Angliavandenių įtaka kultūrinių kriaušių mikroūglių užsigrūdinimui žemoje teigiamoje temperatūroje

LIETUVOS AGRARINIŲ IR MIŠKŲ MOKSLŲ CENTRO FILIALO SODININKYSTĖS IR DARŽININKYSTĖS INSTITUTO IR LIETUVOS ŽEMĖS ŪKIO UNIVERSITETO MOKSLO DARBAI. SODININKYSTĖ IR DARŽININKYSTĖ. 2011. 30(3 4). Angliavandenių įtaka kultūrinių kriaušių mikroūglių užsigrūdinimui žemoje teigiamoje temperatūroje Vanda Lukoševičiūtė, Gražina Stanienė, Asta Blažytė, Audrius Sasnauskas, Dalia Gelvonauskienė, Danas Baniulis, Rytis Rugienius Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialas Sodininkystės ir daržininkystės institutas, Kauno g. 30, LT-54333 Babtai, Kauno r., el. paštas v.lukoseviciute@lsdi.lt Tyrimai atlikti Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro Sodininkystės ir daržininkystės instituto Sodo augalų genetikos ir biotechnologijos skyriuje. Naudoti kriaušių (Pyrus sp.) veislių: Oranževoje, Hasselpear, Princesė Dagmara, Karalienė Jadvyga, Senryo, Koncentrat, ir hibrido Nr. 0408 mikroūgliai. Tyrimais nustatyta, kad grūdinant (inkubavus žemoje teigiamoje temperatūroje) tirtų monosacharidų kiekiai nepakito, tačiau galaktinolio ir rafinozės šeimos oligosacharidų kiekiai kriaušių mikroūgliuose gerokai padidėjo. Skirtingos grūdinimo sąlygos turėjo mažai įtakos galaktinolio ir rafinozės kiekio kitimui mikroūgliuose. Stachiozės kiekis kriaušės mikroūgliuose juos grūdinant kito nevienodai ir priklausė nuo veislės, grūdinimo sąlygų ir maitinamosios terpės sudėties. Kriaušių mikroūglių šaldymo in vitro duomenys parodė, kad grūdinimas leidžia išvengti daugelio šalčio sukeltų pažeidimų ir daugiau mikroūglių išgyvena. Grūdintų mikroūglių kritinės temperatūros (KT50) absoliuti reikšmė, palyginti su negrūdintais mikroūgliais (išskyrus Senryo ), padidėjo 0,5 1,2 C. Oranževoje veislės grūdintų mikroūglių KT50 absoliuti reikšmė padidėjo labiau, klono Nr. 0408 mažiau. Manitolio priedas terpėje reikšmingai padidino tirtų veislių mikroūglių atsparumą šalčiui in vitro. Reikšminiai žodžiai: atsparumas šalčiui, ilgalaikis saugojimas, rafinozės šeimos cukrūs, Pyrus sp., veislės. Įvadas. Genetinė įvairovė yra svarbi ne tik gamtinių populiacijų evoliucijai, bet ir kuriant naujas kultūrinių augalų veisles. Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro Sodininkystės ir daržininkystės instituto (LAMMC SDI) kriaušių kolekcijoje saugoma daug vietinių ir introdukuotų genotipų, kurie turi didelę vertę moksliniams tyrimams ir selekcijai. Kai kurie kolekcijos vienetai yra unikalūs, auginami tik kolekcijoje. Klimato sąlygos ir augalų ligos kelia pavojų genetiniams ištekliams, saugomiems augynuose. Lietuvoje didžiausią pavojų augalams kelia šalčiai. Periodiškai pasitaikantis 17

didesnis nei -30 C šaltis būna pražūtingas netgi vietinėms kriaušių veislėms. Manoma, kad klimato atšilimo sąlygomis ekstremalių klimato sąlygų tikimybė didėja. Tai kelia pavojų genetiniams ištekliams. Saugiau ir patikimiau saugoti vegetatyvinę dauginimo medžiagą in vitro nei lauko kolekcijoje. Tokie metodai pradėti taikyti prieš keletą dešimtmečių. Vegetatyviškai dauginami augalai saugomi ilgalaikio kriosaugojimo sąlygomis arba vidutinio ilgio laikotarpį in vitro augimą slopinančiomis sąlygomis (Shibli ir kt., 2006). Dažniausiai mikroūglių augimas slopinamas veikiant žema temperatūra. Tačiau atskiriems genotipams būdinga individuali specifinė reakcija į saugojimo sąlygas. Augalai nevienodai atsparūs žemoms temperatūroms ir užšalimui. Genų išteklių saugojimo in vitro metodams kurti reikalingos žinios apie augalų gebėjimą užsigrūdinti ir atsparumą stresui žemoje temperatūroje. Jei augalai prieš saugojimą yra