BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM)

Transcription

1 PA POKYNY NA POUŽÍVANIE PÔDA V PETRIHO MISKÁCH PRIPRAVENÁ NA POUŽITIE PA Rev.: April 2013 BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) POUŽITIE Pôda BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) sa používa pri diskových difúznych testoch na citlivosť voči antibiotikám pre klinické izoláty rodu Haemophilus podľa opisu v schválenej norme M2 vydanej Úradom pre klinické a laboratórne normy (CLSI). 1 PRINCÍPY A VYSVETLENIE POSTUPU Mikrobiologická metóda. Pôda Mueller Hinton Agar doplnená 1 % hemoglobínu a 1% doplnku IsoVitaleX Enrichment (Mueller Hinton Chocolate Agar) sa predtým odporúčala pre Haemophilus influenzae. 2 Rozsiahle štúdie vykonané Jorgensenom a kolegami viedli k vývoju pôdy Haemophilus Test Medium Agar (HTM). 3, 4 Táto pôda je agar Mueller Hinton doplnený Stuartovým faktorom (hemín alebo hematín), proakcelerínom (nikotínamidadeníndinukleotid, NAD) a kvasničným extraktom. Hlavnou výhodou pôdy HTM Agar v porovnaní s pôdou Mueller Hinton Chocolate Agar je optická priehľadnosť umožňujúca merať priemery zón z dna misky podľa štandardného testovacieho postupu pre nenáročné organizmy na pôde Mueller Hinton Agar. Ďalej, pôda HTM Agar obsahuje nižšie úrovne tymidínu, preto je vhodná na testovanie trimethoprim/sulfametoxazolu. Interpretačné kritériá pre testovanie citlivosti voči antibiotikám sú uvedené v dokumente komisie CLSI M100 (M2), ktorý je súčasťou dokumentu komisie CLSI M2. 1 Ďalšie podrobnosti nájdete v tomto dokumente. Pôdu BD Haemophilus Test Medium Agar tvorí pôda Mueller Hinton Agar doplnená Stuartovým faktorom (hemín alebo hematín), proakcelerínom (nikotínamidadeníndinukleotid, NAD) a kvasničným extraktom. ZLOŽENIE BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) Zloženie* na jeden liter deionizovanej vody Hovädzí extrakt 2,0 g Kyslý kazeínový hydrolyzát 17,5 Škrob 1,5 Agar 17,0 Kvasničný extrakt 5,0 Hematín 0,015 Nikotínamidadeníndinukleotid (NAD) 0,015 ph 7,3 ± 0,1 *Upravené alebo doplnené podľa potreby, aby boli splnené analytické parametre. UPOZORNENIA. Iba na profesionálne použitie. Pôdu nepoužívajte, ak nesie známky mikrobiálnej kontaminácie, zmeny farby, vysušenia, prasknutia alebo iné znaky poškodenia. Prílišné zmrštenie tejto pôdy spôsobené vysušením môže viesť k nesprávnym výsledkom citlivosti. Ďalšie informácie o postupoch pri práci s aseptikami, o biologicky nebezpečnom odpade a likvidácii použitého produktu nájdete v dokumente VŠEOBECNÉ POKYNY NA POUŽÍVANIE. USKLADNENIE A ŽIVOTNOSŤ Prijaté misky s pôdou uskladňujte na tmavom mieste pri teplote 2 až 8 C v pôvodnom obale až do začiatku používania. Nezmrazujte a nevystavujte nadmerným teplotám. Misky môžu byť

2 naočkované až do dňa exspirácie (uvedeného na obale) a môžu byť inkubované podľa odporúčania. Pôdy z otvorených balení po 10 kusov sa môžu používať jeden týždeň (ak sú uskladnené na čistom mieste pri teplote 2 až 8 C). KONTROLA KVALITY UŽÍVATEĽOM Informácie o kontrole kvality nájdete v dokumente komisie CLSI 1 alebo v národných normách, ak sú k dispozícii. V zásade postupujte podľa postupov opísaných v časti Postup testu pomocou referenčných kmeňov spomínaných v časti Nedodávaný materiál. Pôdu BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) a používané bakteriostatické disky treba testovať dvakrát do týždňa na správnu účinnosť. Vzhľad nenaočkovanej pôdy: bledosmotanová. POSTUP Dodávaný materiál BD Haemophilus Test Medium Agar (90 mm Petriho misky Stacker). Mikrobiologicky kontrolované. Nedodávaný materiál 1. Živný bujón v skúmavke, napr. BD Trypticase Soy Broth (bujón so sójovo-kazeínovým hydrolyzátom) alebo Mueller Hinton II Broth (katiónovo upravený) v 5 ml skúmavkách, na prípravu štandardnej očkovacej kultúry a sterilný bujón alebo fyziologický roztok na riedenie očkovacej kultúry. 