 Å), Val61(25)(1.1 Å), Glu210(150)(1.1 Å), His263(197)(1.2 Å) ;D120(81)E, Asp49(13)(1.1 Å), Glu50(14)(2.2 Å), Val61(25)(2.1 Å), Pro68(32)(1.0 Å), Val76(40)(1.2 Å), Asp77(41)(1.2 Å), Lys186(129)(1.0 Å), Ile187(130)(1.1 Å), Glu210(150)(1.1 Å), His263(197)(1.3 Å), Glu296(219)(1.5 Å), Ser297(220)(2.9 Å) IMP-1 変異体と WT の活性中心部位の構造を Fig. 14 に Zn(II) イオン-ligand 距離を Table 5 に示した D120(81)A の活性中心は 1 つの Zn(II) イオンだけしか観察できず His116(77) His118(79) His196(139) と酢酸イオンの 2 つの酸素原子が配位していた (Fig. 14B) Zn2 に対応する位置に球の電子密度は観測できなかったが Cys221(158) が酸化された cysteine-s-dioxide に対応した三角錐の電子密度が観測された

40 Table 5. Comparison of Zn(II)-ligand distance for WT and the IMP-1 mutants D120(81)A and D120(81)E. WT D120(81)A D120(81)E Distance (Å) Zn1 His116(77) ± ± 0.17 Zn1 His118(79) ± ± Zn1 His196(139) ± ± 0.15 Zn1 ACY_OXT ± ± Zn1 ACY_O 2.4 ± 0.27 Zn1 Asp120(81)Oδ1 (Glu120(81)Oε1) ± 0.58 Zn2 Asp120(81)Oδ2 (Glu120(81)Oε2) ± 0.18 Zn2 Cys221(158) ± 0.18 Zn2 His263(197) ± 0.16 Zn2 ACY_OXT ± 0.35 Zn2 Asp120(81)Oδ1 (Glu120(81)Oε1) ± 0.30 Zn1 Zn ± The deviations in the distance arise from the average Zn(II)-ligand distance of molecules A, B, C, and D in the structures of the IMP-1 mutants. D120(81)E の活性中心は 2 つの Zn(II) イオン (Zn1 と Zn2) を含んでいた Zn1 には His116(77) His118(79) His196(139) が配位し Zn2 には Glu120(81) Cys221(158) His263(197) と酢酸イオンの 1 つの酸素原子が配位していた (Fig. 14C) CcrA で見られるような 2 つの Zn(II) イオンに架橋している OH 2 または OH - や Zn2 に配位している水分子は両変異体の活性中心には見られなかった WT において WT の 3 次元構造では CcrA のように 2 つの Zn(II) イオンに架橋している OH 2 または OH - は観察できなかったが Asp120(81)Oδ1 は OH 2 または OH - に水素結合を経由して結合していると考えられている しかしながら D120(81)E において Glu120(81)Oε1 から Zn1 または Zn2 への距離はそれぞれ 2.5 ± 0.6 Å と 2.5 ± 0.3 Å であった (Table 5) それ故に この酸素原子は Fig. 14C で示すように 2 つの Zn(II) イオンに架橋して配位していると考えられ

41 る さらに D120(81)E の Zn1 と Zn2 の間の距離は 3.6 ± 0.1 Å で WT より 0.3 Å 長くな っていることがわかった(Table 5) A) B) C) Fig. 14. Comparison of the active site of WT (A) and the IMP-1 mutants D120(81)A (B) and D120(81)E (C). The calculated stereoscopic 2 Fo - Fc maps (magenta) are represented at 1.5 and 1.0 δ levels for (B) and (C), respectively. Zn(II) ions and a water molecule are represented by green and red spheres, respectively. Amino acid residues are displayed as sticks (carbon, oxygen, nitrogen, and sulfur atoms colored in gray, red, blue and yellow, respectively). In WT, a bridging OH2 or OHis not observed

