The Translocase of the Outer Membrane of Mitochondria (TOM Complex): Recognition of Mitochondrial Targeting Signals

Transcription

1 h oc o h Ou b o iochoi (O ox): coiio o iochoi i i iio zu u oo chbich ü Biooi ui-xiii- Uiiä üch o icu u i/uäi üch 2003

2 iio iich üich üu: uch: Ziuch: oou: o.... o.. J. o o.... u 2

3 O 1. OUO Oii, ucu ucio o iochoi oi io io iochoi iochoi i i h O cox B1 oi i o h u O ocu Bioo ho c io o i o. coi io o o hi cio zic iuio o io oio o co c uiicio i oi ic ho coi c cii Biooic ho oio o iochoi o. cii u ioio o iochoi b o. cii oio o iochoi o. c oio o iochoi ou b ic o. c oio o O cox o. c oio o ii o ou b ic o. c uiicio o hohou uiicio o iuoobui uiicio o cobi oi o-x i. coi io io xi hi o ioci b oi i io o o oi io io iochoi bii o oi o h ou b ic io o io bo xcio o-iuociiio xi ci o i ibi ih oub oi o o co u-o Biochic ho ichoocic ci ciiio o oi oiu uh ciiio o oi oi cocio iio oci cohoi Bu-i cohoi 33 3

4 ooi ii o o oi o iocuo/ b oi quiicio b uoioh/io hohoii ocio uoboi U coiio o oi b h io O cox o iochoi o O cox i b o bi i oc h oi h i ocio o h cuo i o uoi/bii o i u h io co o i o i ocio uoi o cuo ii qui o h o ucio o h O cox coiio o B1 cuo b h O cox B1 ic ih h ou iochoi b i boh coic hohobic icio h io O cox c bi h cuo o B h io h o h B1 cuo h co oi o70 o20 io i h coiio o h B1 cuo h io i o B B1 o o qui oub ib c coo o i coc io h cuo o B1 co h O cox i oo ucu UO oi icio ih h O cox cio o B1 oi ih h O cox i i o B1 hi coiio b h O cox h uiqu coiio io h o h B1 oi U BBO

5 1. OUO 1.1. Oii, ucu, ucio o iochoi uoic c ubii io iou b-bou co c c o. h oic icuu, h oi u, oo oxio o o bou b. co o h o, iochoi choo bo b o b. B o ucu/ucio iiii i u h iochoi i o bci hich icoo io uoic c b oc c obioi (ui, 1981; h, 1981). ui ouio, iochoi o o o hi o. o h joi o h iochoi oi co b uc, hiz o cooic iboo hu h o b io io iochoi o h coo (., 1999). iochoi oi bou 15-20% o cu oi ( i, 2001). iochoi h cox ucu. h o coi ou ubco: h ou i b, o quou co, h ib c (), h ix. h i b, i coio o h ou b, h uch uc. c b ubii io h i bou b h ci, hich o iiio (, 1952;, 2000). iochoi h i o oxii hohoio, h cox o h io chi i i h i b. iochoi o hou h ciic ci (b) cc coo i h ix io i io o h u cc, h biohi, -ci boi, biohi o hohoii, io ci, ucoi. h iochoi o io i h hi o coz (, 1999; ch, 2001). ui h i ho h iochoi io o i ooi (o c h), io/uu cu b, cc, i, i ucio (., 1998; i., 2001; iou, 2001; oii., 2001; Zzi o, 2001). iochoi ic ucu h oi ihi h c uo qu ch i ub ohoo, iii ui coiuou (ich u, 2002). h ic oc ouh o u oi iibuio o iochoi ui c iiio, qu oiio o o ho coic io h h couio i icu hih (oo ci, 2001). iochoi co b oo b c, iochoi 5

6 o b iiio o -xii iochoi. oh occu b iio o hi coiu ui h ih io o h c cc oi io io iochoi hiz iochoi oi coi ciic i i uu bou b co hich ii h oi i ocio-co cooio. h cho o h 70 ( hoc oi 70) i ciic co i (iochoi io iuio co) h ub coiz iochoi i i (ui., 1988; oi., 1996; ih., 1996). c, i ho h h cho 90, hich h b houh o c o i uci oi, i cooio ih 70, i i h i o ub o iochoi oi (ou., 2003). o iochoi oi io o-io (u, 1997); ho, io ci iboo o ih ocu coi iochoi cuo oi h b ob o ccuu o h uc o iochoi. c obio uo h i h co-io oc i io i h iochoi io o o oi. oo h ocizio o h icii o iochoi ciic o i o bioi (c., 2002; o., 2002) h oc o h ou iochoi b (O) i h o obb uc co iochoi oi io iochoi. h O cox ucio co o iochoi oi oi oi couci ch, houh hich iochoi oi h i uo cooio (i., 1986). coi h ou b houh h io o () o h O cox (icu i i ), io oi ic o o o o oc o h i b, h cox (i. 1). quc-ci oi ic o h 23 cox hich coi o h i i b oi, i17, i23 i50. h oi oci ih h b-bou i44 h ix h hoc oi 70 (., 1993, Bo., 1995; oo., 2002). Boh i17 i23 h ou ui b i oi oi i 90 cox ( J, 1993; übich., 1994). 6

7 + + + O cox O 23 cox ψ Ox cox OX1 cox ix i. 1. h io h io iochoi. oi i bi o ciiz io co o h O cox h ou b h o h iio o. o uh ocio, h O cox coo ih h cox i h i b. h OX1 cox i h i b i iio o cuo o h ix c io h i b ( o Bu., 2000). i23 coi i ch oi i h ib c h coiz cuo i h io ou (Bu., 1996). i oo h i io iu x io h ou b i boh iochoi b (ozu., 2000). uii i23, coiu io ioo o o o-ii hih-coucc ch (uco., 2001). i23 h b oo o o i i h bc o b oi uch h h io ch i co (Bu., 1996). cuo bii o h ib c oi i i iociio, oi h cuo o houh h io ch. i50 i i b oi, xoi h -i oi o h ib c ici ih h -i ib c oi o i23. i50 i oo o cii o h oci oi o h O cox o h 23 cox (i., 2002; oo., 2002; ojc., 2003). oi ocio co h i b o h ix qui o ii oc: b oi co h i b - io oo, hich coi o 70, i44 h co-cho 1. h 7