2. Norma na porovnanie bária sulfátu (0,5 ml z 0,048 M BaCl 2 [1,175 % w/v BaCl 2 2H 2 O] na 99,5 ml z 0,18 M [0,36 N] H 2 SO 4 [1 % v/v]). 3. Fotometrické zariadenie na prispôsobenie zákalu očkovacej suspenzie tak, aby zodpovedala miere 0,5 McFarlanda. 4. Namiesto hore uvedených materiálov možno použiť zariadenie BD Prompt Inoculation System (odmerné zariadenie na prípravu očkovacej kultúry). 5,6 5. Kontrolné kultúry Haemophilus influenzae ATCC 49247, ATCC a ATCC Papierové disky napustené špecifickým množstvom antibiotík, napríklad disky na testovanie citlivosti BD Sensi-Disc. 7. Dispenzér, napr. 6-miestny dispenzér BD Sensi-Disc. 8. Pravítko alebo iné zariadenie na meranie veľkosti zóny v milimetroch. 9. Inkubátor, ktorý produkuje prostredie s obsahom 5 % CO 2, alebo iné zariadenie produkujúce prostredie obohatené o CO Činidlo na vykonanie rýchleho testu ß-laktamázy, napríklad disky BD Cefinase. 11. Pomocné kultivačné pôdy, činidlá a potrebné laboratórne vybavenie. Typy vzoriek Tento produkt sa používa na testovanie citlivosti čistých kultúr rodu Haemophilus izolovaných z klinických vzoriek (pozrite si aj časť Vlastnosti a obmedzenia postupu). Postup testu 1. Pres začatím testovania citlivosti na potvrdenie čistoty kultúry a na potvrdenie predbežnej identifikácie organizmu Haemophilus pripravte Gramovo farbenie. 2. Ako zdroj očkovacej kultúry použite niekoľko dobre izolovaných kultúr odobratých priamo z jeden deň starých (najlepšie 20 až 20 hodín) misiek pôdy Chocolate Agar. 3. Na rýchlu detekciu kmeňov rezistentných voči penicilínu, ampicilínu alebo amoxicilínu vykonajte rýchly test ß-laktamázy. 4. Pripravte suspenziu testovaného organizmu v bujóne Mueller Hinton Broth, Mueller Hinton II Broth alebo 0,9 % fyziologickom roztoku. Túto suspenziu prispôsobte pomocou fotometrického zariadenia zákalu v miere 0,5 McFarlanda. Táto suspenzia bude obsahovať približne 1 4 x 10 8 CFU/ml. Pri príprave tejto suspenzie postupujte opatrne, pretože vyššie koncentrácie očkovacej kultúry môžu pri niektorých ß-laktámových antibiotikách viesť k výsledkom takzvanej nepravej rezistencie, najmä pri testovaní kmeňov H. influenzae produkujúcich beta-laktamázu. 1 PA

3 5. Alternatívne metódy prípravy očkovacej kultúry použitím zariadení umožňujúcich priamu štandardizáciu očkovacích kultúr bez úpravy zákalu (napr. zariadenia BD Prompt Inoculation System) sa osvedčili ako prijateľné na rutinné testovacie účely vrátane testovania H. influenzae. 5, 6 6. Do 15 minút od úpravy zákalu očkovacej látky ponorte sterilný tampón do dostatočne zriedenej očkovacej látky a silno ním niekoľkokrát zakrúžte proti hornej vnútornej stene skúmavky, aby sa vytlačila nadbytočná tekutina. 7. Celý agarový povrch pôdy BD Haemophilus Test Medium Agar naočkujte trikrát, po nanesení každej čiary misku otočte o 60, aby sa dosiahlo rovnomerné naočkovanie. 