grūdinami, daugiau jų išgyvena saugojimo metu (Kushnarenko ir kt., 2009; Chang, Reed, 2000). Šio proceso metu vyksta genų raiškos pakitimai, užtikrinantys audinių atsparumą žemos temperatūros poveikiui. Sumedėjusių augalų užsigrūdinimą sąlygoja kompleksinė žemos temperatūros ir trumpos dienos poveikio sąveika. Neretai atsparumo genų raiškai pakanka vien tik žemos temperatūros poveikio (Welling ir kt., 2004; Wisniewski ir kt., 2006). Tyrimai parodė, kad yra ryšys tarp augalų atsparumo šalčiui ir angliavandenių kaupimosi audiniuose (Gilmour ir kt., 2000). Nustatyta, kad adaptacijos metu padidėja fruktozės ir gliukozės koncentracija ląstelėse. Augalų prisitaikymas prie streso priklauso nuo rafinozės šeimos angliavandenių (RŠA) rafinozės, stachiozės ir jų metabolizmo pirmtakų sacharozės ir galaktinolio kiekio ląstelėse (Peters ir kt., 2007). Kita vertus, prieštaringi rezultatai gauti tiriant, kokią reikšmę turi RŠA Arabidopsis thaliana augalų užsigrūdinimui (Zuther ir kt., 2004). In vitro sąlygomis augalų užsigrūdinimui ir atsparumui žemoms temperatūroms bei jų gyvybingumui ir kitoms biologinėms savybėms didelės reikšmės turi maitinamosios terpės sudėtis (Kovalchuk ir kt., 2009). Nustatyta, kad augalų grūdinimui ir ilgalaikio saugojimo efektyvumui reikšminga augimo reguliatorių ir cukrų sudėtis bei jų kiekis terpėje (Hassan, Bekheet, 2008). Ankstesniais tyrimais nustatyta, kad žemoje temperatūroje Prunus genties augalų mikroūgliuose indukuojami adaptacijos mechanizmai, kurie didina jų atsparumą stresui. Gauti rezultatai atskleidė genų raiškos kinetikos ypatumus (Lukoševičiūtė ir kt., 2009 a, b). Pyrus genties augalai šiuo atžvilgiu menkai ištirti. Duomenys apie rafinozės šeimos angliavandenių kaupimąsi ir jį lemiančių genų raišką yra naudingi kuriant atsparias šalčiui augalų veisles, parenkant optimalias skirtingos genetinės prigimties augalų užsigrūdinimo ir išsaugojimo in vitro sąlygas. Darbo tikslas įvertinti rafinozės šeimos oligosacharidų, manitolio kaupimosi kriaušių mikroūgliuose žemoje teigiamoje temperatūroje (užsigrūdinimo metu) in vitro dėsningumus, nustatyti grūdinimo temperatūros ir fotoperiodo režimo, fitohormonų ir cukrų kiekio maitinamojoje terpėje įtaką kriaušių mikroūglių atsparumui šalčiui. Tyrimo objektas, metodai ir sąlygos. T y r i m o o b j e k t a s. Tyrimai atlikti LAMMC SDI Sodo augalų genetikos ir biotechnologijos skyriuje. Naudoti kriaušių (Pyrus sp.) veislių: Oranževoje, Hasselpear, Princesė Dagmara, Karalienė Jadvyga, Senryo, Koncentrat, ir hibrido Nr. 0408 mikroūgliai. Minėti genotipai atrinkti atsižvelgiant į kriaušės genetinio polimorfizmo duomenis (duomenys neskelbti). Įvertinus daugiau kaip 200 veislių ir genetinių formų, atrinktos 7 sąlyginės genetinės 18

grupės. Grūdinimo tyrimams pasirinktos šešios kriaušių veislės ir vienas klonas yra skirtingų genetinių grupių būdingi genotipai. Angliavandenių kiekiui tirti naudoti Princese Dagmara ir Senryo veislių mikroūgliai. A u g i n i m a s i r g r ū d i n i m a s i n v i t r o. Prieš atliekant grūdinimo ir šaldymo tyrimus in vitro sąlygomis kriaušių mikroūgliai auginti ant MS terpės (Murashige, Skoog, 1962) su 3,2 µm benzil-amino purino (BAP), 3,0 % sacharozės, 0,8 % agaro. Persodinti mikroūgliai auginti 7 paras 22 ± 3 C temperatūroje, naudojant 50 150 μmol m -2 s -1 intensyvumo apšvietimą fluorescencinėmis lempomis 16/8 valandų šviesos/tamsos fotoperiodu. Po to, naudojant 25 50 μmol m -2 s -1 intensyvumo apšvietimą, mikroūgliai 7 dienas grūdinti dviem režimais: 1) trumpos dienos fotoperiodas (8 val. šviesa ir 16 val. tamsa) ir temperatūros kaita (22 C šviesa ir 4 C tamsa) (kintamomis