8 coo o h io oo i o ibii. o o h b oo o xi h o o 70 i oi io: (1) h Boi ch i hich o oio i io coi oio, (2) o o, hich i x b coo o h io chi (u Bu, 2002). h Boi ch o, 70 h i coo o ch, hich o o, bu o bc, o o h oi chi; oou Boi o o c b uc io coi o b cc o 70 bii (U., 1996; hui., 1998; u., 1998). uh uo o hi o obi b o i och: oi coii ch o uic ci o ci, (o o, ci) i o o o oi io io iochoi. hi occu houh 70 co u o h ch o uo h o oi, ic i o o bi o o o. co, oi coii ii iuoobui-i oi io io iochoi, i h c h oc o >200 qui o chic uo h oi. ic o ocu oo oc o oxi 5, 70 cou o oo uoi o h iuoobui -i oi b chic ui (Ooo., 2002). h o-o o oo h 70 uo cooio ch u o h oi chi. ui cc o 70 bii ou o u i ocio (o., 1997; i., 2001). io io h ix, h i i o h io oi c o b iochoi oci i (). h c o o oi h i o h ib c () o c c. h i c i b ; i co oci quc coi oi i o h i c b h 1 /o 2 o h ou c o h i b (.. cocho b 2, ox2) (ui., 1993). o o o h quc oi o h i i quii o obii h ucio cooio o io oi. o jo cho c i h iochoi ix, o i h oi cio o h io oi. 70 ic ih h co-cho j1 1. o oi ho o o 70 o ch hi i cooio (chi., 1996). o ub o iochoi oi, oi i b 60 i i o h cquiiio o h i cooio. b o h hi i o iochoi cho, h o 100 oi, o io o ui h o h i cc o o oi (oo ö, 2002). 8

9 h h 23 cox i i u b quc-ci hohiic ix oi i b oi ih ii ub o b, oh i b oi, i icu ho coii ui b-i oi o h 22 cox. hi oi oc i h io h i b i b oi- (ib., 1996; Bö., 1997; ch., 1997; oh., 2000). O o b i coo o hi cox o i. c, i22 i54; hi b oi, i18, iii i. cii, bu h o b c i h. c o. i22, i i b oi, i ucu o h i23 i17. h obio u h h oc ih h o b -uicio (Bu., 2000). i54 coi o o h o ic b-i i qui o h ic o i22 (ch., 1997). h 22 cox ic ih h, ucu oi o h ib c, i9, i10 i12, hich o qui o ci ocio (ib., 1996; oh., 1998). i9, i10 i12 oiz obb i o o ho-oioic 70 cox. h 9-10 cox i o o coi h ocu o i9 h ocu i10. co, h cox obb coi o h ocu o i9, o ocu o i10 o ocu o i12. h cox i oo oci ih h b-i coo o h 22 cox, h h 9-10 cox i oub i h ib c. i18, i22 i54 oh ih i oi o h ib c o cox o 300. h xc ucio o i18 i54 i i uc.. cii co o oi, i8 i13 h ucu o i9, i10 i12. Boh oi ociz i h ib c oiz i ho-oioic 70 cox. h oo o b io i h io o ub o iochoi i b oi uch i23 (ch., 2000; u., 2002). ub o i b oi (icui oi co b uc iochoi ) o b o iio o h iochoi ix io h i b. h oi oc io i hi h i h OX1 cox (u u, 1996). Ox1 i b o h hih co Ox1/i/b3 oi i ou houhou oo uo (Bu., 1994; Boo., 1994). x o oi h u h OX1 cox o hi b iio icu h iochoi co ubui 2 o h cocho oxi cox, ox2 9

10 hich h i b ic Ox1 i, uc co ooic oi h h b i i ( ox, 1997;.,1997) iochoi i i i i i quc i oi h boh c uici o ic oi o iochoi (u, 1997). h cic iochoi i i i io-i cb quc, hich ucio ixi i. h ch o o-iochoi oi, quc c ciic ic h co boh iochoi b io h ix (u., 1984; oich., 1985). quc coi c io ci iu. h quc o co b i oi o b hooou oi i i ci. coo i h bu occuc o oii ch, hox hohobic io ci iu h bc (ih xcio) o i ch iu. h quc h h oi o o hihic α-hix ih oii-ch c o o i hohobic uc o h oh. hi hic ucu o xi ho o i bou o i b-i io; i quou io h o o o b oi (oi., 1988). h hihic ucu o h quc i houh o b io o hi ciic coiio b h oi io chi (b., 2000). h h quc o o ix oi c o uo io b h iochoi oci i (), ix oi, uch ho, 3-oxo-c-o-hio choi 10 (10) hi ih ocb -i i i hich h chciic ii o ho o h c i (Ji., 1995;., 1995;., 1996). O ix oi, h hic i1, o h b ou o coi quc-i i i i cbox iu (., 1999). i bi quc ou i oi o h ou b, h ib c, h i b. h c, h oii ch quc oo b hohobic oi i h o h ciic o h oi i h ou o i b (ic., 1992; cbi., 1992; h., 1994; ä., 1995). o x, h ou b oi o70 coi i -i oii ch ch oo b hohobic. h o ucu coi h ioio o h i iio io h ou b o o70 (cbi., 1992). bii quc i u o o o oi o h i b (.. 10

11 cocho c 1 ) o h ib c (.. cocho b 2 ). hi c, oii ch ix-i quc i oo b oi quc icui hohobic ch c b oii ch iu. oo h h oi quc c o- i i o h cuo houh h i b. h oi quc c o h ou uc o h i b b h hoiic i b i (1-2) (ic., 1992). h o b o o hh h oi i co o i io io h ix h ic io h i b, hb bi ooic oi xo ( coi oi ) (., 1987; öch., 1996). o i b oi coi i i i h o coi o b oii ch ic i. hi i i i houh o o hii-oo ucu i h i b (öch., 1996). oi o h boi ci i o h i b o o coi cb quc, bu h ui i iibu houhou h i h o h oi (., 1987; u ou, 1988,., 1999). Oh b oi, uch coo o h i b oc (i17, i23 i22) o coi i oi i, icui hohobic oii ch oo (i. 1998; i., 2000; ch u, 2001) h O cox h ou b oc, h O cox, i uiubui cox o c. 450 coo o ubui (h o-c O hoo cox): o70, o40, o22, o20, o7, o6, o5 (u, 1997;., 2001) (i.2). h O cox i h ocio co iio io h ou b o iu uc co iochoi oi. c, i hou b b o coiz co o iochoi i i. oi coiz o h iochoi uc b h co ubui o h O cox, o20, o22, o70 (ö., 1989; i., 1990; oczo., 1992; i chz, 1993; ib., 1993). ubqu, oi io h oi couci ch o h O cox, o o h io/iio o (), oc houh h ou b io h ib c. h i o h O co cox, hich i coo o o40, o22, o7, o6, o5, bu o o coi h co ubui o20 11