8. Uzáver môžete nechať pootvorený na 3 až 5 minút a misky nechať pri izbovej teplote najdlhšie 15 minút, aby sa všetka povrchová vlhkosť mohla absorbovať skôr, než použijete disky napustené liečivom. 9. Disky aplikujte pomocou dispenzéra, pričom dodržiavajte preventívne opatrenia pre prácu s aseptikami. Väčšina mikrobiotických látok produkujte väčšie inhibičné zóny pri testovaní voči Haemophilus v porovnaní s inými organizmami. Preto do jednej 100 mm misky umiestnite najviac štyri antibiotické disky vrátane maximálne šiestich nasledujúcich diskov: cefalosporíny tretej generácie (napríklad cefotaxim, ceftazidim, ceftriaxon, ceftizoxim), aztreonam, imipenem alebo ciprofloxacín. Po umiestnení diskov na agar ich zatlačte sterilnou ihlou alebo peánom, aby sa celkom dotýkali povrchu pôdy. 10. Do 15 minút po umiestnení diskov misky obráťte a inkubujte ich na 16 až 18 hodín pri teplote 35 C v aeróbnom prostredí obohatenom o 5 % oxidu uhličitého. 11. Na pôdu BD Haemophilus Test Medium Agar naočkujte H. influenzae ATCC a inkubujte ju spolu s pôdou na testovanie citlivosti za účelom stanovenia, či táto pôda podporuje správny rast. Výsledky 1. Misky odčítajte po 16 až 18 hodinách inkubácie. Mal by byť viditeľný zarastený trávnik. Ak rastú iba izolované kolónie, očkovacia kultúra bola príliš slabá a test treba zopakovať. 2. Meradlami, pravítkom alebo šablónou pripravenou na tento účel zmerajte priemer zón úplnej inhibície (voľným okom) vrátane priemeru disku pri zaokrúhlení na celé milimetre. Meradlo držte na zadnej časti obrátenej misky nad čiernym, svetlo neodrážajúcim pozadím a osvetlením zhora. 3. Za koncový bod treba považovať oblasť, ktorá nevykazuje žiaden rast viditeľný voľným okom. Nevšímajte si mierny rast drobných kolónií, ktoré môžete s ťažkosťami spozorovať pri okraji inhibičnej zóny. Pri trimethoprime a sulfonamidoch môžu stopy antagonistických látok v pôde umožniť mierny rast; nevšímajte si preto mierny rast (20 alebo menej z trávnika rastu) a pri určovaní priemeru zóny merajte najvýraznejší okraj. Výpočet a interpretácia výsledkov Informácie o interpretácii výsledkov získaných s klinickými izolátmi organizmu Haemophilus nájdete v dokumente komisie CLSI M100 (M2). 1 Získané výsledky možno podľa zistených priemerov zón označiť za citlivé, stredne citlivé alebo rezistentné. Organizmy s pozitívnymi testmi na produkciu beta-laktamázy sa považujú za rezistentné voči ampicilínu bez ohľadu na zistené priemery zón. Berte do úvahy, že kmene H. influenzae rezistentné voči ampicilínu boli popísané s nízkou aktivitou ß-laktamázy. 7 Preto ak priemer zóny indikuje rezistenciu voči ampicilínu, izolát zaznamenajte ako rezistentný voči tomuto liečivu, aj keď je test ß-laktamázy negatívny. Kontrolné kultúry používajte pri každom teste citlivosti alebo raz týždenne, ak dosahujete uspokjivé výsledky vyžadované podľa normy komisie CLSI M27, ktorá obsahuje Tabuľky (M100-S10) so správnymi priemermi zón. 1 Poznámka. Pravidelne sa vydávajú doplnené informácie k dokumentu CLSI Document M2 alebo aktualizované verzie obsahujúce upravené tabuľky bakteriostatických diskov a výkladové normy. Aktuálne odporúčania nájdete v najnovších tabuľkách. Úplnú normu a doplnené informácie si môžete objednať v Národnej komisii pre klinické laboratórne normy (CLSI): Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA , USA. Telefón: PA

