Merjenje sil z opti no pinceto

Seminar I a - 1. letnik, II. stopnja Merjenje sil z opti no pinceto Avtor: Jan Fi²er Mentor: izred. prof. dr. Igor Poberaj Ljubljana, december 2013 Povzetek Sila je pomemben dejavnik pri mnogih biolo²kih procesih. Klju no vlogo pri razumevanju le-teh ima opti na pinceta, saj omogo a natan no merjenje sil v fn in pn obmo ju. V seminarju je predstavljen princip delovanja opti ne pincete v okviru geometrijske in valovne optike. Opisana je osnovna shema opti ne pincete ter njene bistvene komponente. Kot ena izmed metod zaznave poloºaja je predstavljena interferenca v zadnji gori² ni ravnini. Sledi razlaga splo²nega principa merjenja sil in kalibracije opti ne pincete na podlagi mo nostnega spektra Brownovega gibanja ujetega delca. Razli ni na ini merjenja sil so opisani s konkretnimi eksperimenti. Na koncu so navedeni viri merilnega ²uma ter nekatere pomanjkljivosti opti ne pincete.

Kazalo 1 Uvod 2 2 Princip delovanja opti ne pincete 2 2.1 Kvalitativna razlaga v okviru geometrijske optike..................... 2 2.2 Kvantitativna razlaga v okviru valovne optike....................... 4 2.3 Obmo je med valovno in geometrijsko optiko....................... 4 3 Shema opti ne pincete 4 3.1 Interferenca v zadnji gori² ni ravnini............................ 5 4 Nekaj metod merjenja sil z opti no pinceto 6 4.1 Umeritev opti ne pincete................................... 6 4.2 Merjenje sil molekularnih motorjev............................. 7 4.3 Elasti ne lastnosti molekul.................................. 8 4.4 Meritve pri konstantni sili.................................. 9 4.5 Dinami na spektroskopija sil................................. 10 5 Pomanjkljivosti opti ne pincete in viri merilnega ²uma 10 6 Zaklju ek 11 1 Uvod Biolo²ki procesi niso zgolj niz kemijskih reakcij, saj je njihov potek lahko odvisen tudi od mehanskih pogojev (npr. kak²ne sile delujejo na strukture, ki sodelujejo v procesu). Merjenje sil na mikroskopski skali je torej klju nega pomena pri razumevanju biolo²kih procesov. Ljudje so ²ele v zadnjih desetletjih razvili naprave, ki omogo ajo kvantitativne meritve sil na molekulski ravni. Ena izmed teh naprav je opti na pinceta, s katero lahko ujamemo dielektri ne delce velikosti od nekaj 10 nm do nekaj 10 µm, kar je zelo prikladno, saj je ve ina biolo²kih struktur znotraj tega obmo ja. Bistvena prednost pred ostalimi tehnikami merjenja sil (npr. pred mikroskopom na atomsko silo) je, da lahko z opti no pinceto zaznamo ali pa ustvarimo zelo majhne sile (od nekaj 10 fn do pribliºno 100 pn). Dodatna prednost opti ne pincete je, da ne potrebuje zi nega kontakta z opazovanim telesom, saj deluje na podlagi interakcije svetlobe s snovjo. Tipi ne sile v biolo²kih sistemih so: maksimalna sila molekularnih motorjev 10 pn [1], sila pri elasti ni deformaciji DNK 50 pn [2], vodikova vez 100 pn [3], sila med antigenom in protitelesom do nekaj 100 pn [4] in kovalentna vez 1 nn [5]. Spodnja tabela podaja rede velikosti bistvenih parametrov opti ne pincete in mikroskopa na atomsko silo [6]. 2

2 Princip delovanja opti ne pincete Osnovni princip delovanja opti ne pincete je preprost. Svetloba pri odboju, lomu ali absorpciji na majhnem delcu (v splo²nem na poljubni nehomogenosti v mediju) nanj prenese del gibalne koli ine, torej deluje na delec sunek sile. Z mo no fokusiranim laserskim snopom ustvarimo velik gradient intenzitete svetlobe, s imer ustvarimo t.i. opti ne pasti, kamor ujamemo delec. Delovanje opti ne pincete lahko razloºimo v treh razli nih reºimih. Za laºjo razpravo se omejimo na okrogle dielektri ne delce, katerih lomni koli nik n del je ve ji od lomnega koli nika medija n med, v katerem se delci nahajajo. 