12 o70 (hi., 1999). oo cuo i i o 22 o o Ou b o o 7 o 6 o 5 ix i. 2. oc o h ou iochoi b (O cox). h O cox coi h iii co o20 o70. h o co oo ch o h o h cox (h O co cox); h coio ih h oh o coo h i u o oubiiz iochoi, bu o u o ioou coiio. h O co cox o h oi-couci o coi o5, o6, o7, o22 o40. h o h o ubui c hi ocu ih ( o o, 2002). o 6 o 7 h o co oi o20 o70 ho i, bu i oi ciicii o oi (iho., 1995). h obio h i io o ih co c b o u h h co c ubiu o ch oh. oub io i h (., 1993). o70 coi ic icoi () oi hi o20 coi o uch oi. hi oi h o i oi-oi icio (uc., 1996, ou., 2003). Boh o70 o20 coi io-i b cho hohiic -i cooic oi o 65 17, ci (ö., 1989). o20 coiz i oi h c quc, bu c o oi ou h bi o o20 houh h c iochoi quc, i h ou b oi oi (chi., 1997), o40 (o u, 1999), h ib-c oi cocho c h (i., 1999) h i b oi i22. c h ocu bi o h quc bii o o20 b i (b., 2000). h quc bii oc o o20 i o b h α-hic h c hohobic ch ci ch hohiic io ci iu. hi ch 12

13 ic ih h hohobic c o h hihic α-hix o h quc, h h oii ch hohiic io ci iu o h c o h α- hix xo o h quou o. iio, icio o h quc ih h cooic oi o h o20 obb i b ioic icio, hich ih xi h i u o h oii ch hox io ci o h -i quc. o70 bi i o hohobic oi h coi i i ioio. o70 h c o o i, h b cho i oib o, o coibu, o iizio (ö., 1992; i ho, 1994). o oh co coo iii i. cii: o71 o37. i h c h o71 i co o o70 (53% quc ii, 70% iii), h o co o o o iic ucio: h io o o70- oi i ii c b h io o o71, ici o h c o bc o h o70 co (cho., 1996). o37 b i i o-i b oi ih o ui b oi, bu oub u o o37 ih o70 o ih o20 h (z., 1995). h co coo u o o o ic ici ubcox: hoi coo o o70 o37 co o coo o o20 o22 (z., 1995,., 1995b). Boh co cox h bou oi o. hi cox o22 io o. i, o22 ic ih h quc iio o cco io co. co, o22 i i o h iio o ( i., 1999). o22 i h icio o h o20 ih h, i o ic ih h hohiic i o quc (Bix., 1997). o22, oh ih o5, i h iio o h oi chi io h. o22 x -i oi o 85 io ci iu i h coo, h i b, h -i oi (45 iu) ci h ib c. h cooic oi o o22 i chciz b buc o i ch. h oi couci ch o h i obb o b o40 ocu, h o i o oi i. o40 h b ub i oi-i ih β- h o β-b ih o o c. 2 i ih (i., 1998; ü., 1998). cobi. cii o40 o i o40 o. c coiu io ioo. h o cio-ci hih-coucc ch o hich iochoi i quc o h ci i 13

14 o h b ciic bi (i., 1998; hi., 2001). o oo h o40 iuou oci ici ih i i coiz h i quc o iochoi cuo oi (o., 1997; o., 1998b; oo., 2001). h io i o40 o. c i oiz i hih ocu cox o oxi 350 (hi., 2001). co icoco o uii o40 ic ii ih o c o i ccuuio. h ub o o ih i o oxi 2.5, ii o h o ou i h O cox (ü., 1998; hi., 2001). h iio O co ubui o22, o7, o6, o5 c o h bii h ic uio o h cox. h ucio o h o oi, o7, o6, o5 o h. cii o i uoo. o5 i bi o x co-i ucio b i o oi o h o22 co, bu i i o o h ubqu iio o oi chi io h ocio o (ii., 1997). o6 o7 o b io i h uio o h b ib o co oi ih h (öi., 1996;., 1998). c i h b ho h. c o6 o7 i h icii o o40, hi o6 o obb h i b o40 o22 (boi., 2001). o h ocio o oi co h ou b, ih h b oi o i c. o ix- oi i oo h h O cox oi bii i o ch i o h ou b. h cooic oi o o20, o22, o5 o h ci i o h O cox, hich bi h quc ib i ii (., 1995c; Boi., 1995). o40 o b oib o h oio o h i, hich i ociz h i c o h b (o., 1997). i bii occu ih uch hih ii h ci i bii (., 1995; o., 1998b). i h h ocio co h ou b i i b h qui icio o h quc ih i ou o h O cox h bi h oi ih ici ii h B1 oi h ubiquio-cocho c oxiouc (cocho bc 1 cox) o h io chi i coo o h cic ubui: h iochoi co cocho b, h uc co cocho c 1 i oi. h oi, 14

15 oh ih i o oh o-cic ubui b o o zic ci cox.. cii h o-cic ubui o1, o2, c6, c7, c8 c9 c10 (zoo, 1995). ocho b iii o ubcox ih c7 c8, hich ubqu joi ih h o1 o2 oi. ocho c 1, o h oh h, i oo o o oh ubcox ih c6 c9 (i, 1989). h cocho b h cocho c 1 cox ubqu ui o o h cocho bc 1 cox, io o h b o h i oi ub h o-i ubui, c10 (Xi., 1997; Zh., 1998) (i. 3). i c 1 + c 1 ix b 68 o 1 o 2 b o 1 o 2 Bc1 Bc1 i. 3. o o - icio o B1 ih h cocho bc 1 ucox. B1 ic i - ih h cocho bc 1 cox; i o ii i i co o h ubqu b o h i oi., i b;, ib c;, i oi; b, cocho b; c 1, cocho c 1 ( o uci., 1999). B1 i iochoi i b oi b o h hih co, h oi i ( oci ih i cu ciii). b o hi i i ui b hi co quc oi, hich co -bii i coii B box. i b io i i o cu oc, icui ic-i o, ooic io, c cc uio (B, 1997; ich, 1998). B1 iii uo chcizio o u ici i io cii. io o h cu icic i h b o cocho bc 1 cox; cox i ou h c h i oi. B1 ic i - ih h cocho bc 1 cox; i o ii i i co o h ubqu b o h i 15

16 oi. h cocho bc 1 cox, B1 occui i ubqu b h i oi, ui h boh oi cou h ii ucu iiii (uci., 1999). h B1 oi i cho i h iochoi i b i i b oi (iu 45-68). ho -i i i xo io h ib c (iu 1-44), hi h bu o h oi i i h ix (i ou - i oiio). h b cho i oo b ho oii ch (iu 69-83) h i ic o o hihiic hic ucu (i. 3). hi coi oi oci i h i o c h i h cox o i i quc (öch., 1996). h -i quc o B1 o o i bc o iochoi i i, i icu coii o i h oii ch. o o B1 co ih h i iochoi b ui i o i b öch., oo h ui i ocio co h i b, hich i i b h 23 cox, ih oo ucu i o i hich h b oi coc h hohobic i o h hihiic α-hix. o, h chi b hich h O cox coiz oc h B1 cuo i o b uci i o h u h i o o hi u o obi iih io h chi b hich h O cox coiz co i o iochoi i i. h oibii o io oubiiz O cox oi oo o u hh cuo oi coiz b h O cox, i h bc o cooic cho ii i bi ucu. oh i o hi u o u B1 o oi o u h h i i cuo ih i i oi ioio ho h i co b h iochoi O cox. iio quio hich coo o h O cox c i hi coiio i hich cooio B1 ic ih h O cox uo ocio co h ou b. 16