42 2-6 アニオンによる D120(81)A の阻害と阻害に対するアニオン依存性 D120(81)A はリン酸緩衝液を使ったカラムクロマトグラフィーによる精製のあとに リン酸イオンによって阻害されることがわかった そこで WT と IMP-1 変異体のリ ン酸イオンによる影響を調べた リン酸イオン濃度に対する WT と IMP-1 変異体の相 対活性は Fig. 15 で示した 50 mm のリン酸イオン濃度で WT の活性は 30%減少した が D120(81)E の活性は 30%上昇した D120(81)A に対するリン酸イオンの阻害活性 は 酵素に競合的にリン酸イオンが阻害することがわかった vinit = v0,init/(1 + [phosphate]/ki) Eq. 7 v0,init は阻害剤がないときの初速度を表している Fig. 15. Plots of relative activity of nitrocefin hydrolysis by WT and the IMP-1 mutants D120(81)A and D120(81)E against the concentrations of phosphate ion at 30 ºC

43 阻害定数 K i は WT と D120(81)A に対してそれぞれ 144 mm と 0.32 mm が得られた さらに他のアニオンの効果を調べるため Tris 緩衝液 (50 mm, ph 7.4, 0.5 M NaCl) に NaClO 4 Na 2 SO 4 K 3 [Co(CN) 6 ] K 4 [Fe(CN) 6 ] を含めて D120(81)A の加水分解活性を測定した また D120(81)A は 100 µm Zn(NO 3 ) 2 共存下でリン酸イオンの効果を調べた D120(81)A の活性は [Co(CN) 6 ] 3- (K i = 1.1 mm) [Fe(CN) 6 ] 4- (K i = 4.0 mm) で阻害されたが ClO - 4 と SO 2-4 では阻害されなかった さらに 100 µm Zn(NO 3 ) 2 共存下における D120(81)A のリン酸イオンによる阻害は K i = 1.8 mm と抑制されることがわかった 第 3 節考察 今回の研究で すべての MBL の活性中心に保存され 酵素活性に重要な役割を担っていると考えられている Asp120 の機能を詳細に解析した IMP-1 の Asp120(81) を部位特異的変異法で Ala と Glu に置換し それぞれ D120(81)A と D120(81)E を調製した それらを精製し分光学的 速度論的解析および X 線結晶構造解析によって特徴付けした Asp120(81) から Ala または Glu への変異は CD スペクトルによると WT と比べて 2 次構造に変化は見られず さらに原子吸光法により 2 つの Zn(II) イオンがそれぞれの酵素中に保持されていることがわかった 定常状態での活性における Asp120(81) から Ala または Glu への置換の影響を 基質として 4 つのβ-ラクタム剤を使い速度論的に解析した Table 2 に示すように D120(81)A と D120(81)E の活性 (k cat と K m ) は基質に依存するが k cat では 倍減少し K m では数倍から 10 2 倍増加した結果 激減したことがわかった Haruta らは Zn(II) リガンドである His116(77) His118(79) His196(139) の Ala 置換体は WT に比べると活性は減少したが これは Zn(II) イオンの欠損によると報告した 64 そこで D120(81)A と D120(81)E は過剰量の Zn(II) イオン存在下で活性を測定したが 活性は回復しなかった これらの結果から MBL の Asp120 は臨床で広く使われているβ-ラクタム剤の

44 加水分解反応に重要な役割を担っていることを示唆した また IMP-1 変異体の K m の上昇は Asp120 は基質結合にも重要であることを示した 小さい K m を示した WT および IMP-1 変異体とニトロセフィンとの結合は IMP-1 の基質結合部位に含まれる疎水環境と基質の dinitrophenyl 基との疎水性相互作用と考えられる Wang らは複核 Zn 酵素である CcrA のニトロセフィンの加水分解で 665 nm に一過性の吸収を持ったニトロセフィンのアニオン中間体が生成することを報告した また複核 Zn 酵素の L1 でも同じような変化が観察された 60 Moali らはこの中間体は複核 Zn 酵素の IMP-1 では蓄積されないことを報告した 63 そこで本研究で基質をニトロセフィンとして前定常状態で D120(81)A および D120(81)E の加水分解過程にニトロセフィンのアニオン中間体が検出できるかどうか測定した しかしながら WT と IMP-1 変異体では 650 nm の吸収に一過性の増加は観測されなかった (Fig. 12A) Kaminskaia らは MBL をモデルとした di-zn(ii) 錯体が 80% DMSO で 640 nm にニトロセフィンのアニオン中間体が生成したことを報告した 65 WT と IMP-1 変異体において前定常状態で緩衝液のグリセリン濃度を 80% まで上げてニトロセフィンの加水分解を測定したが 650 nm に一過性の吸収の増大は見られなかった これらの結果から WT のニトロセフィン加水分解の律速段階は 650 nm に吸収をもつアニオン中間体の形成なく進むことがわかった これは IMP-1 の Asp120(81) はアニオン中間体へのプロトンドナーでないことが考えられ 中間体の蓄積がないことは 中間体にプロトンを輸送する他の経路があるのか または IMP-1 は他の反応機構で進むことが考えられる D120(81)E のニトロセフィンの前定常状態の実験では奇妙な結果が得られた (Fig. 12A) 391 nm のニトロセフィンの吸収の減少と 491 nm のニトロセフィン加水分解物の吸収の増加が対称でなく 460 nm に極大吸収をもつ化学種が現れた (Fig. 12B) この化学種はニトロセフィンと D120(81)E が等モルの反応ではかなり安定であった Bicknell らは BcII で-58 ºC 以下の温度で 450 nm に極大吸収をもつ中間体の検出を報告