sąlygomis); 2) žema temperatūra (4 C) (pastoviomis sąlygomis) be apšvietimo. Kontroliniai mikroūgliai grūdinti nebuvo. Kriaušių mikroūgliams grūdinti in vitro sąlygomis naudotos trys skirtingos sudėties MS terpės: 1) terpė be augimo reguliatorių, su 3,0 % sacharozės priedu; 2) terpė su citokininu (3,2 µm BAP) ir 3,0 % sacharozės priedu; 3) terpė, į kurią papildomai įdėta 2 % manitolio ir 3,0 % sacharozės. A n g l i a v a n d e n i ų a n a l i z ė. Augalo audinių bandiniai užšaldyti skystame azote ir susmulkinti grūstuvėje. Angliavandenių ekstrakcija atlikta T. Taji (2002) metodu. Bandiniai buvo užpilti 7 tūriais iki 80 C pašildyto 80 % etanolio, po to kaitinti 10 min. 90 C temperatūroje. Ekstraktas buvo inkubuojamas 4 C 16 20 valandas. Nuosėdos atskirtos centrifuguojant. Bandiniai analizuoti efektyviuoju skysčių chromatografu Agilent 1200 su šviesos lūžio kampo detektoriumi šiomis sąlygomis: srautas 1,0 ml/min., Nucleosil 100-5 NH2 kolonėlė 250 4,6 mm (Marcheley-Nagel, Ltd.), kolonėlės temperatūra 25 C. Judrioji fazė 70 % acetonitrilo vandeninis tirpalas. Angliavandeniai identifikuoti ir jų koncentracija nustatyta pagal standartus. Pateikti duomenys atitinka vidurkį ir standartinę vidurkio paklaidą. A t l i e k a n t š a l d y m o t y r i m u s m i k r o ū g l i a i 2 val. inkubuoti -2 C temperatūroje, po to ji sumažinta 1 C val. -1 greičiu iki -5 C, -6 C, -7 C, -8 C, -9 C, -10 C. Žemiausioje šaldymo temperatūroje mikroūgliai inkubuoti 1 val., po to 16 val. 4 C tamsoje. Ar tirti mikroūgliai buvo pažeisti, įvertinta vizualiai nustatant (balais), kiek jiems pakenkė šaltis, ir matuojant, kiek jonų išlaisvinta po šaldymo. Praėjus trims savaitėms po šaldymo nustatyta (balais), kiek mikroūglių pažeidė šaltis (0 nepažeistas, 1 iki 5 % žuvusių audinių, 2 nuo 6 iki 30 % žuvusių audinių, 3 nuo 31 iki 75 % žuvusių audinių, 4 nuo 76 iki 95 % žuvusių audinių, 5 augalas žuvęs, pažeista daugiau kaip 95 % audinių). Pažeistų audinių jonų išlaisvinimas buvo tiriamas konduktometriniu metodu, naudojant konduktometrą InoLab Cond 720 WTW. Buvo matuojamas tirpalo elektrinis laidumas. Jonų išlaisvinimui nustatyti mikroūgliai buvo inkubuojami dejonizuotame vandenyje 24 val. 4 C temperatūroje. Po to matuojama konduktometru. Bendras jonų kiekis nustatytas matuojant tirpalo elektrinį laidumą po autoklavavimo. Normalizuotas nešaldytų ir maksimaliai sušaldytų (6 val., -20 C) bandinių jonų išlaisvinimo procentinis santykis (Linden, 2002). 19

Santykinis jonų išlaisvinimas temperatūroje T: SJI T = (JI T / EL AUTOKL ) 100 %, pažeidimo indeksas temperatūroje T : I T = [(SJI T SJI KONTR ) / (100 SJI KONTR )] 100 %, normalizuotas pažeidimas temperatūroje T : (I T / I -20 ) 100 %, čia: JI T bandinio jonų išlaisvinimas palaikius temperatūroje T; EL AUTOKL bandinio jonų išlaisvinimas po autoklavavimo; SJI KONTR santykinis jonų išlaisvinimas kontroliniuose (nešaldytuose) mikroūgliuose; I -20 bandinių, laikytų -20 C temperatūroje, pažeidimo indekso vidurkis. Apskaičiuojant jonų išlaisvinimą, atitinkantį 50 % mikroūglių žuvimą, praėjus 21 dienai po šaldymo, nustatytas mikroūglių pažeidimo laipsnis ir išgyvenusių bei žuvusių mikroūglių procentas, šaldant skirtingose temperatūrose. Kritiniu jonų išlaisvinimu (KJI), atitinkančiu 50 % augalų žuvimą, yra priimta laikyti jonų išlaisvinimo šaldant tokioje temperatūroje, kai nebuvo žuvusių mikroūglių, ir jonų išlaisvinimo šaldant tokioje temperatūroje, kai visi šaldyti mikroūgliai yra žuvę, aritmetinį vidurkį (Rajashekar ir kt., 1982). Mūsų tyrimų duomenimis KJI siekė 61,0 %. Temperatūrų intervalas, apimantis dalinį mikroūglių žuvimą, buvo nuo -6 iki -9 