17 2. O 2.1. ocu bioo ho c ioio o i o.coi c io o i o ccoi o h i i ho (Biboi o, 1979). B-iu (2 ) coii h oi ibioic iocu ih i bci coo icub (O, 37 ) u ioou iio coiio. o 1.5 cuu h b ciuio (7,500x, 30 c). h ui c u i 300 µ bu 1 (50 i-, 10-2 x 2 O, 37%, 8.0) coii 100 /, c i o b i 300 µ bu 2 (0.2 O, 1% ). h ix b ii h ub 5 i o 5 i. o uizio, 300 µ bu 3 (3.1 Oc, 5.5), h ix ii b ii h ub 5 i. ciuio (35,000x, 10 i), h u (coii h i ) o ub h cii b i 600 µ iooo (96%). h i ciuio, h ih 70% co ho, i, u i 30 µ 2 0 u o uh i. o c io o i (u o 0.5 ) J i (o) u. B-iu (50 ) u ih h oi ibioic iocu ih bci ci h qui i icub (O, 37 ) u ioou iio coiio. h bci h b ciuio (3,000x, 10 i) u i 4 o bu 1 c i o b i 4 o bu 2. h ix b ii h ub 5 i o 5 i. uizio b i 4 o bu 3, ciu (31,000x, 10 i, ). h u i o io-xch cou, iou quiib ih 10 bu 4 (0.15% / io X-100, 0.6, 100 Oc, 5.0). h cou h ic ih 10 bu 5 (0.8, 100 Oc, 5.0) h i u b i 5 bu 6 (1.25, 100 i-, 8.5). h cii ih iooo, i (23,700x, 30 i, 4 ), h ih 70% ho, i u i ou o 2 O. 17

18 io o io o o iou cib (o., 1990). -iu (5 ) iocu ih. cii c icub (O, 30 ) u hi coiio. h c h b ciuio, h ih 2 O, u i 200 µ bu (2% io-100, 1%, 100, 10 i-, 1, 8.0). ix: ho/hooo/ o coho (25:24:1) (200µ) 0.3 b h ox o 2 i ciu (35,000x, 5 i). h u (h quou h) o ub h cii b i 2.5 o. o 100% ho. h o 10 i 20, ciu (35,000x, 10 i), h ih 70% ho. h i, u i 40 µ 2 O u o i o hi cio () h quc ii b o hi cio (), ui hob o. ix coi (o 100 µ): 1-2 U o (q-o /o u-o), 10 µ -bu (1% io X-100, 100 i-, 500, 15 2, 8.8), 2 µ (10 oc), 50 i 200 i o 1 µ oic. h ooi o u: 1) 3 i, 94 uc iciio co uio; 2) cc: 1 i, 94 uio; 1 i, i o oioucoi i; 1-6 i, 72 hi (xio) (h uio o hi i i b h h o h o b ii) q-o: 1 i/1b u-o: 2.5 i/1b; 3) 5-20 i, 72 coio o h cio. h ii z b o cohoi zic iuio o o ic i uo i i ih ciic icio ouc (u o 5 U o z o 1 µ ). h icubio i, u h bu u i i cio ccoi o h ucu` 18

19 coio. h obi z b o cohoi o ic io ui io-xch chooh (i). 4- i u o i ; iiz co ( ) 2-5 i o cocio xc o () o b i, icub (i 20 µ cio) ih 2 µ o 10x iio bu (50 i-, 10 2, 5% (/) -8000, 1, 1, 7.6), 1 U 4- i (ibco-b). h cio o 14 o 12 h o o 3 h. h cio o b icii h z (10 i, 65 ). h i u o o. coi co c io oio o. coi co c io o co c o io o co c o cooio, i coo o h cooi. coi i iocu io 5 o B-iu o (O, 37 ) u o hi coiio. h oi, 1 B-iu iocu ih h oih o. coi c. h c o uh ui h ch h oihic oh h (O 578 = 0.5). i h o ic o 30 i, h c h b ciuio (4,400x, 5 i, 4 ) h ubqu ih 500, 250, 50 10% (/) co. h co c i u i 500 µ 10% (/) co, iquo, o 80. o h 2 oio ho, cuu o 1 co c o o O 578 = 0.5 bo. h cuu h o ic o 10 i h c h b ciuio (2,800x, 10 i) u i coiio. h u i (i ouio o o ic) i o ic o 30 i. h, h c u i , i i u i 2 75% co (/), iquo, o 80. oio i cooio. coi co c (40 µ) icub ih 1-5 µ iio ixu o 30 c o ic. h uio o ic-co cu h cu iouc i cooio u, u (Bio) (2.5 ; 400 oh; 25µ; i co 8-9 ). bi icio o hih cic o o h c, h uio iu ih 800µ B-iu, icub o i 37 u o hi coiio. h o c h b ciuio o B-iu u ih h oi ibioic. h icub O

20 oio i 2 ho o h 2 ho, h co c icub o ic o 30 i ih 1-5 µ iio ixu. h hoc (2-5 i, 42 ) h c icub i o ic o 5 i. h, h c h b ciuio, u i Biu, icub (40-50 i, 37 ) u o hi coiio. h oio co cib bo o h cooio ho uiicio i b cohoi i hoizo o (0.8-3%) ccoi o hi ocu ih. h ix ih oi bu (6% (/) co, 0.05% bohobu, 0.05% xco) cohoi o i -bu (4.84 / i-b, 1.14 / cic ci, 1, 8.0). h o ouio coi 0.5 µ/ hiiu boi, o o iuizio o i u U ih. qui o uh o cu ou o h ih c c xc o h io ui io-xch chooh i (i). o i h cocio, h boio o ouio u 260. O o 1.0 coo o cocio o 50 µ/ o oub, 33 µ/ oo, 40 µ/ o 20 µ/ oioucoi oi i u: i c 4-., B1 öch., B1 65 öch., B1 82 öch., B1(1-86)- öch., B1(1-126)- öch., B1(1-126)- hi hi 4-B1(84-126)- hi hi 4-B1(66-86)- hi hi 20