45 した 66 本研究で見つかった 460 nm に極大吸収をもつ化学種はおそらく Bicknell らが報告したものと同じである ニトロセフィン加水分解物の可視吸収は dinitrophenyl 置換基を含む共役系由来である 491 nm より短波長の吸収は 共役系の減少によることが考えられる これはニトロセフィン加水分解物へ塩酸への分光学的滴定によって支持された (Fig. 13A) 460 nm に極大吸収をもつ化学種は D120(81)E のみに起こり おそらく D120(81)E へニトロセフィン加水分解物再結合に由来するものと考えられる (Fig. 13B) この現象の 1 つの理由は Fig. 14 の X 線結晶構造解析の結果から Asp120(81) のカルボキシル基の位置と向きが Glu120(81) のカルボキシル基のそれらと比べて移動しているためと考えられる IMP-1 の加水分解機構における Asp120(81) の役割を調べるために 基質をニトロセフィンとして加水分解の ph 依存性を測定した 第 2 章第 2 節 2-1 で IMP-1 はホロ酵素から Zn(II) イオンの脱離の結果として酸性溶液中では活性が消失することを報告した そのため IMP-1 変異体の ph 依存性を調べる前に IMP-1 変異体酵素から Zn(II) イオンの解離定数 K d を調べた (Table 3) IMP-1 変異体の ph 依存性は K d の 25 倍の Zn(NO 3 ) 2 を加えて行った WT と D120(81)A に対する log k cat は ph 4.6 と 9.0 の間ではほとんど変化がなかったが D120(81)E の log k cat は ph が 5.2 から 9.0 に上昇すると 10 2 倍増加した (Fig. 11) これらの結果は Asp120(81) は Zn1-OH 2 -Zn2 の架橋している水の pk a を下げる要因ではないことを示し 2 つの Zn(II) イオンの正電荷が Zn1-OH 2 -Zn2 の架橋している水の pk a を下げる原因であると考えられる これらの結果は Yanchak らが報告した CcrA の Asp120 変異体 D120(103)C や Garrity らが報告した L1 の Asp120 変異体 D120(88)C と D120(88)S の ph 依存性の研究で 2 つの Zn(II) イオンに架橋している水分子 (Zn1-OH 2 -Zn2) の pk a は 5.0 以下であるという結果からも支持された D120(81)E の log k cat は ph が 5.2 から 4.6 に減少するにしたがって減少した (Fig. 11) しかし現在のところこの pk a に関する残基の同定には至っていない IMP-1 変異体の速度論的解析で奇妙な結果が得られたことから IMP-1 変異体の結