C. Pagal KJI buvo apskaičiuota kritinė temperatūra (KT50), kurioje jonų išsilaisvinimas atitinka 50 % mikroūglių žuvimą. KT50 apskaičiuotas tiesinės regresijos metodu (y = a + bx, čia: a = y - bx, b = (x - x) (y - y) / (x - x) 2, x žinomas jonų išlaisvinimas %; y žinoma temperatūra; x ir y yra imties vidurkiai). Pateiktas 10 pakartojimų vidurkis ir standartinė vidurkio paklaida, apskaičiuota naudojant kompiuterio programų paketą SELEKCIJA (Tarakanovas, Raudonius, 2003). Rezultatai. A n g l i a v a n d e n i ų k i e k i o k i t i m a s k r i a u š i ų m i k r o ū - g l i u o s e g r ū d i n i m o m e t u. Nustatyti monosacharidum fruktozės ir gliukozės, disacharido, sacharozės, galaktinolio bei rafinozės šeimos angliavandenių (RŠA) rafinozės ir stachiozės kiekiai kriaušių Princesė Dagmara ir Senryo mikroūgliuose prieš grūdinimą (kontrolė) ir po jo. Fruktozės (1,0 2,9 mg g -1 žalios masės), gliukozės (1,7 4,6 mg g -1 žalios masės), disacharido sacharozės (2,7 10,1 mg g -1 žalios masės) kiekiai mikroūgliuose dėl skirtingų grūdinimo sąlygų beveik nekito. Negrūdintuose mikroūgliuose galaktinolio ir RŠA kiekis buvo nedidelis: galaktinolio nuo 0 iki 0,07 mg g -1, stachiozės iki 0,11 mg g -1, rafinozės iki 0,03 mg g -1 žalios masės. Gauti rezultatai parodė, kad grūdinant galaktinolio ir RŠA angliavandenių kiekiai gerokai padidėjo (1 pav.). 20

1 pav. Galaktinolio, rafinozės, stachiozės ir manitolio kaupimasis kriaušių Princesė Dagmara (A) ir Senryo (B) mikroūgliuose esant skirtingoms grūdinimo sąlygoms. Abscisių ašyje: C negrūdinti mikroūgliai, 1 grūdinti kintamomis sąlygomis, 2 grūdinti pastoviomis sąlygomis. Fig. 1. Accumulation of galactinol, rafinose, stachiose and manitol in Princesė Dagmara (A) ir Senryo (B) microshoots. In abscise: C not cold acclimated, 1 cold acclimated under variable conditions, 2 cold acclimated under fixed conditions. 21

Galaktinolio ir stachiozės kiekiai daugeliu atveju padidėjo daugiau nei 10 kartų ir siekė 0,77 0,79 mg g-1 žalios masės. Rafinozės kiekiai grūdintuose mikroūgliuose taip pat padidėjo, tačiau maksimalus kiekis nesiekė 0,22 mg g -1 žalios masės. Galaktinolio ir rafinozės kiekis mikroūgliuose nuo grūdinimo sąlygų beveik nepriklausė. Senryo veislės mikroūgliuose po grūdinimo kintamomis sąlygomis terpėje su citokininu nustatytas mažiausias, palyginti su kitais variantais, galaktinolio kiekis. Daugiausia rafinozės aptikta mikroūgliuose, grūdintuose kintamomis sąlygomis terpėje su manitoliu. Stachiozės kiekis kriaušės mikroūgliuose grūdinimo metu kito nevienodai ir priklausė nuo veislės, grūdinimo sąlygų ir maitinamosios terpės sudėties. Didžiausias stachiozės kiekis nustatytas veislės Princesė Dagmara mikroūgliuose po grūdinimo antru grūdinimo režimu terpėje su citokininu. Tačiau stachiozės kiekis Senryo mikroūgliuose šiomis sąlygomis iš esmės nepadidėjo: didžiausias stachiozės kiekis buvo ir labiausiai padidėjo po grūdinimo pirmu grūdinimo režimu terpėje be augimo reguliatorių. Remiantis pirminiais duomenimis, panašios tendencijos nustatytos ir tiriant kitus kriaušės genotipus. Įvertinus suminį manitolio ir sorbitolio kiekį nustatyta, kad daugiausia jų buvo mikroūgliuose, augintuose terpėje su manitoliu. Matyt, didžioji dalis manitolio, rasto augaluose, perėjo iš maitinamosios terpės. Pažymėtina, kad veislės Princesė Dagmara mikroūgliuose sukauptas didžiausias manitolio kiekis po grūdinimo pirmu grūdinimo režimu terpėje be augimo reguliatorių. K r i a u š i ų a t s p a r u m o š a l č i u i t y r i m a s i n v i t r o. Tyrimo duomenimis negrūdintų kriaušių mikroūglių, augintų terpėje be priedų, KT50, priklausomai nuo veislės, kito nuo -6,9 C ( Hesselpear ) iki -8,0 C ( Senryo ), grūdintų nuo -7,8 C ( Senryo ) iki -8,7 C ( Karalienė Jadvyga ). 2 pav. Kriaušių mikroūglių atsparumas šalčiui priklausomai nuo genotipo, grūdinimo sąlygų ir maitinamosios terpės sudėties. KT50 kritinė temperatūra, kurioje jonų išsilaisvinimas atitinka 50 % mikroūglių žuvimą. Fig. 2. Cold hardiness of pear depending on genotype, cold acclimation and content of growing medium. KT50 critical temperature, where ion leakage corresponds to 50 % microshoot mortality. 22