21 4-B1-(ox)-B1 hi hi 4-B1-(1)-B1 hi hi 4-B1-(u9)-B1 hi hi 4- u., u9(1-69)-., B1(1-250)- hi hi 60- u., u9(1-69)-b hi hi 60-u9(1-69)-., 2000 oi i 4-B1(1-126)- h quc coi h i 126 io ci iu o B1, bu ihou h b oi, ii b ui h 4-B1 (öch., 1996). h ooi i u: i -i (coii co cui i): 5`- -3` i -i (coii cui i): 5` -3`. h ouc i ih co ubco io h co / cui i o 4 co coii h coi quc i b B/i cui i. h io ci () iouc b h coi ocu io h joii io b h B1 h. 4-B1(84-126)- h quc coi io ci iu o B1 ii b ui h 4-B1(1-126)-. h ooi i u: -i i (coii co cui i): 5`- -3` -i i (coii c cui i): 5`- -3`. h ouc i ih co c ubco io h co /c cui i o 4 co coii h coi quc i b c /i cui i. 21

22 4-B1(66-86)- h quc coi io ci iu o B1 ii b ui 4-B1. h ooi i u: -i i (coii co cui i): 5`- -3` -i i (coii cui i): 5`- -3`. h o h coi ocu o cib o h B1(1-126)- couc. 4-B1-(u9)-B1 h i, h 4-B1(1-69)-u9(1-48)- couc. h quc coi io ci iu 1-69 o B1 ii b ui 4-B1 h ooi i, boh coii co cui i: -i i: 5`- -3` -i i: 5`- -3`. h ouc i o boh i ih co i io h co cui i o 4 co h coi h u9(1-48)- coi quc (h co cui i oc u o hi coi quc). x, h quc coii h o h co b iio ih B/i c ih h ouc coi iu o B1. hi ouc obi ui 4-B1 h ooi i: -i i (coii B cui i): 5`- -3` -i i (coii i cui i): 5`- -3`. 4-B1-(ox)-B1 i, quc coi io ci iu o B1, obi cib bo, iouc io h B/i cui i o 4 co. x, quc coi io ci iu 1-22 o ox ii b, ui 4-ox -. h ooi i u: 22

23 -i i (coii cui i): 5`- -3` -i i (coii B cui i): 5`- -3`. hi quc i ih /B i io h /B cui i o h 4-B1(84-458). i, h quc coi h io ci iu 1-68 o B1 iouc io h co/ i o h bo obi co. o i io ui, h 4-B1-(ox)-B1 i ih co/i i io h xio co X142 cu ih h z. 4-B1-( 1 )-B1 h quc coi io ci iu o ocho c 1 ii b ui 4-i23-1 ( ). h ooi i u: -i i (coii B cui i): 5`- -3` -i i (coii B cui i): 5`- -3`. h ouc i ih h cooi z i b h B/B cui i o 4-B1 i. o i io ui, h 4- B1-( 1 )-B1 i ih B/B i io h xio co X142 cu ih h z. 4--B1(1-250)- h quc coi io-ci iu o B1 c h -i o, ii b ui 4--B1 h ooi i: -i i (coii co cui i): 5`- -3` -i i (coii cui i): 5`- -3`. h obi quc iouc io h co/ cui i o 4 co h coi coi quc b h B i cui i. 23

24 70-u9(1-69)-b h coi hi couc ii ui 60-u9(1-69)-b h ooi i: -i i (coii B cui i): 5`- -3` -i i (coii i cui i iouci 6xi h - i o h oi): 5`- -3`. iio ih h cooi z, h couc i io h 70 xio co o io h. coi B21(3) i ic ho coi: uu i. coi i u: 1, X1-Bu, B21(3). i o. coi B-iu: 1% Bco-o, 0.5% xc, 1% ; B -iu: B-iu u ih 100 µ/ icii. h cib i u o i iqui cuu. o ih oi i, 2% / bco-. Bco-, uco i uoc. h oi ibioic h i chi o c: uu i. c i u: 74, 107 (o22 coi 6xi h - i). i o. c c ouio: 50 iic ci, 50 ZO 4, 10 (( 4 ) O 4 ), 2.5 u O 4, 0.5 O 4 x 2 O, BO 3 ( ), oo 4 i 1 2 O. Bioi ouio: 100 ho, O, 20 bioi. 50x o ii iu: i x 2 O, O 4, O 3, 10 O 4, 5 2, 5 c -ouio, 2.5 bioi ouio i 1 2 O. o iu: 2% 50x o ii iu, 1% (/) co, 1% (/) u, 0.2% (/) xc; 0.1% (/) ciho.. c oh. c oh o iou cib (i, 1970). 24

25 Obii h coii oii oh o i 250 o co iu u ih 2%, o h h c cou o u. h iu iocu ih iic i hh icub o 3-7 i h, oo b uh 3-5, ih, o iu coii oio. o coc h coii, 50 i 2 O h uio i houh i coo. h cocio o coii uio i b coui u h ih icoco. oh o hh o io c iochoi o. c i 74 i, 1 o -iu (930 2 O, 20 50x o ii iu (o, 1964) uco; h coo uoc ) iocu ih 10 coii uio (10 8 c/) icub (15 h, 25 ) u ih io. h hh coc b iio. o obi ou o hh, 100 cuu (coii 2 uco 2 50x o ii iu) iocu ih 1 coii (10 8 c/) icub (24 h, 25 ) u ih io coiio. o oi h. c 107 i, h iu u ih 1.3 hiii. h hh coc ih iio, u o iochoi o O cox ioio cii: uu i. cii i u: i o c u3-1 hi ohi, o u2-3 u2-112 c1-100 oic ih 190 ( ) u ic, oubi Uii, o 303-1B α 2-1 u3-1 hi ohi, o u2-3 u2-112 c1-100 u ic, oubi Uii, o 334- u2 u3-52 o., B α (ho+) ocio o icooi B 4743 /α, hi3/hi3, u2/u2, Bch., 1998 u3/u3, 15/15, 2/2 bc , bc1::3 ob.,

26 bc1 /α, hi3/hi3, u2/u2, u3/u3, 15/15, 2/2, bc1:: X4/ (hoozou ioi io i o bc1 i B4743) i., 2002 i o.cii -iu: 1% xc, 2% o, 5.0 (ju ih ); -iu: -iu u ih 2% uco; -iu: -iu u ih 3% co; -iu: 0.17% (/) io B, 0.5% (/) oiu uh, 1.5 / o-ou ix o (ix coii qu ih o io ci; o ci o uxohohic, h cooi io ci ou ), 2% uco o 3% co cbo ouc. h cib i u o i iqui cuu. o ih oi i, 2% / bco-. Bco-, uco, i uoc.. cii oh. cii oh o iou cib (boo., 1989) i co iu o, h cio o h uxoohic c, o -iu. h c icub 30, u hi coiio. o i h oh chciic o i, iuio o. h i o i iqui cuu o h oihic h. qu ou o c (0.5 O 578 ui) o cuu io, u i 500 µ 2 O, i o 1:10 iuio ; 5 µ o ch iuio o o o. h u cou b 2-4 icubio h oi u. oio o. cii (ihiu c ho) h cooi i o O i -iu iu h x oi i 50 iu, o O 578 o 0.2. h c uh o i h ch O 578 o 0.8, o i ciu ub, h b ciuio (1,000x, 3 i, ). hi ih 25 o i 2 O, h c h u h coiio, u i ihiu c o o ub. h ciu i (7,500x, 15 c) h c u i 400 µ 100 ihiu c. o ch oio 50 µ uio o c ciu (7,500x, 5 i) h u 26