2.1 Kvalitativna razlaga v okviru geometrijske optike Geometrijska optika je zadovoljiv pribliºek, kadar so dimenzije delcev bistveno ve je od valovne dolºine svetlobe. Svetlobo opi²emo s svetlobnimi ºarki, katerim pripi²emo gostoto gibalne koli ine g = wn sred c o n, kjer je w gostota energije svetlobe, n sred lomni koli nik sredstva po katerem potuje ºarek, c o hitrost svetlobe v vakuumu in n smerni vektor ²irjenja svetlobe [7, 8]. Ohlapno si lahko ºarek predstavljamo kot curek fotonov (analogija z vodnim curkom in molekulami vode). Vzemimo, da na delec pada fokusiran Gaussov snop (slika 1a). To je snop, pri katerem ima intenziteta, pre no na smer ²irjenja snopa, Gaussov prol (na sliki 1a je to ponazorjeno z razli nimi odtenki rde e). Zaradi svoje oblike deluje delec kot zbiralna le a. Pri lomu se ºarku spremeni smer (n) in s tem g. Posledi no deluje na delec reakcijska sila v nasprotni smeri spremembe g ºarkov. Izkaºe se, da deluje sila zaradi loma vedno v smeri gradienta intenzitete (v smeri fokusa objektiva), ne glede na to, kje v vpadnem snopu se delec nahaja [9]. V to se lahko prepri amo s simulacijo, ki je dostopna na spletu [10]. Na sliki 1b je analiziran konkretni primer. (a) (b) Slika 1: (a) Na delec pada fokusiran Gaussov snop. Debelina ºarka ustreza njegovi intenziteti. (b) Center delca se nahaja na opti ni osi pred fokusom objektiva. Zaradi preglednosti lahko pri analizi vse vektorje raztegnemo za enak faktor, saj se zanimamo le za smer sile. Na podlagi sprememb g ºarkov ugotovimo smer sile na delec. (Slika 1a vzeta iz [11], slika 1b pa iz [12].) Vpliv odbitih ºarkov analiziramo na popolnoma enak na in kot lomljenih (slika 2a). Kadar se delec nahaja izven osi snopa, ima rezultanta sil komponento v smeri ²irjenja svetlobe in komponento v nasprotni smeri gradienta intenzitete. Za delce na osi snopa pa kaºe rezultanta sil samo v smeri ²irjenja svetlobe. Sila zaradi absorpcije kaºe v smeri gradienta intenzitete in vzdolº smeri ²irjenja svetlobe (slika 2b). V primerjavi s silo zaradi loma ali odboja je za prozorni dielektri ni delec zanemarljiva [13]. Delec lomi, odbija in absorbira vpadno valovanje. Zaradi loma deluje na delec sila v smeri fokusa objektiva. Tej sili nasprotujeta sili zaradi odboja in absorpcije, ki ºelita delec pospe²evati v smeri ²irjenja svetlobe. Za stabilno opti no past moramo zagotoviti, da prevlada sila v smeri fokusa. To doseºemo z zelo mo nim fokusiranjem vpadnega snopa, kar zahteva objektive z veliko numeri no aperturo N A. Ravnovesna lega (center opti ne pasti) leºi na opti ni osi malo za fokusom objektiva, kjer je doseºeno ravnovesje sil. Bralcu, ki bi si ºelel bolj kvantitativne razlage v okviru geometrijske optike, predlagam v branje [14]. 3

(a) (b) Slika 2: Sili zaradi (a) odboja in (b) absorpcije svetlobe v primeru kolimiranega Gaussovega snopa (obravnava je bolj nazorna kot pri fokusiranem Gaussovem snopu, ugotovitve pa so kvalitativno enake). Absorpcijo smo zaradi preglednosti mo no precenili. (Slika 2a vzeta iz [15], slika 2b pa iz [11].) 