46 晶を調製して X 線結晶構造解析を行い詳細な検討を行った IMP-1 変異体では 活性中心の部分的な構造は変化したが 全体構造は Asp120(81) に変異をかけたにもかかわらず保存されていた IMP-1 変異体のアミノ酸 62(26)-65(29) のフラップ領域は WT と同様に disorder していた WT と IMP-1 変異体の C-αの重ね合わせで それぞれの C-α に対する r.m.s.d. が調べられた r.m.s.d. が 1 Å 以上動いた残基は Asp49(13) Glu50(14) Val61(25) Pro68(32) Val76(40) Asp77(41) Lys186(129) Ile187(130) Glu210(150) であったが これらは溶媒に曝されたヘアピンループに位置していた また Glu296(219) と Ser297(220) は C 末端に位置していた 興味深いことに His263(197) の C-α 原子は D120(81)A と D120(81)E の構造において WT と比べるとそれぞれ 1.2 Å と 1.3 Å ずれていることがわかった Fig. 16. Superposition of the active site of WT and the IMP-1 mutants, D120(81)A and D120(81)E. WT, D120(81)A and D120(81)E are shown in gray, red and blue, respectively

47 さらに D120(81)E の Zn-Zn 距離が WT と比べると 0.3 Å 長くなっていることもわかった (Table 5) His263(197) はすべての MBL の活性中心に Zn2 リガンドとして保存されている Suárez らと Oelschlaeger らはそれぞれ基質と docking させた CcrA と IMP-1 を使って molecular dynamics シミュレーションで Zn-Zn 距離がそれぞれ Å Å 増加することを報告している 62, 67 これは His263(197) がある程度の柔軟性をもち この柔軟性が Zn-Zn 距離を増加させている可能性を示唆している D120(81)A と WT の活性中心を比較した WT の活性中心には 2 つの Zn(II) イオンが含まれていたが D120(81)A の活性中心には原子吸光法では 1 酵素あたり 2 個含まれていたにも関わらず 構造解析からでは 1 個しか含まれていなかった (Fig. 14B) これはおそらく結晶成長に時間がかかったため 結晶化溶液中の過剰の酢酸イオンのキレート作用により Zn2 が脱離し フリーの Cys221(158) の硫黄原子が酸化され SO 2 になった結果 Csw221(158) が生じ これが Zn2 部分に埋まっていたと考えられた Zn1 は 3 つの His と酢酸イオンの 2 つの酸素原子が bidentate で配位しており 水分子は配位していなかった (Fig. 14B) これらの結果は 120(81) 位の Asp から Ala への置換により Zn(II) イオンの正電荷が上昇したためと考えられ この正電荷の増加は リン酸イオンによる D120(81)A の活性阻害に関連していることが考えられる D120(81)E の活性中心は WT のように 2 つの Zn(II) イオンを含んでいたが 配位環境が WT と全く異なっていた (Figs. 14A, B) WT の Asp120(81)Oδ1 は CcrA のように架橋した Zn1-OH 2 -Zn2 または Zn1-OH - -Zn2 に水素結合し Zn1 には配位していないと考えられる しかし D120(81)E では Glu120(81)Oε1 は Zn1-Glu120(81)Oε1 と Zn2- Glu120(81)Oε1 の距離がそれぞれ 2.5 ± 0.6 Å と 2.5 ± 0.3 Å であることから Glu120(81)Oε1 は 2 つの Zn(II) イオンに架橋して配位していると考えられる (Fig. 14C) D120(81)E の Zn-Zn 距離は 3.6 ± 0.1 Å であり WT (3.3 Å) より 0.3 Å 長かった (Table 5) これは D120(81)E の構造では 2 つの Zn(II) イオンに架橋している水分子 (Zn1-OH 2 -Zn2) は disorder しているため Zn2 とは架橋できずに Zn1-OH 2 になり また Glu の酸素原

48 子が Zn(II) イオンの正電荷を抑えたことから Zn1-OH 2 から H + の解離が抑制されたことが示唆された この配位環境は D120(81)E の ph 依存性の実験において 2 つの Zn(II) イオンに架橋できなくなったため Zn1 に配位した Zn1-OH 2 の pk a が増加したことから支持される D120(81)A は基質としてニトロセフィンを使った時 リン酸イオンによって強く阻害された (Fig. 15) この阻害は WT では弱かった 120(81) 位の Asp を Ala に置換したことは 活性中心の正電荷を上昇させ Zn(II) イオンの正電荷の増大と考えられる その結果 活性中心へのリン酸イオンの結合により基質結合の低下が生じ阻害されたと考えられる 実際にこの阻害様式は拮抗阻害として解析され 阻害定数 K i は WT では 144 mm D120(81)A では 0.32 mm であったことからもリン酸イオンは活性中心へ結合することが強く示唆された D120(81)A 阻害に対するいくつかのアニオンの影響が評価したが ClO - 4 SO 2-4 は影響を受けず [Co(CN) 6 ] 3- と [Fe(CN) 6 ] 4- は K i がそれぞれ 1.1 mm と 4.0 mm であった また Zn(II) イオン存在下で D120(81)A のリン酸イオンによる影響を検討すると阻害が抑制された これらの結果から リン酸イオンによる D120(81)A の強い阻害は活性中心からキレート作用によって Zn(II) イオンが抜き取られた後に起こると考えられる アニオンは活性中心の正電荷が上昇したことで 活性中心に結合できるようになった