4 VLASTNOSTI A OBMEDZENIA POSTUPU A) Štúdia reprodukovateľnosti 8 Tri výrobné šarže pôdy BD Haemophilus Test Medium Agar boli hodnotené pomocou diskového testu citlivosti na antibiotiká (M2-A4) odporúčaného v tom čase komisiou NCCLS. 9 V štúdii sa použilo celkom 12 antibiotických látok (amoxicilín/klavulanát, ampicilín, ampicilín/sulbaktam, cefaklor, cefonicid, ceftriaxone, cefuroxim, chloramfenikol, ciprofloxacín, rifampín, tetracyklín, trimethoprim/sulfametoxazol) a 14 kmeňov H. influenzae. Zo 14 kmeňov bolo sedem kmeňov American Type Culture Collection (ATCC) a ostatných sedem kmeňov boli zásobné kultúry, ktoré obsahovali šesť klinických izolátov a jednu priemyselnú kultúru na kontrolu kvality. Priemery zón zistené pri každej z troch šarží pôdy sa porovnali s interpretačnými kritériami (Tabuľka 2A) v norme M2-A4. 9 Len v šiestich prípadoch boli zistené zóny pri jednej šarži, čo by malo za následok rôzne interpretačné kategórie v porovnaní s ostatnými dvomi šaržami. Zo šiestich rozporov pripadali štyri na tetracyklín a po jednej na cefaklor a cefuroxim. V prípade tetracyklínu by výsledok mal za následok interpretačnú kategóriu citlivý alebo stredne citlivý (menšia chyba). S cefaklorom a cefuroximom by 1 mm rozdiel, ktorý sa vyskytol, mal za následok kategóriu stredne citlivý alebo rezistentný, čo tiež predstavuje malú chybu. V tejto štúdii sa použilo päť kmeňov H. influenzae, ktoré produkujú beta-laktamázu. S každým z týchto kmeňov každá šarža HTM vyprodukovala priemery zón s ampicilínom, ktoré by boli interpretované ako rezistentné. Dva z piatich kmeňov vyprodukovali aj chloramfenikol acetyltransferázu (CAT). Zóny chloramfenikolu získané z týchto dvoch kmeňov by boli konzistentné s rezistenciou voči chloramfenikolu. 10,11 B) Porovnanie s pôdou Mueller Hinton Chocolate Agar 8 Diskový test komisie NCCLS bol vykonaný s 213 klinickými izolátmi H. influenzae na pôde HTM Agar a pôde Mueller Hinton Chocolate Agar. 9, 12 Testované boli antibiotické látky ampicilín, ampicilín/sulbaktam, amoxicilín/klavulanat a chloramfenikol. Boli to len antibiotické látky, pre ktoré boli pre pôdu Mueller Hinton Chocolate Agar definované interpretačné kritéria priemerov zón. 13, 14 Získali sa nasledujúce výsledky. BD Haemophilus Test Medium Agar C SC R Mueller Hinton C Chocolate Agar SC R Zhoda: 99.6% C = Citlivý I = Stredne citlivý R = Rezistentný Pri ampicilíne sa vyskytli dve veľké chyby a jedna malá chyba. Pri oboch veľkých chybách pôda BD Haemophilus Test Medium Agar vyprodukovala výsledok rezistentný, kým pôda Mueller Hinton Chocolate Agar vyprodukovala výsledok citlivý. Obidva tieto izoláty boli pozitívne na beta-laktamázu. Preto bol výsledok pozitívny správny. Malá chyba sa vyskytla s izolátom, ktorý vyprodukoval výsledok stredne citlivý na pôde HTM Agar a výsledok citlivý na pôde Mueller Hinton Chocolate Agar. C) Obmedzenia postupu Inhibičná zóna pri niektorých kombináciách organizmov a antibiotických látok nemusí mať ostro ohraničený okraj, čo môže viesť k nesprávnej interpretácii. Nesprávna koncentrácia očkovacej kultúry môže viesť k nepresným výsledkom. Ak je očkovacia kultúra príliš silná, inhibičné zóny môžu byť príliš malé a naopak, ak je očkovacia kultúra príliš slabá, môžu byť príliš veľké a ťažko merateľné. Nevhodné uskladnenie antibiotických diskov môže spôsobiť stratu účinnosti a nesprávny výsledok testu rezistencie. Citlivosť organizmu na špecifické antibiotikum in vitro nemusí nevyhnutne znamenať, že antibiotikum bude účinné in vivo. Ďalšie informácie o postupoch pri interpretácii výsledkov 2, 15 nájdete v použitej literatúre. PA