2.2 Kvantitativna razlaga v okviru valovne optike Kadar je premer delcev bistveno manj²i od valovne dolºine svetlobe (Rayleighovi delci), moramo za opis interakcije delcev s svetlobo uporabiti valovno optiko, kjer upo²tevamo, da je svetloba elektromagnetno valovanje. Delce lahko obravnavamo kot sevajo e to kaste dipole, saj se v elektri nem polju E polarizirajo in dobijo elektri ni dipolni moment p e = αe, kjer je α polarizabilnost delca. Zaradi majhnosti delcev lahko privzamemo, da je E na mestu delca homogeno, kar mo no olaj²a ra unanje. Nihajo e E povzro i nihanje p e, zato delec dipolno seva. Izkaºe se, da kaºe sila zaradi absorpcije in sipanja v smeri vpadne svetlobe in zna²a F scat = I 0n med σ ; σ = 128π5 r 6 c o 3λ 4 ( m 2 ) 2 1 m 2, (1) + 2 kjer je I 0 intenziteta vpadne svetlobe na mestu delca, σ sipalni presek krogle, r polmer delca, λ valovna dolºina vpadne svetlobe in m = n del n med efektivni lomni koli nik [9]. V nehomogenem nihajo em E deluje na elektri ni dipol Lorentzova sila. Ob upo²tevanju dejstva, da smo sposobni zaznati le povpre no silo (bolj podrobna izpeljava je v starej²em seminaru na temo opti nih pincet [16]), dobimo [9] F grad = 2πα c o n 2 med ( m I 0 ; α = n 2 2 ) 1 med r3 m 2. (2) + 2 V opti no past je moºno ujeti le delce z n del > n med, saj le v tem primeru kaºe F grad v smeri fokusa (v smeri gradienta intenzitete). Seveda pa moramo najprej z mo nim fokusiranjem zagotoviti, da prevlada gradientna sila, sicer odnese delce v smeri vpadne svetlobe. 2.3 Obmo je med valovno in geometrijsko optiko V praksi imamo ve inoma opravka z delci, katerih dimenzije so primerljive z valovno dolºino svetlobe. V tem primeru ne moremo uporabiti niti valovne niti geometrijske optike, ampak moramo re²evati Maxwellove ena be s pripadajo imi robnimi pogoji. Med zapletenim matemati nim postopkom se izgubi nazorna zika, zato podrobnosti ne bomo navajali. Bralcu, ki bi ºelel vedeti ve, priporo am v branje [7] oziroma ostalo literaturo na temo posplo²ene teorije Lorenza in Mieja. 4

3 Shema opti ne pincete Oglejmo si osnovno shemo opti ne pincete ter na kratko komentirajmo bistvene komponente. Poudarek bo na konceptih in ne na tehni nih podrobnostih. Bralcu, ki ga zanimajo tudi tehni ne podrobnosti, priporo am v branje [9]. Slika 3: Poenostavljena shema opti ne pincete. (Slika vzeta iz [9].) Opti no pinceto najlaºje naredimo tako, da jo vgradimo v invertni mikroskop, saj nam le-ta ºe sam po sebi nudi mnogo funkcij, ki jih potrebujemo (osvetljevanje ter tvorjenje slike, upravljanje z objektivom in mikroskopsko mizico). Pri invertnem mikroskopu se objektiv nahaja pod mikroskopsko mizico, zato sila teºe F g delno kompenzira F scat, kar efektivno pove a jakost opti ne pasti. Laser mora biti izredno stabilen, saj ºe rahlo spreminjanje smeri ºarka povzro i premikanje opti ne pasti, uktuacije v mo i ºarka pa nihanje jakosti pasti. Izbira valovne dolºine je odvisna od absorpcijskih lastnosti snovi v opazovanem sistemu. še majhna absorpcija lahko vodi do pregrevanja, kar je posebej problemati no pri biolo²kih vzorcih, zato pri le-teh uporabljamo infrarde e laserje z λ 1060 nm, saj je v okolici te valovne dolºine absorpcija zelo majhna. Mo i laserjev so med nekaj 10 mw in nekaj W [17]. Raz²iritev ºarka doseºemo z dvema le ama, ki sestavljata teleskop. šarek raz²irimo na velikost zadnje odprtine objektiva, da maksimalno izkoristimo N A objektiva. Krmiljenje ºarka doseºemo z akustoopti nim deektorjem (AOD) in sestavom le (L3 in L4). AOD je prozoren kristal, v katerem z zvo nim valovanjem ustvarimo uklonsko mreºico, na kateri pride do Braggovega odboja. S spreminjanjem frekvence zvo nega valovanja, spreminjamo razmik med reºami uklonske mreºice in s tem kot uklonskega maksimuma. Tako spreminjamo poloºaj pasti v ravnini pre no na opti no os. Z le ama L1 in L2 lahko kolimiran laserski snop spremenimo v divergentnega oziroma konvergentnega ter s tem spreminjamo poloºaj pasti v smeri opti ne osi. šarku spreminjamo nagib v konjugirani ravnini zadnje odprtine objektiva, saj le v tem primeru ostanejo lastnosti opti ne pasti enake in pride zgolj do premika pasti [12]. Dikroi no zrcalo