27 o. h ooi ixu o h c: 240 µ 3350 (50% /), 36 µ 1 ihiu c, 5 µ i o (10 /; iou icub o 5 i 95 ), 50 µ 2 O coii µ o b o. h ix ox o 1 i icub o 30 i 30, ih o hi, oo b i icubio 42. h c h b ciuio (3,000-4,000x), u i 800 µ -iu, uh icub o 2 h 30º. hi, h c u i ou o iu, o ci oi i. h icub o o co o Biooic ho oio o iochoi o. cii iochoi io o. cii ooi iou cib ho (., 1994). c cui o O 578 o 1-2, h b ciuio (4,400x, 5 i, ), h ih 2 O u o i cocio o 0.5 / i bu (100 i/o 4, 10 ihioio (), 9.4). h c uio icub o 15 i 30 ih o hi, oo b ciuio u i 100 o 1.2 obio. o i h c, h c u i Zo bu (1.2 obio, 20 oiu hoh/o, 7.4) o cocio o 0.15 / icub ih 3 Zo / ih o i 30, u o hi coiio. o h c iio (obii o ho), 50 µ c uio iu ih 2 2 O o io ouio o 1.2 obio. oio o ho co h h O o h 2 O iuio 10-20% o h O o h obio iuio. h ouio o ho i u 2 O bco c bcu ho bu u h coiio. h ubqu o 4. h ho io b ciuio (3,000x, 5 i, 4 ), u (0.15 /) i hooizi bu (0.6 obio, 10 i/, 1, 0.2% (/) B, 1, 7.4), hooiz 10 i i ouc- ooio. h c uo c i b oub ciuio (2,000x, 5 i, 4 ). h u ciu (17,400x, 12 i, 4 ) h i iochoi u i bu (10 O/O, 250 uco, 1, 7.4) i o c 27

28 (2,000x, 5 i, 4º). h iochoi i i bo. i iochoi u i ou o bu, o cocio o 10 / oi, iquo, oz i iqui io, o 80º i u u ioio o iochoi b o. cii cooi o 10 O ui h b ciuio (3,000x, 5 i) h ih 2 O. h c u i bu 0.3 b (i 0.3 ). h ox 4 i o 30 c ch, ih 30 c b i b (ui hi b h icub o ic). ciuio (1,000x, 3 i) h u o ub ciu i (10,000x, 10 i, 4 ). h coii iochoi u i 25 µ bu (60 i/ 6.8, 2% (/), 10% co, 0.02% (/) bohobu, 5% β-coho), h o 10 i, z b oio o iochoi o. c h (10 ih), o cib bo, ix ih 15 quz 20 (bu u ih 1 ), ou i o o 1-2 i. h ix ciu ic (3,000x, 5 i, 4º) o i o cu iu, h iochoi i (17,000x, 12 i), u i 30, i i i u i h iochoi u o io xi ihi 1 h o i h z uu h ou b. o c io o iochoi, c o io o ou b ic, h ooco oo, ih oiicio. h o 100 cuu (1-2 ) ix ih 3 1,5-3 quz, hooiz o 3x10 c i i b, houh i i (b., 1979). h iochoi io o h hoo b ii ciuio bo. h o ciuio o 50 i 17,700x. Bo h ciuio, h iochoi u i bu (250 uco, 10 O/O, 7.2) oio o ou b ic (O) o. c O io iou cib (., 1993). iochoi io o. c u i hooic i bu (5 oiu 28

29 hoh, 1, 1, 7.2) o cocio o 2 / icub o 30 i 4. h iochoi b io b ciuio (17,700x, 4 ), u i icub i i bu, (5 i, 37 ), i io uoic -o-ooio (60 chi) hooiz (40 i, 0 ), i o o h ou b o io (iochoi ih iu ou b). o h io i uco i ciuio, 20 hoo u 10 o 0.9 uco uco i (1, 10 O, 1, 7,0) ui 1 h ciuio (141,000x, 4º), i Bc 28 oo. h ic iochoi, io, i b ou h boo, h O coc i h ii i cio, b h uco i. hi i coc ju o 0.9 uco cocio ih 2 uco. co ciuio i, 15 u uco i 3 (o uco), ciu (10 h 141,000x, 4 ). h O coc b 0.72 h u i. O iu 1:2 ih 10 Oc bu, 7.0, i i ciuio (141,000x, 30 i, 4 ), u i ou o h bu, oz i iqui io, o 80 i u oio o O cox o. c oio o h O hoo cox o cib bo (ü., 1998). h O o. c i 107 u o i cocio o 1 / i oubiizio bu (50 Oc, 10 O, 20% co, 1.25% iioi, 1, 7.0) icub (30 i, 4 ) u o hi coiio. h uio i i (226,200x, 30 i) h u o oo i- cou o 1 /i (1 i- b/10 O). h cou h ih 2 cou-ou o oubiizio bu coii 1.25% iioi ih 20 cou-ou o oubiizio bu coii 0.5% iioi. uio o h uciic bou i o ih i cocio o 0 o 60 iizo h uio o h bou O cox o ih oubiizio bu coii 0.5% iioi 300 iizo. oio o O co cox o. c iochoi o cib bo (hi., 1999). iochoi (5 ) u i oubiizio bu (50 Oc, 10 O, 20% co, 1% oc oi 29

30 (), 1, 7.0) o i cocio o 10 /, icub (30 i, 4 ) u o hi coiio. h uio i i (226,200x, 30 i) h u o o o 3 /i oo i- cou iou quiib ih 1.5 cou-o o oubiizio bu. h cou h ih 8 cou-o o -hi bu (50 Oc, 10 O, 20% co, 0.1%, 30 iizo, 1, 7.0) h o. h bou i u ih 50 -uio bu (50 Oc, 10 O, 20% co, 0.1%, 300 iizo, 1, 7.0). o co uiicio h i u o h i- cou o ih o o 1 /i oo io-xch cou (hci Bioch), iou quiib ih 2 cou-o o ouc bu (50 Oc, 10 O, 20% co, 1%, 1, 7.0), 2 cou-o o ouc bu B (50 Oc, 10 O, 20% co, 1%, 1, 1, 7.0), 5 cou-o o ouc bu. h bou i u ih 10 i i o 0-50% ouc bu B, o o 0.5 /i 0.5 cio coc. h O co cox u oio o ii o ou b ic o. c oio o ii o ou b ic o. c oo iou cib ho (Bih, 1959). o h xcio o u o 1000 o o ii hohou, 1 o o O (coii oi), ix ih 1 o o 0.1, 2 o o ho (o o, i h ouio c), 1 o chooo; 10 c o oxi, 1 o o chooo h ob ox i i o h obi. h ix ciu (1,100x, 5 i) h ubh (chooo h) coc ih u i, h ic ih 1 o 2 O, io b ciuio (h ob ui ih ou io bo ch ciuio, i o o oi ii oxiio). h chooo h coc o h ciuio ix ih qui ou o ioiz 2 O ciu i. x, h chooo o i oi oo i ii i obi. h ii i io ih i chooo/ho o ii, o i h oi bu o oi xi ih h O cox. 30