5 POUŽITÁ LITERATÚRA 1. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved standard: M2. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at 2. Thornsberry, C., T.L. Gavan, E.H. Gerlach Cumitech 6, New developments in antimicrobial agent susceptibility testing. Coordinating ed., J.C. Sherris. American Society for Microbiology, Washington, D.C 3. Jorgensen, J.H., J.S. Redding, L.A. Maher, and A.W. Howell Improved medium for antimicrobial susceptibility testing of Haemophilus influenzae. J. Clin. Microbiol. 25: Jorgensen, J.H., A.W. Howell, and L.A. Maher Antimicrobial susceptibility testing of less commonly isolated Haemophilus species using Haemophilus test medium. J. Clin. Microbiol. 28: Baker, C.N., C. Thornsberry, and R.W. Hawkinson Inoculum standardization in antimicrobial susceptibility testing: evaluation of overnight agar cultures and the rapid inoculum standardization system. J. Clin. Microbiol. 17: Marsik, F., G. Evans, J. Fowler, and L. Thompson Comparison of the BBL Prompt system, Abbott A-Just, and visual method for the preparation of Haemophilus influenzae inoculum for the Bauer-Kirby procedure, abstr. C-67, p Abstr. 89th Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol Doern, G.V., J.H. Jorgensen, C. Thornsberry, D.A. Preston, T.A. Tubert, J.S. Redding, and L.A. Maher A national collaborative study of the prevalence of antimicrobial resistance among clinical isolates of Haemophilus influenzae. Antimicrob. Agents Chemother. 32: Data on file. BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA. 9. National Committee for Clinical Laboratory Standards Approved standard: M2-A4. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, 4th ed. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 10. Azemun, P., T. Stull, M. Roberts, and A.L. Smith Rapid detection of chloramphenicol resistance in Haemophilus influenzae. Antimicrob. Agents Chemother. 20: Doern, G.V., G.S. Daum, and T.A. Tubert In vitro chloramphenicol susceptibility testing of Haemophilus influenzae: disk diffusion procedures and assays for chloramphenicol acetyltransferase. J. Clin. Microbiol. 25: National Committee for Clinical Laboratory Standards Approved standard: M2-A3. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, 3rd ed. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 13. National Committee for Clinical Laboratory Standards Second Informational Supplement: M100-S2. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 14. Doern, G.V. and R.N. Jones Antimicrobial susceptibility testing of Haemophilus influenzae, Branhamella catarrhalis, and Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob. Agents Chemother. 32: Woods, G.L., and J.A. Washington Antibacterial susceptibility tests: dilution and disk diffusion methods, p In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. USA. BALENIE/DOSTUPNOSŤ BD Haemophilus Test Medium Kat. č Pôda v Petriho miskách pripravená na použitie, 20 ks ĎALŠIE INFORMÁCIE Ak máte záujem o ďalšie informácie, kontaktujte miestneho zástupcu firmy BD. PA

6 Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 12 D Heidelberg/Germany Phone: Fax: Reception_Germany@europe.bd.com Prompt is a trademark of 3M ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and all other trademarks are the property of Becton, Dickinson and Company BD PA