je zrcalo, ki odbija svetlobo pri valovni dolºini laserja, vendar prepu² a svetlobo, s katero osvetljujemo vzorec. Objektiv mora imeti imve jo N A, zato uporabljamo imerzijske objektive. Ti se od obi ajnih objektivov razlikujejo po tem, da je prostor med vzorcem in objektivom zapolnjen s kapljico teko ine namesto z zrakom. Ve ja kot je NA, manj²i je premer snopa v gori² u, kar povzro i velik gradient intenzitete in mo no past. Ponavadi uporabljamo vodne imerzijske objektive (prostor med objektivom in vzorcem je zapolnjen s kapljico vode) z NA med 1 in 1, 2 [9]. Premer snopa v gori² u d fokus je dolo en z Abbejevim kriterijem d fokus = in infrarde i laser je d fokus 0, 5 µm. 5 λ 2NA [18]. Za vodni imerzijski objektiv

Kondenzor s fokusiranjem svetlobe osvetljuje vzorec. Imeti mora imve jo N A. CCD ali CMOS kamera ustvari sliko na podlagi svetlobe, ki jo zbere objektiv. Detektor poloºaja delca se nahaja v konjugirani ravnini kondenzorjeve zadnje gori² ne ravnine. 3.1 Interferenca v zadnji gori² ni ravnini Ena izmed metod zaznavanja poloºaja opazovanega delca je interferenca v zadnji gori² ni ravnini (ang. back focal plane interferometry) kondenzorja. Osnova metode je analiza interference med sipano in nesipano lasersko svetlobo. Zadnja odprtina kondenzorja sovpada z njegovo zadnjo gori² no ravnino. Detektorja ne moremo postaviti na opti no os kondenzorja, saj bi s tem zastrli osvetlitev, zato z dikroi nim zrcalom speljemo lasersko svetlobo ven iz opti ne osi kondenzorja. Z le o preslikamo interferen no sliko v zadnji gori² ni ravnini kondenzorja na ravnino detektorja. Poloºaj in premikanje delca lahko dolo imo iz poloºaja in premikanja intenzitetnih maksimumov, ki jih zaznamo s kvadrantno fotodiodo (KFD). Krajevna lo ljivost opisane metode je 10 10 m, asovna lo ljivost pa 10 6 s [6]. Krajevna lo ljivost, ki je ve redov velikosti pod valovno dolºino laserske svetlobe, je posledica uporabe ²tirih lo enih fotodiod, katerih signale med seboj ustrezno se²tevamo ali od²tevamo (slika 4). Posledi no zaznamo ºe zelo majhne spremembe v interferen nem vzorcu (signalu), ki so posledica majhnih premikov opazovanega objekta. Nadaljnjo izbolj²avo lo ljivosti omejuje termi ni ²um in ²um merilnih naprav. Slika 4: KFD so ²tiri lo ene fotodiode, postavljene vsaka v svoj kvadrant. S primerjavo signalov iz vsake fotodiode dolo imo poloºaj interferen nega vrha sipane in nesipane laserske svetlobe. Premikanje delca povzro i premikanje intenzitetnega vrha in posledi no asovno odvisni signal na KFD, ki ga ustrezno elektronsko obdelamo ter vodimo v ra unalnik. (Slika 4 vzeta iz [19].) 4 Nekaj metod merjenja sil z opti no pinceto Z opti no pinceto lahko zaznamo ali pa ustvarimo silo od nekaj 10 fn do pribliºno 100 pn, kar se dobro ujema z obmo jem sil na molekule v biolo²kih vzorcih [20]. Obi ajno merimo silo tako, da pritrdimo dielektri no kroglico (v nadaljevanju: sonda) na opazovani objekt in merimo odmik sonde od centra opti ne pasti x bead (slika 5). Za majhne odmike (x bead 150 nm [6]) je sila linearna funkcija odmika (Hookov zakon) F = k trap x bead, kjer je k trap merilo za jakost opti ne pasti (v nadaljevanju: koecient pasti). Slika 5: Odvisnost sile od odmika sonde iz centra opti ne pasti. Za majhne odmike velja linearna odvisnost (Hookov zakon). Sledi obmo je, kjer je sila pribliºno konstantna, nato pa sila naglo pade na 0. (Slika vzeta iz [20].) 6