49 第 4 節小括 本章では すべての MBL の活性中心に保存されている Asp120 の詳細な役割を調べ るために IMP-1 の Asp120(81) 変異体を調製し 速度論的解析 X 線結晶構造解析を 行った 以下に得られた結果を要約した (1) IMP-1 の Asp120(81) は IMP-1 変異体の定常状態における速度論的研究において k cat が激減し K m が増大したことから 触媒活性 基質認識に重要であることが わかった (2) IMP-1 の Asp120(81) は IMP-1 変異体の活性の ph 依存性において ニトロセフィ ンのアニオン中間体へのプロトンドナーとして またはプロトンシャトルとして 働かないことがわかった (3) IMP-1 の加水分解機構は 他の MBL である CcrA や L1 のようにニトロセフィンを使った前定常状態における速度論的研究で ニトロセフィンのアニオン中間体が検出できなかったことから アニオン中間体へのプロトンの移動が容易であると考えられる (4) D120(81)E の X 線結晶構造解析から Asp120(81) の Zn2 に配位していないカルボ キシル基の酸素原子は 2 つの Zn(II) イオンを架橋している OH 2 または OH - と水素 結合することが 触媒活性にとって必須であることがわかった 以上の結果から Asp120 の重要な役割は β- ラクタム環のカルボニル炭素を求核攻 撃するために 2 つの Zn(II) イオンを架橋している OH 2 または OH - の方向付けをする ことであり また Zn(II) イオンと His263 の位置づけに重要であることがわかった

50 第 3 章 3-(3-Mercaptopropionylsulfanyl)propionic acid pentafluorophenyl ester による metallo-β-lactamase (IMP-1) の非可逆的阻害 第 1 節序論 MBL 阻害剤の開発は 現在使用しているβ-ラクタム剤だけでなくβ-lactamase の出現で使用されなくなった安価なβ-ラクタム剤も臨床の場に復活させることができるため 医療経済の高騰を抑制できる効果がある そのため世界中で MBL 阻害剤の開発が行なわれているが MBL の基質認識機構が詳細に解明されていないことなどから Phase I に移った MBL 阻害剤は未だない Goto らは 1997 年に簡単なチオール化合物が MBL である IMP-1 を阻害することを報告し 26 Jin ら 34 はチオール基を有する MBL 阻害剤を設計 合成し IMP-1 に対し阻害活性があることを報告した この阻害効果は Concha らが 2000 年に報告した IMP-1 とメルカプト酢酸化合物複合体の X 線結晶構造解析の結果から チオール基は IMP-1 の 2 つの Zn(II) イオンに架橋して配位していることがわかった 42 しかしこれまでに MBL 阻害剤が数多く報告されているが いずれも可逆的な阻害であった そこで本研究では非可逆的阻害剤の開発を行なった 非可逆的阻害剤の合成戦略を Fig. 17 に示す Fig. 17 に示すように 1) チオール基を IMP-1 の 2 つの Zn(II) イオンへの架橋配位子として用いる 2) ほとんどすべての MBL に保存されている活性中心近傍の Lys224 残基により求核攻撃を受け 共有結合を形成させるための良い脱離基を有した活性エステルを導入する その結果チオールの Zn(II) イオンへの配位と酵素中のアミノ酸残基との共有結合生成による 2 箇所の相互作用で IMP-1 の非可逆的阻害が達成されると考えた そこで 2 つの新規阻害剤 Pentafluorophenyl 3-mercaptopropionate (PFMP, 1) と 3-(3-Mercaptopropionylsulfanyl) propionic acid pentafluorophenyl ester (MPAP, 2) を設計 合成し