31 uiicio o hohou coii ii o i, i ub, 180, ui ih 300 µ 70% choic ci icub i (1.5 h, 180 ) i hi boc. chii h ub o, 3 oiu ob ouio, 120 µ i ubbo h ox boi o uh 15 i 100. h ii o h bu coo o h ob ooio o h qui o h coi hohou; h O u 830. h u co ih cu obi ih 2 O 4 ouio. o i h oiu ob ouio, 11 o oiu hob x 4 2 O io i % 2 O 4, h ouio i ih ii 2 O u o 5. o i h i ubbo, O 5, 1 2 O 3, io-2-o-4-uoic ci, io O i 200 ii 2 O. iio, h o i h uiicio o iuoobui () iu (4 ) ciu, (20,000x, 20 i, 4 ) h hi uc i o ii o. h iu iu ih 10 o bu (100 i 8.5), i, o oo 5 oi -uo cou (hci), iou quiib ih bu. hi h cou ih 5 cou ou o bu, h bou u ih bu B (100 i/o, 3.0). h u ii uiz ih 2 2 i/, 8.0, iz O i 5 o 2 O coc i ohiizio. h u i 10 O/O, 7.2 o i oi cocio o /, iquo, o 20º i u uiicio o cobi oi o-x i. coi uiicio o cobi ou o. coi o cib bo (ucio., 1997). h. coi i coii h i 18 co o (O, 37 ) i ou o B -iu. h x oi h cuu iu o O 578 o 0.1, uh icub i i ch O 578 o 0.6, iuc o 2 h ih 1 iooi-β,-iocooi (). Bci h b ciuio (3,000x, 5 i), h ih 2 O, u i 20 o bu (50, 50 -hoh, 0.025% oz, 1, 8.0) icub o 20 i 0 i o o h c o obi ho. h 31

32 ho io i ciuio (3,000x, 5 i), h ih h bu, bu ihou oz, u i 20 o bu coii 50, 50 -hoh, 10% co, 10 iizo, 8.0 o ihibio. h uio o ic oic 5 i o 30 c ih Bo oico 450 (30% u; ou u 3; 80% u cc). h oic uio ciu (39,000x, 15 i) h u i oo i- cou ih o o 0.3 /i. h i- b iou h ih 20 o bu. h bou oi u ih 30 bu B (50, 50 hoh, 10% co, 500 iizo, 8.0). hic ou o u9(1-69)-, u9(1-45)- u9(1-69)-b uii i h, ih io oiicio. Bu B coi 300 h cooi. coi i o o B -i coii 50µ/ ci. o uiicio o h cobi cooic oi o o70 (. cii), h o. coi i coii h o-xio co -o70 (ou., 2003) o 37º, u hi coiio, o B -iu, i h ch O 578 o 0.5. ui h iu ih 0.5% uco 0.8, h cuu hi o 18 o 16 h. ocio o h c o i o uiicio. h uiicio ucc i o. h i o i i- chooh. o o h coiio, oi h, h i- cou h ih Bu u ih 5 Oc. h bou i u ih bu B (20 -hoh 300 iizo). cio ih oi oo co uiicio i ioxch chooh o. o quiibio o h 1 i cou, 20 -hoh bu/o, 7.5 u. h uio o ih i b 0 1. h cooic oi o o70 cocio o io io xi hi o ioci b oi i io ciio /io i c- o i io hi o 35 b oi, h couc coi i 4 i i cib i ui 6--o (o, 1984; boo, 1989). ciio ixu (100µ) coi: µ, 20 µ 5x ciio bu (200 i/, 50 2, 10 ii, 7.5), 10 µ 32

33 0.1, 4 µ i uc ihibio (40 U/µ), 20 µ 2.5, 5.2 µ 2.5 7(5`)(5`). i 3 µ o 6-o (25 U/) h ixu icub o 1 h 37. h cii b i 10 µ o i (10 ) 300 µ ho (96%), ciu, h ih 70% ho. ho oio, h u i 2 O u ih 1 µ i (40 U/µ), iquo 80 i u. o io ui bbi icuoc, h ooi ix icub o 60 i 30 : 25 µ, 3.5 µ io ci ix (ihou hioi), 7 µ 15 Oc, 12 µ 35 (10 i/) 100 µ bbi icuoci (o). h o h io cio 5 o co hioi 250 uco. ou icuoc i o h o o ciio io, h ou icuoc o oibii o iuou oi h o. ix (50µ) coi: 25µ bbi icuoc (o), 2 µ cio bu, 1 µ o (6, 3 o 7), 1 µ io ci ix, 2 µ 35 hioi (10 i/), 1 µ i ibouc ihibio (40 U/µ), 2 µ (0.5 µ/µ). h cio icub o 90 i o o oi io io iochoi bii o oi o ou b ic Bii o cuo oi o O o i bu (0.25 / boi u bui (B), 20, 2.5 2, 10 O-O, 7.2) i h c o 1 1 µ X, h iic. h o h bii cio, h O h ih bu (1, 10 O- O, 7.2) coii h iic cocio o. h O i (109,00x, 20 i), oubiiz i bu z b -. o o iob cuo oi io. c. cii iochoi o i 5 io bu (0.5% (/) B, 250 uco, 80, 5 2, 2, 2, 10 O-O, 7.2) o bu (3% B (/), 0.5 obio, 50 -O, 80, 10 Oc, 2 2 O 4, 2.5, 2.5 2, 2, 2, 7.2), ci. h io cio o h iic u o iou i io. o c h iochoi O o bo o h io cio. o o b icubio ih oi () o i o 15 i o ic, oo b iio o ih 1 33