Za natan no merjenje sil moramo poznati koecient pasti k trap in hkrati natan no meriti odmike sonde x bead. Oboje zahteva umeritev opti ne pincete. 4.1 Umeritev opti ne pincete Natan en pregled postopkov kalibracije je podan v [9]. Mi bomo navedli le dva principa kalibracije, ne da bi se spu² ali v podrobnosti. V praksi umerimo opti no pinceto s kombinacijo razli nih metod. Detektor poloºaja umerimo tako, da premaknemo opazovani objekt za znan premik in hkrati opazujemo signal na detektorju. Znan premik doseºemo s kalibriranim piezoelektri nim stojalom, na katerem leºi vzorec [6, 9]. Koecient pasti dolo imo s pomo jo Brownovega gibanja opazovanega predmeta v pasti. 1 Iz izmerjenih uktuacij odmika delca od centra pasti (slika 6a) izra unamo pripadajo i mo nostni spekter S(f), kjer je f frekvenca (slika 6b). Pri majhnih Reynoldsovih ²tevilih je viskozni upor teko ine bistveno ve ji od vztrajnostne sile delca, zato lahko slednjo v gibalni ena bi zanemarimo. V okviru teorije linearnega odziva teoreti na obravnava Brownovega gibanja kroglice z radijem r v harmoni nem potencialu s koecientom vzmeti k, ki je potopljena v teko ini z viskoznostjo η, napove mo nostni spekter oblike S(f) = k B T γπ 2 (f 2 c + f 2 ), kjer je k B Boltzmannova konstanta, T absolutna temperatura, f c = koecient hidrodinamskega upora [17]. Za f f c se (3) poenostavi v S(f f c ) S 0 = k BT γπ 2 fc 2 k 2πγ (3) prelomna frekvenca in γ = k BT 2πγ γπ 2 f c k = 2k BT πf c k. (4) S prilagajanjem izraza (3) na izmerjeni mo nosti spekter dolo imo S 0 in f c. Iz (4) izrazimo k = 2k BT πs 0 f c. Na tak na in dolo imo k opti ne pasti striktno iz meritev. Obi ajno lahko k nastavljamo od 0 do 1 pn/nm (mo laserja 1W) [17]. Kadar smo prepri ani, da lahko uporabimo Stokesov linearni zakon upora (γ = 6πηr), lahko dolo imo k neposredno iz izmerjene prelomne frekvence k = 2πγf c = 12π 2 ηrf c. Problem lahko nastane, kadar je delec blizu stene, saj takrat γ = 6πηr ne velja ve natan no. V nadaljevanju bomo privzeli, da imamo umerjeno pinceto. (5) (a) (b) Slika 6: (a) ƒasovni potek Brownovega gibanja delca. (b) Mo nostni spekter Brownovega gibanja. (Sliki vzeti iz [17].) 1 Energija termi nega nihanja je kbt 4 10 21 Nm. Pri k = 10 2 pn/nm je x 2 = k BT k 400 nm 2 δx = x2 x 2 20 nm, kjer smo upo²tevali, da je pri Brownovem gibanju x = 0. Zaradi izjemne krajevne resolucije δx zlahka opazimo [17]. 7

4.2 Merjenje sil molekularnih motorjev Opti na pinceta je odprla nove moºnosti pri prou evanju molekularnih motorjev. Ve na temo molekularnih motorjev najde bralec v seminarjih, ki so posve eni le njim [21, 22]. Molekularni motor je molekula, ki pretvarja kemi no energijo v mehansko delo [1]. Poznamo mnogo razli nih molekularnih motorjev, ki opravljajo razli ne naloge znotraj celice. Osredoto imo se na kinezin, katerega naloga je med drugim tudi celi ni transport. Kinezin ima dve nogi, s katerima hodi po mikrotubulu in pri tem prena²a svoj tovor. Imejmo stati no opti no past in molekularni motor, na katerega je pritrjena sonda, ki igra vlogo tovora (slika 7a). Motor pri premikanju vle e za seboj sondo, na katero deluje zaradi vse ve jega odmika od centra pasti vse ve ja opti na sila, ki zavira gibanje motorja. Na neki to ki je doseºeno ravnovesje med opti no silo in silo molekularnega motorja, zato se sonda prakti no ustavi. Iz odmika sonde izra unamo opti no silo in na ta na in ocenimo najve jo moºno silo, ki jo je motor ²e zmoºen razviti. Poskus te vrste je podrobno opisan v [1], mi pa navedimo le kon ne ugotovitve. Merili so pri treh mo eh laserja (15, 30 in 62, 5 mw), s katerimi so pokrili obmo je sil od 0, 40 do 6, 67 pn. Pri 15 in 30 mw (0, 40 3, 17 pn) je bil motor dovolj mo an, da je pobegnil ven iz opti ne pasti (polmer pasti 200 nm) ali pa se je pred asno odcepil z mikrotubula. Pri 62, 5 mw (1, 67 6, 67 pn) je iz pasti pobegnilo manj kot 1 % motorjev. Iz meritev premikanja motorja (slika 7b) so izra unali odvisnost hitrosti motorja od obremenitve (slika 7c). (a) (b) (c) Slika 7: (a) Princip merjenja najve je sile, ki jo je molekularni motor ²e zmoºen razviti. (b) Odmik kinezina od centra opti ne pasti v odvisnosti od asa. (c) Hitrost kinezina z nara² ajo o obremenitvijo pada linearno. (Slika 7a vzeta iz [20], sliki 7b ter 7c pa iz [1].) Hitrost motorjev z nara² anjem obremenitve (sile) pada. Kon na hitrost zna²a le nekaj % za etne hitrosti, ko je motor neobremenjen. Z ekstrapolacijo so ocenili maksimalno silo, katero je motor ²e zmoºen razviti (slika 7c). Dobljene vrednosti malo nihajo, saj so odvisne od podrobnosti, ki jih nismo omenjali (starost vzorca, koncentracija ATP...). Kljub vsemu lahko zaklju imo, da je najve ja sila, ki jo je kinezin ²e zmoºen razviti, nekje med 4 in 6 pn. 4.3 Elasti ne lastnosti molekul Elasti ne lastnosti molekul preu ujemo z merjenjem sile, ki se pojavi pri raztegu molekule. Vsak konec molekule pritrdimo na svojo sondo in nato s premikanjem sond raztegujemo molekulo (slika 8a). Elasti ne lastnosti molekul so zanimive, saj nam nudijo globji vpogled v ziko nekaterih biolo²kih procesov. 8

(a) Slika 8: (a) Princip merjenja elasti nih lastnosti molekul. Sondo lahko ujamemo v opti no past, ali pa jo prilepimo na mikropipeto. (Slika vzeta iz [20].) Kot primer si oglejmo merjenje elasti nih lastnosti DNK. Eksperiment je podrobno opisan v [2], mi pa bomo znova navedli le bistvene ugotovitve. Rezultat meritev je prikazan na sliki 9a, kjer se modre merske to ke nana²ajo na DNK v obliki enojne vija nice, vijoli ne in oranºne pa na DNK v obliki dvojne vija nice. (a) (b) Slika 9: (a) Meritve odvisnosti sile od raztezka za enojno vija nico DNK (modra) in dvojno vija nico DNK (vijoli na, oranºna). (b) Eden izmed moºnih modelov, ki pojasnjuje odvisnost sile od raztezka in histerezo. (Sliki vzeti iz [2].) Dokler je razmik med sondama manj²i od dolºine vpete dvojne vija nice, je sila zanemarljiva. Nato se molekula obna²a po Hookovemu zakonu, kjer velja linearna zveza med raztezkom in silo. V tem reºimu lahko dolo imo Youngov modul E molekule. Pri dolo eni vrednosti sile F c pride do neke vrste prehoda, saj se molekula, pri prakti no konstantni vrednosti zunanje sile, podalj²a na 170 % prvotne dolºine. Prehod je obrnljiv, vendar ima histerezo. Izrazitost histereze in konkretne vrednosti E ter F c so mo no odvisne od eksperimentalnih pogojev (okvirne vrednosti zna²ajo E 10 8 Pa in F c [40, 70] pn). Za majhne raztezke opazimo veliko razliko v proºnem odzivu enojne in dvojne vija nice. Pri velikih silah pa sta dolºini dvojne in enojne vija nice pribliºno enaki, iz esar sklepamo, da se dvojna vija nica razplete v obliko lestve (slika 9b B). Lestev se lahko na nekem mestu pretrga (slika 9b C), pri emer se razcepijo bliºnje vezi med nukleotidnimi bazami (adenin, timin, gvanin, citozin). Po prenehanju zunanje obremenitve, se DNK vrne nazaj v obliko dvojne vija nice povsod, kjer se vezi med nukleotidnimi bazami niso razcepile. Razcepljene vezi rabijo nekaj asa, da se ponovno tvorijo, zato potrebujejo ti deli DNK ve asa, da se vrnejo v obliko dvojne vija nice. Opisani scenarij je zgolj eden izmed mnogih modelov, ki pojasnjuje histerezo. 4.4 Meritve pri konstantni sili Delovanje molekularnega motorja lahko opazujemo tako, da vzdrºujemo konstantno silo. Odmik sonde od centra pasti spremljamo z detektorjem poloºaja. ƒim se odmik malo spremeni (zaradi delovanja 9