Grūdintų mikroūglių KT50 absoliuti reikšmė, palyginti su negrūdintais mikroūgliais (išskyrus Senryo ), padidėjo 0,5 1,2 C (2 pav.). Šis padidėjimas visais atvejais buvo reikšmingas. Didžiausias jis buvo Oranževoje veislės, mažesnis klono Nr. 0408 mikroūglių. Kriaušių mikroūglių šaldymo in vitro duomenys rodo, kad grūdintiems mikroūgliams mažiau pakenkia šaltis. Tai leidžia išvengti daugelio šalčio sukeliamų pažeidimų ir didina mikroūglių išgyvenamumą šaldymo metu. Kitaip nei kitų veislių, Senryo veislės mikroūglių grūdinimas pažeidimo nesumažino, priešingai padidino (nors ir nereikšmingai). Šaldant kriaušių mikroūglius, išryškėjo manitolio įtaka kriaušių atsparumui šalčiui in vitro. Mikroūgliai, savaitę auginti 22 C temperatūroje ir po to dar savaitę grūdinti kintamomis sąlygomis terpėje su manitolio priedu, buvo atsparesni šalčiui negu mikroūgliai, auginti ir grūdinti terpėje be manitolio ir BAP priedų. Terpėje su manitolio priedu grūdintų augalų KT50 absoliučios reikšmės padidėjimas, palyginti su terpe be priedų, buvo esminis ir siekė 0,3 C ( Koncentrat ), 1,1 C ( Hasselpear ) ir 1,2 C ( Senryo ). Dėl manitolio priedo negrūdintų Koncentrat veislės mikroūglių KT50 reikšmė padidėjo dvigubai daugiau, negu grūdintų mikroūglių, ir terpėje be priedų priartėjo prie pastarųjų KT50. Nors grūdinimo ir manitolio poveikis kriaušių mikroūglių atsparumui šalčiui daugeliu atvejų akivaizdus, tačiau atskirų veislių reakcija į šiuos veiksnius buvo nevienoda. Pavyzdžiui, veislės Senryo mikroūglių atsparumo šalčiui grūdinimas beveik nepaveikė, o manitolio priedas gerokai padidino jų atsparumą. Veislės Koncentrat mikroūglių grūdinimas gerokai padidino jų atsparumą šalčiui, o manitolio įtaka atsparumui, nors ir buvo akivaizdi, bet gerokai mažesnė negu kitų veislių. Aptarimas. Reakcija į šalčio stresą yra svarbus veiksnys nustatant optimalias kriosaugojimo ir ilgalaikio saugojimo sąlygas. Šiuo tyrimu, kaip ir ankstesniais mūsų ir kitų autorių tyrimais, buvo nagrinėjami tiek sumedėjusių Prunus, Cydonia genčių augalų, tiek žolinių Fragaria, Brassica, Miscanthus, Arabidopsis augalų užsigrūdinimo ypatumai in vitro ir in vivo sąlygomis. Išaiškėjo, kad rafinozės šeimos angliavandenių kaupimasis ir kiekis augaluose yra tiesiogiai susiję su užsigrūdinimu ir atsparumu šalčiui, gali būti panaudoti augalo užsigrūdinimo efektyvumui kiekybiškai charakterizuoti ir turi būti taikomi kaip kriterijus arba biocheminis žymuo vertinant augalų užsigrūdinimo efektyvumą ir atsparumą žemoms temperatūroms (Rugienius ir kt., 2009; Lukoševičiūtė ir kt., 2009a; Lukoševičiūtė ir kt., 2009b; Kuprienė ir kt., 2008; Nishizawa ir kt., 2008; Patton ir kt., 2007). Mūsų tyrimo duomenys parodė, kad šie dėsningumai būdingi ir Pyrus augalams. Tyrimu nustatyta, kad grūdinant tirtų monosacharidų kiekiai nepakito, tačiau galaktinolio ir rafinozės šeimos oligosacharidų kiekiai kriaušių mikroūgliuose gerokai padidėjo. Atskirais atvejais prieštaringi rezultatai gauti tiriant RŠA reikšmę A. thaliana augalų užsigrūdinimui (Zuther ir kt., 2004). Taip pat išryškėjo tam tikri mūsų ankstesniais tyrimais gautų skirtingų dehidrinų ir angliavandenių raiškos duomenų neatitikimai (neskelbti duomenys). Todėl siekdami įsitikinti ryšio tarp atsparumo šalčiui ir biocheminių rodiklių patikimumu ir galimybėmis panaudoti šiuos biocheminius rodiklius optimizuojant kriaušių genofondo saugojimo sąlygas, įvertinome keleto pasirinktų kriaušių veislių mikroūglių, grūdintų pirmiau minėtomis sąlygomis, atsparumą šalčiui, 23