51 (Fig. 18) それらの阻害様式を調べるために 1) 新規阻害剤による IMP-1 阻害の時間依存性 2) 新規阻害剤の非可逆的阻害の検討 3) 新規阻害剤と IMP-1 複合体の X 線結晶構造解析を行なうことが目的である good leaving group His His Zn1 R O X S - :Nζ-Lys224 O Cys H 2 O Zn2 His His Zn1 Nζ-Lys224 O X Cys S - Zn2 H 2 O His - O O His His - O O His Asp Asp Fig. 17. Strategy for the irreversible inhibition of thiol compounds with a good leaving group. O F F O O F F HS O F HS S O F F F PFMP (1) MPAP (2) F F Fig. 18. Chemical structures of inhibitors used in this study

52 第 2 節結果 2-1 新規阻害剤の IMP-1 に対する阻害能 3-メルカプトプロピオン酸 (3-MPA) の阻害定数 K i は可逆的な阻害として 1.2 µm であり 26 3-MPA から誘導 合成した非可逆的阻害剤はそれよりも強い阻害を示す事が期待された そこで新規阻害剤の IMP-1 に対する阻害能を検討するために 新規阻害剤の IMP-1 阻害 (PFMP では 1-10 µm MPAP では µm) に対する時間依存性と濃度依存性を調べた 10 nm の IMP-1 を 所定の濃度の阻害剤を含む Tris 緩衝液 (50 mm, ph 7.4, 0.5 M NaCl) 15 o C でインキュベートした後 所定の時間毎に混合液を抜き取 り ニトロセフィンの加水分解活性 k 2 を求めた インキュベート時間 t における k 2,t の k 2,0 ( コントロールの平均 ) に対する残存活性 (k 2,t /k 2,0 ) の自然対数のプロットは 直線になったことから 見かけの不活化の速度定数は疑 1 次反応に従っていることがわかった (Fig. 19A, B) 得られた直線の傾き(k obs ) の逆数は阻害剤濃度の逆数に対して Kitz and Wilson プロット 68 したところ正の y 切片をもった直線を得ることができた (Fig. 19C, D) IMP-1 に対する PFMP と MPAP の活性消失速度定数 k inact と阻害定数 K i は Kitz and Wilson プロットから求められ それぞれの値は PFMP では ± s -1 と ± µm MPAP では ± s -1 と ± µm であった これらの結果から MPAP の 2 次速度定数 k inact /K i は PFMP の 9 倍であった 2-2 ゲルろ過法による非可逆阻害性の検討 合成した阻害剤は IMP-1 を阻害することが分かった 次にこれらの阻害剤が非可 逆的に IMP-1 を阻害するかどうかをゲルろ過法により検討した 100 µm の阻害剤共存下 氷中で一定時間 10 µm の IMP-1 をインキュベートした後

53 Fig. 19. Time- and concentration-dependent inactivation of IMP-1 by PFMP (A) and MPAP (B), in 50 mm Tris-HCl-0.5 M NaCl buffer (ph 7.4) at 15 ºC. Inhibition concentrations: ( ) 1 µm; ( ) 2 µm; ( ) 5 µm; ( ) 10 µm for PFMP and ( ) 0.07 µm; ( ) 0.2 µm; ( ) 0.5 µm; ( ) 0.75 µm for MPAP. Each point shown represents the mean of three experiments. Double reciprocal plots of k obs versus concentration of PFMP (C) and MPAP (D). Sephadex G-25 カラム (φ 8 mm 200 mm) によるゲルろ過を行い 遊離の阻害剤を IMP-1 から分離した 得られた IMP-1 分画についてニトロセフィンを基質として活性測定を行った コントロールとして阻害剤溶液の代わりにメタノールを用いた インキュベート時間 t における k 2,t の k 2,0 ( コントロールの平均 ) に対する相対値 (k 2,t /k 2,0 ) を インキュベート時間に対してプロットした 得られたプロットを Fig. 20 に示す コントロールでは ゲルろ過後の IMP-1 の加水分解活性は ゲルろ過前における加水分解活性の値と同値を示した 可逆的阻害剤である 3-MPA で処理した IMP-1 の活性は インキュベート直後のゲルろ過後でもほぼ 100 % の回復が見られた しかし合