motorja), premaknemo center pasti tako, da vzdrºujemo konstanten odmik sonde in s tem silo na molekularni motor. Metoda zahteva povratno zanko z mnogo kraj²im odzivnim asom, kot je karakteristi ni as opazovanega procesa. Pakiranje nukleinske kisline v kapsido je del ºivljenskega cikla virusa. Pri tem se pove a elektrostatska in proºnostna energija nukleinske kisline, torej mora imeti virus znotraj kapside neke vrste motor, ki opravi potrebno delo. Oglejmo si primer bakteriofaga φ29 (s 6, 6 µm dolgo DNK v obliki dvojne vija nice in 42 54 nm veliko kapsido), ki je podrobno opisan v [23]. Prosti konec DNK so pripeli na sondo, ki so jo ujeli v opti no past. Kapsido so s pomo jo protiteles pritrdili na kroglico, prilepljeno na mikropipeto (slika 10a). Na DNK so delovali s konstantno silo F natezna = 5 pn, ki so jo vzdrºevali s premikanjem mikropipete in hkrati opazovali, kako se dolºina DNK spreminja s asom. Iz meritev so izra unali hitrost pakiranja (v nadaljevanju HP) v odvisnosti od deleºa zapakirane DNK (slika 10b). Po pribliºno 50 % zapakirane DNK za ne HP padati. To ni presenetljivo, saj se gostota DNK znotraj kapside pove uje, kar je energijsko neugodno. Zapakirana DNK sili ven iz kapside, s imer nasprotuje delovanju motorja, zato se HP zmanj²a. Kolik²na je sila F, s katero sili DNK ven iz kapside, lahko ugotovimo z merjenjem HP v odvisnosti od zunanje sile. Vzamemo le 1 3 celotne dolºine DNK, saj vemo, da se pri tej dolºini ²e ne pojavi F (na sliki 10b je HP pri 33 % zapakirane DNK enaka za etni HP). Izmerimo silo F c, pri kateri je HP enaka kon ni hitrosti pakiranja HP k, kadar imamo celotno DNK (slika 10c). Dobimo F c = F 50 pn (od²teti moramo F natezna ). Za kontrolo ponovimo postopek z DNK, katere dolºina je 2 3 dolºine celotne DNK. Dobimo precej niºjo F c, kar potrjuje obstoj F pri dalj²ih DNK. Po mnogo meritvah ugotovimo odvisnost notranje sile F, s katero zapakirana DNK nasprotuje nadaljnemu pakiranju, od deleºa zapakirane DNK (slika 10d). ƒe delimo notranjo silo s povr²ino kapside (znana iz uklonskih poskusov z ºarki X), ugotovimo, da je tlak znotraj kapside 6 atmosfer. Moºno je, da virus izkoristi ta tlak za vbrizganje svoje DNK v gostiteljsko celico. (a) (b) (c) (d) Slika 10: (a) Shema merjenja pakiranja DNK v kapsido virusa. (b) Hitrost pakiranja, podana v baznih parih (adenin-timin ali gvanin-citozin) na sekundo, v odvisnosti od deleºa zapakirane DNK. (c) Hitrost pakiranja v odvisnosti od zunanje sile za razli no dolgi DNK. (d) Notranja sila, s katero se DNK upira nadaljnemu pakiranju, v odvisnosti od deleºa zapakirane DNK. (Slike vzete iz [23].) 4.5 Dinami na spektroskopija sil Dinami na spektroskopija sil (ang. dynamic force spectroscopy) je metoda s katero prou ujemo vezi med molekulami. Princip metode je slede : na vez delujemo s konstantno hitrostjo obremenitve ( df dt ) in zabeleºimo silo F r, pri kateri se vez utrga. Eksperimentalno to izvedemo tako, da eno molekulo pritrdimo na kroglico, ki je pritrjena na objektno stekelce, drugo molekulo pa pritrdimo na sondo (ta netrivialni del eksperimenta nam zagotovijo kemiki z ustrezno pripravo vzorca). S premikanjem opti ne pasti zbliºamo molekuli, da tvorita vez. Nato imamo dve moºnosti: ali premikamo objektno stekelce ter drºimo opti no past pri miru ( df dx dt = k bead trap dt = k trap v bead ) ali pa vzdrºujemo konstanten odmik sonde x bead ter pove ujemo jakost pasti ( df dt = dktrap dt x bead ). Pri opti ni pinceti, ki omogo a ve neodvisnih pasti, lahko nadomestimo vlogo objektnega stekelca z drugo opti no pastjo. 10