nustatydami jų kritinę jonų išlaisvinimo temperatūrą (KT50), kurioje jonų išsilaisvinimas atitinka 50 % mikroūglių žuvimą. Kriaušių mikroūglių šaldymo in vitro duomenys rodo, kad grūdinimas mažina šalčio sukeltus pažeidimus ir didina mikroūglių išgyvenamumą šaldymo metu. Tačiau grūdinimas Senryo veislės mikroūglių pažeidimo nesumažino. Tokį rezultatą galėjo lemti didesnis šios veislės mikroūglių jautrumas stresui, kurį sukelia laikymas ir dauginimas in vitro sąlygomis. Todėl inkubavimas žemoje teigiamoje temperatūroje terpėje be priedų papildomo poveikio jiems neturi. Kriaušių mikroūglių tyrimų duomenimis manitolis terpėje neturėjo lemiamos reikšmės RŠA pokyčiams grūdinimo metu ir tuo pačiu užsigrūdinimo efektyvumui, tačiau šaldant in vitro terpėje su manitoliu kriaušių atsparumas šalčiui gerokai padidėjo, palyginti su terpe be manitolio. Matyt, šis veiksnys ne tiek skatino užsigrūdinimą, kiek sumažino osmosinį ir oksidacinį stresą žemose temperatūrose arba veikė kaip krioprotektorius. Panašius paaiškinimus dėl teigiamos manitolio įtakos augalų gyvybingumui esant žemoms temperatūroms pateikia ir kiti autoriai (Shibli ir kt., 2006). Nėra žinoma, ar mūsų tyrimu nustatyti dideli manitolio sorbitolio kiekiai mikroūgliuose, augintuose terpėje su manitoliu, yra svarbūs kaip mikroūglių užsigrūdinimo veiksnys, nes kiti biocheminiai rodikliai daugeliu atvejų nerodo didesnio užsigrūdinimo efektyvumo šiomis grūdinimo sąlygomis. Galbūt augalų užsigrūdinimo efektyvumas veikiant manitoliui nėra didesnis. Tačiau remiantis literatūros duomenimis (Hassan, Bekheet, 2008) šio angliavandenio įtaka gali būti reikšminga augalų gyvybingumui ilgalaikio saugojimo metu. Apibendrinant galima pasakyti, kad pagal angliavandenių kaupimąsi nustatyta, jog atskiros veislės nevienodai reagavo į skirtingą grūdinimo režimą ir maitinamosios terpės priedus. Gali būti, kad užsigrūdinimo efektyvumą rodo ne atskiri biocheminiai rodikliai, o jų suma arba tam tikras derinys, būdingas skirtingiems genotipams. Pagal individualias tirtų genotipų biochemines ir atsparumo šalčiui charakteristikas buvo parinktos optimalios kriaušių mikroūglių grūdinimo sąlygos Panaudojus šias grūdinimo sąlygas toliau tiriamos būdingų genotipų ilgalaikio saugojimo žemose temperatūrose galimybės. Nors daugeliu atvejų manitolio įtakos užsigrūdinimui nenustatyta, tačiau dėl jo teigiamo poveikio atsparumui žemoms temperatūroms papildomi ilgalaikio saugojimo tyrimai atliekami naudojant terpes su manitoliu. Išvados. 1. Tyrimais nustatyta, kad grūdinant (inkubavus žemoje teigiamoje temperatūroje) galaktinolio ir rafinozės šeimos angliavandenių kiekiai kriaušių mikroūgliuose gerokai padidėjo. Galaktinolio ir rafinozės kiekio kitimas mikroūgliuose mažai priklausė nuo skirtingų grūdinimo sąlygų. Stachiozės kiekis kriaušės mikroūgliuose juos grūdinant kito nevienodai ir priklausė nuo veislės, grūdinimo sąlygų ir maitinamosios terpės sudėties. 2. Kriaušių mikroūglių šaldymo in vitro duomenys parodė, kad grūdinimas mažina šalčio sukeltus pažeidimus ir didina mikroūglių išgyvenamumą. Grūdintų mikroūglių KT50 absoliuti reikšmė, palyginti su negrūdintais mikroūgliais (išskyrus Senryo ), padidėjo 0,5 1,2 ºC. Oranževoje veislės grūdintų mikroūglių KT50 absoliuti reikšmė padidėjo labiau, klono Nr. 0408 mažiau. Manitolio priedas gerokai padidino tirtų veislių mikroūglių atsparumą šalčiui in vitro. 24