54 成した阻害剤は インキュベート直後で既に IMP-1 の加水分解活性をほぼ 100% 非可逆的に阻害した また ゲルろ過により得られた PFMP 処理 IMP-1 を一晩 4 o C で保存した後 加水分解活性を測定した 3-MPA ではゲルろ過後 約 80% の IMP-1 の活性が回復した 一方 PFMP および MPAP ではインキュベート直後においても Fig. 20 に示すように PFMP ではほぼ 90% MPAP ではほぼ 100% 活性の回復は見られなかった さらに 12 時間においても活性の回復は観察されなかった Fig. 20. Plots of the relative activity of IMP-1 recovered by gel filtration against incubation time treated with or without PFMP and MPAP at 0 ºC., without inhibitor;, 3-MPA;, PFMP,, MPAP. Activity was measured by the hydrolysis of nitrocefin at ph 7.4 and 30 ºC. The experimental points represent the averages of three independent experiments

55 2-3 透析法による非可逆阻害性の検討 透析法を使って新規阻害剤の非可逆阻害性についても検討した 250 µm の新規阻害剤と 50 µm の IMP-1 を Tris 緩衝液 (50 mm, ph 7.4) 中 0 o C で 30 分間インキュベートし 4 o C で 16 時間透析をした 4 時間ごとに緩衝液交換を行った コントロールは阻害剤の代わりにメタノールを加え同条件下で行った コントロールの IMP-1 の残存活性は 95% 以上あったが 阻害剤で処理された IMP-1 の残存活性は回復しなかった この結果は先のゲルろ過法のそれらと一致した 2-4 阻害剤処理 IMP-1 のレーザーイオン化質量分析装置 (MALDI-TOF MS) による 分子量測定 合成した阻害剤は いずれも IMP-1 を強く かつ非可逆的に阻害した 阻害様式を詳しく検討するため MALDI-TOF MS 測定を行った MALDI-TOF MS では IMP-1 と阻害剤が共有結合すると それに対応した分子量の和が得られる 10 µm の IMP-1 と 100 µm の阻害剤を氷中で 30 分間インキュベートした IMP-1- 阻害剤混合溶液をゲルろ過し 遊離の阻害剤を除去し 活性の減少を確認して MALDI-TOF MS 測定を行った また コントロールにはメタノール溶液を用いて 10 分間インキュベートしたものを同様の操作により MALDI-TOF MS 測定を行った それぞれ得られた MS スペクトルをそれぞれ Fig. 21 に示す IMP-1 のみでは m/z = に 1 つのピークが見られた このピークは IMP-1 のアミノ酸配列から計算される分子量 に一致した PFMP MPAP で処理した IMP-1 では m/z = と にそれぞれ大きなピークが見られた (Fig. 21) この値は IMP-1 に 3-メルカプトプロピオニル基 (S-CH 2 -CH 2 -CO- = 1-P と表す, MW = 88.13) と 3-(3- メルカプトプロピオニルスルファニル ) プロピオニル基

56 (S-CH 2 -CH 2 -S-CO-CH 2 -CH 2 -CO- = 2-P と表す, MW = 176.9) が IMP-1 の分子量の m/z = に結合することにより計算される分子量と一致した これらから IMP-1 と 2 つの新規阻害剤は 1 対 1 で共有結合を介して IMP-1 と結合していることがわかった a.i 400 [M+X+H] + = PFMP (A) a.i 600 MPAP [M+Y+H] + = (B) m/z 400 Calibration m/z Fig. 21. MALDI-TOF MS spectrum of 10 µm IMP-1 after treatment with 100 µm PFMP (A) and MPAP (B) for 10 min at 30 ºC, followed by gel filtration