5 Pomanjkljivosti opti ne pincete in viri merilnega ²uma Kot vsaka merilna naprava ima tudi opti na pinceta pomanjkljivosti, ki se jih moramo zavedati. Navedimo le dve izmed njih: Neselektivnost: v opti no past se ujamejo vsi dielektri ni delci, ki so dovolj blizu fokusa. Dodatni delci so ve inoma nezaºeljeni, saj se njihov vpliv naloºi na signal opazovanega delca, kar pove a ²um meritve [6]. Lokalno gretje: se pojavi zaradi visoke intenzitete svetlobe v bliºini fokusa (I = P laser S fokus 10 11 W m 2 za P laser = 100 mw in d fokus 0, 5µm). Biolo²ki procesi so precej ob utljivi na spreminjanje temperature, poleg tega pa lahko temperaturni gradient poºene konvekcijske tokove, ki ²e dodatno vplivajo na potek procesa [6]. Delovno obmo je: Viri ²umov so razli ni. Poleg elektronskega ²uma detektorja poloºaja in pripadajo e elektronike, je prisoten tudi mehanski ²um (tresenje mikroskopa in laserja) ter termi ni ²um (raztezanje in kr enje posameznih elementov opti ne pincete) [9]. S skrbnim na rtovanjem poskusa lahko na²tete vire teºav zmanj²amo do te mere, da je lo ljivost meritev omejena le s termi nim gibanjem [24]. 6 Zaklju ek Opti na pinceta omogo a natan no in kvantitativno raziskovanje procesov na molekulski ravni. Skupaj z ostalimi tehnikami (mikroskop na atomsko silo, magnetna pinceta...) nam nudi vpogled v procese, ki so bili do sedaj popolnoma nedostopni. Opti no pinceto najbolj pogosto uporabljamo pri prou evanju biolo²kih procesov, vendar njena uporaba ²e zdale ni omejena le na bioziko. Med drugim jo uporabljamo za: prou evanje anomalne difuzije in interakcije med koloidi, sestavljanje in poganjanje struktur v mikrouidiki ter sortiranju celic [25]. Glede na intenzivno raziskovalno dejavnost in hiter tehnolo²ki razvoj se lahko nadejamo, da bomo v bliºnji prihodnosti razvozlali ²e marsikatero skrivnost mikrosveta. Literatura [1] K. Svoboda in S. M. Block, Cell 77, 773 (1994) [2] S. B. Smith et al., Science 271, 795 (1996) [3] T. Boland in B. D. Ratner, Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 5297 (1995) [4] M. Hegner et al., Biological Single Molecule Applications and Advanced Biosensing, Emerging technologies in protein and genomic material analysis, Vol - 68, 241-263 (2003) [5] M. A. Lantz et al., Science 291, 2580 (2001) [6] K. C. Neuman in A. Nagy, Nat. Methods 5, 491 (2008) [7] M. Woerdemann, Structured Light Fields (Springer, 2012) [8] R. Podgornik in A. Vilfan, Elektromagnetno polje (DMFA, Ljubljana, 2012) [9] K. C. Neuman in S. M. Block, Rev. Sci. Instrum. 73, 2787 (2004) [10] http://www.ub.edu/javaoptics/docs_applets/doc_tweezersen.html (3.11.2013) [11] http://en.wikipedia.org/wiki/optical_tweezers (2.11.2013) 11

[12] J. W. Shaevitz, A Practical Guide to Optical Trapping (2006) [13] A. Ashkin, Phys. Rev. Lett. 24, 156 (1970) [14] A. Ashkin, Biophys. J. 61, 569 (1992) [15] http://optical-tweezers.com/radiationpressure.htm (3.11.2013) [16] M. Majcen Hrovat, Optical tweezers, dostopno na: http://maja.fmf.uni-lj.si/seminar/seminar.php (26.12.2013) [17] F. Gittes in C. F. Schmidt, Signals and Noise in Micromechanical measurements, Methods in Cell Biology, Vol 55 - Laser Tweezers in Cell Biology, 129-156 (Academic Press, 1998) [18] A. Lipson, S. G. Lipson in H. Lipson, Optical Physics, (Cambridge university press, 2011) [19] http://biopt.ub.edu/force-detection/back-focal-plane-interferometry (15.11.2013) [20] M. Capitanio in F. S. Pavone, Biophys. J. 105, 1293 (2013) [21] M. Juras, Molekularni motor dinein, dostopno na: http://maja.fmf.uni-lj.si/seminar/seminar.php (26.12.2013) [22] M. Juras, Stochastic motion of molecular motor dynein, dostopno na: http://maja.fmf.uni-lj.si/seminar/seminar.php (26.12.2013) [23] D. E. Smith et al., Nature 43, 748 (2001) [24] C. Bustamante et al., Annu. Rev. Biochem. 77, 205 (2008) [25] D. G. Grier, Nature 424, 810 (2003) 12