Padėka. Tyrimus rėmė Lietuvos mokslo taryba (projekto Nr. MIP-72/2010). Gauta 2011 12 26 Parengta spausdinti 2011 12 28 Literatūra 1. Chang Y., Reed B. M. 2000. Extended alternating-temperature cold acclimation and culture duration improve pear shoot cryopreservation. Cryobiology, 40(4): 311 322. 2. Gilmour S. J., Sebolt A. M., Salazar M. P., Everard J. D., Thomashow M. F. 2000. Overexpression of the Arabidopsis CBF3 transcriptional activator mimics multiple biochemical changes associated with cold acclimation. Plant Physiology, 124(4): 54 65. 3. Hassan N. A., Bekheet S. A. 2008. Mid-term storage and genetic stability of strawberry tissue cultures. Research Journal of Agriculture and Biological Sciences, 4(5): 505 511. 4. Kovalchuk I., Lyudvikova Y., Volgina M., Reed B. M. 2009. Medium, container and genotype all influence in vitro apple germplasm. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 96: 127 136. 5. Kuprienė R., Burbulis N., Blinstrubienė A., Juozaitytė R., Malinauskaitė R. 2008. Effect of Acclimation Duration and Sucrose Level on the Cold Tolerance of Brassica napus L. Vagos. LŽŪU mokslo darbai, 81(34): 24 30. 6. Kushnarenko S. V., Romadanova N. V., Reed B. M 2009. Cold acclimatization improves regrowth of cryopreserved apple shoot tips. Cryo Letters, 30(1): 47 54. 7. Linden L. 2002. Measuring cold hardiness in woody plants. Academic dissertation. Helsinki, 57. 8. Lukoševičiūtė V., Rugienius R., Sasnauskas A., Stanys V., Bobinas Č. 2009 a. Impact of exogenous sucrose, raffinose and proline on cold acclimation of strawberry in vitro. Acta Horticulturae, 839(1): 203 208. 9. Lukoševičiūtė V., Rugienius R., Stanienė G., Stanys V., Baniulis D. 2009 b. Grūdinimo įtaka termostabilių baltymų kiekiui trešnės ir paprastosios vyšnios mikroūgliuose in vitro sąlygose. Sodininkystė ir daržininkystė, 28(4): 35 43. 10. Murashige T., Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15(3): 473 497. 11. Nishizawa A., Yabuta Y., Shigeoka S. 2008. Galactinol and raffinose as a novel function to protect plants from oxidative damage. Plant Physiology, 147:1 251 1 263. 12. Patton A. J., Cunningham S. M., Volenec J. J., Reicher Z. J. 2007. Differences in Freeze tolerance of zoysiagrasses: II. Carbohydrate and proline accumulation. Crop Science, 47: 2 170 2 181. 25

13. Peters S., Mundree S. G., Thompson J. A., Farrant J. M., Keller F. 2007. Protection mechanisms in the resurrection plant Xerophyta viscosa (Baker): both sucrose and raffinose family oligosaccharides (RFOs) accumulate in leaves in response to water deficit. Journal of Experimental Botany, 58: 1 947 1 956. 14. Rajashekar C., Westwood M. N., Burke M. J. 1982. Deep supercooling and cold hardiness in genus Pyrus. Journal of the American Society for Horticultural Science, 107: 968 972. 15. Rugienius R., Siksnianas T., Gelvonauskiene D., Staniene G., Sasnauskas A., Zalunskaite I., Stanys V. 2009. Evaluation of genetic resources of fruit crops as donors of cold and disease resistance in Lithuania. Acta Horticulturae, 825: 117 124. 16. Shibli R. A., Shatnawi M. A., Subath W. S., Ajlouni M. M. 2006. In vitro conservation and cryopreservation of plant genetic resources: A review. World Journal of Agricultural Sciences, 2(4): 372 382. 17. Taji T., Ohsumi C., Iuchi S., Seki M., Kasuga M., Kobayashi M., Yamaguchi- Shinozaki, K. Shinozaki K. 2002. Important roles of drought- and cold-inducible genes for galactinol synthase in stress tolerance in Arabidopsis thaliana. Plant Journal, 29(4): 417 426. 