57 2-5 MPAP で処理した IMP-1 の X 線結晶構造解析 これまでの結果より 考案した非可逆的阻害剤は IMP-1 に対し強い阻害を示し 1 対 1 で反応して非可逆的に阻害していることがわかった この非可逆的阻害剤の共有結合部位のアミノ酸残基の特定および阻害機構をより詳しく解明するために 阻害剤 (MPAP) で処理した IMP-1 の結晶を調製し X 線結晶構造解析を行った MPAP で処理した IMP-1(2-P-IMP-1) 複合体の結晶構造は 分解能が 2.6 Å 空間群 P で結晶格子に 2 個の独立した構造 (molecules A and B) が存在していた 構造の精密化により得られたデータを Table 6 でまとめた 2-P-IMP-1 複合体の構造は それぞれ R working 22.8% R free 24.3% で精密化できた Table 6. Data collection and refinement statistics. A. Data collection statistics Unit cell parameter a (Å) 50.0 b (Å) 53.3 c (Å) Resolution (Å) (outer shell) ( ) Space group P Molecules / asymmetric unit 2 No. observed reflections No. unique reflections Overall completeness (%) (outer shell) 98.5 (97.4) R sym (%) (outer shell) 6.2 (19.8) I/σ(I) (outermost shell) 43.2 (13.1) B. Refinement statistics R working (%) 22.8 R free (%) 24.3 rms deviation from ideal Bonds (Å) Angles (deg.) 1.20 a R sym = Σ I-<I> /ΣI b R working = Σ F o - F c /Σ F o, where F o and F c are the observed and calculated structure factors, respectively. c The R free was determined from 5 % of the data

58 2-P-IMP-1 複合体の全体構造と活性中心は Fig. 22 で示した IMP-1 複合体の 3 次元構造は native の IMP-1 と同様にαβ/βαのサンドイッチ構造をとり 阻害剤が結合したことによる 3 次元構造の崩壊は見られなかった (Fig. 22A) Molecules A と B の C-αの重ね合わせから r.m.s.d. が 0.31 Å であった 2-P-IMP-1 複合体の活性中心および Phe58(22) から Val67(31) のアミノ酸残基から構成されるフラップと呼ばれる部位の Trp64(28) が阻害剤に覆い被さるようにフラップ全体が移動していた (Fig. 22A) Zn(II) イオンとリガンドの距離と結合角を Table 7 と Table 8 に示す Table 7 Distances (Å) for the active site of 2-P-IMP-1 (Molecules A and B) Atom Distance (A) Distance (B) Zn1 - Zn His116 Nε His118 Nδ His196 Nε Inhibitor S Zn2 - Asp120 Oδ Cys221 Sγ His263 Nε Inhibitor S Table 8 Angles ( o ) for the active site of 2-P-IMP-1 (Molecules A and B) Ligand Metal Ligand Angle (A) Angle (B) His116 Nε2- Zn1 -His118 Nδ Zn1 -His196 Nε Zn1 -Inhibitor S His118 Nδ1- Zn1 -His196 Nε Zn1 -Inhibitor S His196 Nε2- Zn1 -Inhibitor S Asp120 Oδ2- Zn2 -Cys221 Sγ Zn2 -His263 Nε Zn2 -Inhibitor S Cys221 Sγ- Zn2 -His263 Nε Zn2 -Inhibitor S His263 Nε2- Zn2 -Inhibitor S

59 MPAP から pentafluorophenol 基が脱離した化合物 (2-P) のチオール基は 活性中心に存在する 2 つの Zn(II) イオンに架橋して配位していた また Zn2 の配位環境は CcrA で報告されるような歪んだ三角両錐型でなく 歪んだ四面体構造であった 阻害剤は 224(161) 位に存在する Lys の側鎖のアミノ基 (Nζ) とアミド結合していた また 阻害剤と Lys224 のアミド結合のカルボニル酸素原子が Asn233(167) の主鎖の窒素原子と チオエステル部位のカルボニル酸素が Asn233(167) の側鎖の窒素原子と水素結合していた (Fig. 22B) A) B) Fig. 22. A) The overall structure of IMP-1 in complex with 2-P. α-helices, β-strands, and loops are in red, green, and yellow, respectively. Zn(II) ions are represented as orange spheres. Inhibitor and Lys224 are displayed as sticks (carbon, nitrogen, oxygen, and sulfur atoms colored in grey, blue, red, and green, respectively). B) The crystal structure of IMP-1 modified by 2-P. The electron density of Lys224 and its covalently attached inhibitor molecule is shown countoured at 3.0σ in a 2 F o F c map