18. Tarakanovas P., Raudonis S. 2003. Agronominių tyrimų duomenų statistinė analizė taikant kompiuterines programas ANOVA, STAT, SPLIT-PLOT iš paketo SELEKCIJA IR IRRISTAT. Akademija. 19. Welling A., Rinne P., Vihera-Aarnio A., Kontunen-Soppela S., Heino P., Palva E. T. 2004. Photoperiod and temperature differentially regulate the expression of two dehydrin genes during overwintering of birch (Betula pubescens Ehrh.). Journal of Experimental Botany, 55(396): 507 516. 20. Wisniewski M. E., Bassett C. L., Renaut J., Farrell R., Tworkoskii T., Artlip T. S. 2006. Differential regulation of two dehydrin genes from peach (Prunus persica) by photoperiod, low temperature and water deficit. Tree Physiology, 26(5): 575 584. 21. Zuther E., Büchel K., Hundertmark M., Stitt M., Hincha D. K., Heyer A. G. 2004. The role of raffinose in the cold acclimation response of Arabidopsis thaliana. FEBS Lett. 576(1 2): 16 73. SODININKYSTĖ IR DARŽININKYSTĖ. SCIENTIFIC ARTICLES. 2011. 30(3 4). Influence of carbohydrates on cold acclimation of cultivated pear microshoots V. Lukoševičiūtė, G. Stanienė, A. Blažytė, A. Sasnauskas, D. Gelvonauskienė, D. Baniulis, R. Rugienius Summary For pear cultivars growing in Lithuania like for many other orchard plants, low temperature and temperature fluctuations during various periods of overwintering can cause heavy losses. Climatic conditions often constitute a serious hazard to genetic resources of many plant species 26

maintaining in field collections. Therefore, in vitro techniques are being developed and used to store germplams of vegetatively propagated plants. Low temperature often is used for growth slowdown during long-term storage. Cold hardiness is genotype dependent and specific reaction to storage condition is characteristic to different genotypes. Therefore, knowledge about capabilities of plants to cold acclimate and withstand low temperature stress is needed for development of new cultivars and methods of long-term storage of germplams. The aim of this study is to evaluate accumulation of raffinose family carbohydrates and mannitol at low positive temperatures (during cold acclimation) in vitro, to assess effect of cold acclimation temperature, photoperiod regime, medium content of phytohormones and carbohydrates on pear cold hardiness in vitro. Cold hardiness was evaluated based on cold damage assessment and ion leakage after freezing treatment of micro-shoots. The study revealed that content of monosaccharide carbohydrates did not change during cold acclimation, however, content of raffinose family oligosaccharides increased considerably in acclimated pear micro-shoots. Differences in cold acclimation conditions had little effect on accumulation of galactinol and raffinose. Change of stachyose content in pear microshoots during cold acclimation varied and was dependent on pear genotype, cold acclimation conditions and composition of growth medium. Results of experiments on freezing of pear microshoots revealed that cold acclimation lowered cold injury of pear microshoots and increased their viability. Absolute value of critical temperature (KT50) of cold acclimated microshoots (except Senryo ) was increased by 0.5 1.2 C, as compared to control. This increase was most pronounced for micro-shoots of Oranževoje, and the lowest value was for clone No. 0408. Mannitol supplement in growth medium caused significant increase in cold hardiness in vitro of microshoot of the selected evaluated cultivars. Key words: cold hardiness, cultivars, long-term storage, Pyrus sp., raffinose family carbohydrates. 27