34 o 20-o i ihibio, ci. h o io cio iochoi i (35,000x, 10 i) oubiiz i bu. o bou oi z b -, uoioh hohoii (uji B 1500) io o io o obi io, iochoi u i bu iu 10 i ih bu coii 20 -O, 7.2. o chc h iuio o h ou b, iuocoio ih iboi i ocho b 2 (oub oi i h ib c) o bo xcio bo xcio u o chc hh oi i i io b o i i i oub o. o hi uo, iochoi o io io, i ciuio, u i bu coii 10 - O, O 3, 11.5 icub o 30 i 0º. h ob h ciu o 35 i 109,000x. h oub oi ou i h u cii ih ichoocic ci () h oi i/oci ih h b ou i h. h z b o-iuociiio ( io o iob cuo io iochoi o bii o O) io i i bu (3% B, 1%, 250 uco, 1, 150, 10 O-O, 7.2) o 30 i, u i hi coiio. cii i (15,000x, 15 i), h u icub o 1-3 h ih iboi h -cou o oi -ho b. hi icubio, h b h ih 500 µ i bu, i ih 500 µ 80 ( bu u ih 80 ), 500 µ 10 i-, 7.2. Bou oi u ih bu z b ci o i ibi ih oub oi o o co ci o i ibi ih oub oi o o co o cib bo (Bix., 1999). uo-bou i ibi b uo o hi (., 1999; ji., 2000). i o 13 io ci iu ih o o 10 iu, coi io ci iu o B1, 34

35 i o h cuo b i (β-)2 c. h i ib i oi b o. J. chi- (Bi). h b icub oc ih ho h i ih hi bu ( i-, 7.6) o 10 i. o i o oi bii cii, h b icub ih 150 o h oub cooic oi o o20, o22, o o70 (i oi b. J. Bix, ibu) i bii bu (100, 5% (/) uco, 0.05% (/) 20, 0.05% (/) B, 30 i-, 7.6) o 60 i 25 ih hi. hi (3 i, ) h i-bou oi oo oii iuoi () b ui cho bu (75 i b, iohxoic ci, 0.01% ) o bu ( coii 90 i b coii 300 i b). o oi c ih iboi i h cooi o coo. Bii z b ci io quii ui o u-o o o ic icio b h B1 oi o70 uo u. uii cobi cooic oi o o70 (2 µ) icub ih i- b i bu (20 -O, 100 Oc, 5% co, 5 Oc, 2 / B, 7.5). 30 i icubio ih o hi, h ubou i o b hi h i- b ih xc o bu. iob oi h icub ih h b i bu u ih 2, 5 µ X, 1 o 30 i 4º. h o h i io hiz oi o h cho i h io ixu. o oi uciic bii o i- b, X o biiz o cooio o h oi. h ubou i o b hi ih bu h bou i u o h b b i bu u ih 300 iizo. h bou i z b - uoioh Biochic ho ichoocic ci () ciiio o oi oi o quou ouio cii b i 72% (/) o i cocio o 12.5%. h icub o 20 i o ic, ciu (20 i, 30,000x, 2 ). h cii oi h ih co 35

36 ( 20º), ciu i (30,000x, 20 i). h oi i o 10 i io i bu oiu uh ciiio o oi quou ouio coii oi ix ih 2 o o u ouio o oiu uh (4 ), o cocio o 66%. h icub o 30 i 4 ciu o 10 i, 30,000x, 4. h coii h cii oi io i h oi bu. o h u oiu uh ouio, 76,7 o oiu uh io i 100 i/ 7.0 chi o 4, o h h oiu uh c i oi cocio iio oi cocio i ui Bo (Bo, 1976) iuoobui (Bio-). oi ouio iu ih 1 Bio- (iuio 1:5) icub o 10 i. h bobc u 595 ui 1-c-h h icocu. oi cocio ccu ccoi o cu oci cohoi (-) h oi i o-iio ic b - oci cohoi (-), u ui coiio, cib (i, 1970). h cocio o ci bi-ci i h i cho ccoi o h ocu iz o h oi o b. o 160 x140 c o 1 hic u. h io i µ bu icub 95 o 3 i, bo oi. h cohoi o 25 o 3 h. oi ocu ih u. Bu o -: ci : 5% (/) ci, 0.03% (/) bi-ci, 60 i/ 6.8, 0.05% (/), 0.25% (/). i : 10-16% (/) ci, % (/) bi-ci, 380 i/ 8.8, 0.1% (/), 0.05% (/), 0.05% (/). Boo : 20% ci, 0.13% bi-ci, 475 i/ 8.8, 0.1% (/), 0.05% (/), 0.25% (/). 36

37 bu: 60 i/ 6.8, 2% (/), 10% co, 0.02% (/) bohobu, 5% β-coho Bu-i cohoi (B) o io o oi u o-ui (i) coiio, Bu-i cohoi (B) u (ch, 1991). o hi uo, h iochoi o O, u i 50 µ o Bu (coii h oi ou o ) oubiiz o i 4º. cii i (30,000x, 10 i), 5 µ o bu o h oub i, ix o 3 i i o oo 6%-13%. Bu o B: ci 48%/Bi-ci 1.5%: ci 48, bi-ci 1.5 i O. ci 30%/Bi-ci 0.2%: ci 300, bi-ci 2 i 1 2 O. -bu: 1,5 6-io--oic ci, 0,15 bi i, x bu: 5% ooi-bii-bu 250, 100 bi-i 7.0, io--oic ci ho-bu: 15 bi-i, 7.0, 50 ici, ih o ihou 0.02% ooi-bii-bu 250. o-bu: 50 bi i, 7.0. Bu : 20 i, 0.1, 50, 1, 10% co, 0.1-1% iioi o oh, 7.4. h o B u o h. h ih icub 96º o oz. h cohoi o 4º. o h i o cohoi, cho bu coii ooi-bii-bu o bu u h o o 1 h 100 h hi o 500. h h bu o h i o o hi o h io ic, h cho bu ih ooi-bii-bu c b cho bu ihou ooi-biibu. oi i oii (440 ), coho ho (), (oo: 50, i: 100, i: 150 ), boi u bui (B), (oo: 66, i: 136 ) u ooi bu ii o - -, h boo h i o, h i i o 30 i,, ih ouio coii 30% (/) ho, 10% (/) 37

38 cic ci, 0.1 (/) ooi-bii-bu 250. h i (i h bu oi b i c bcou) ih 30% (/) ho, 10% (/) cic ci i oih b o --i (o) o c o o o o h o h, co ih ic i o 1-2 h i o oi o iocuo/ b (-Bo) oi i - oo iocuo b ui h i- boi ho (obi, 1979; h-o, 1984). h, h b, ou h o h i (3) icub i bu (20 i, 150 ci, 20% (/) ho, 0.08% (/) ). o h o i c o h o co oo b h b h. hi co ih oh o i ih h cho co. h o 1 /c 2 o 1.5 h. o i icic, h iocuo b ib i ih ocu ouio (0.2% (/) ocu i 3% (/) ). oi i B oo b ui h i- boi ho cib bo. Bo boi, h b ci o 5 i i ho 5 i i bu. cohoi h b ib i ih ooi-bii-bu ouio (30% (/) ho, 10% (/) cic ci, 0.1 (/) ooi-bii-bu 250) o 2 i i o o iuiz h oi. o ii, ouio o 30% (/) ho 10% (/) cic ci u. co oi h ho b hi ih B bu (9 /, 10 i/, 7.4) h b iuoco o h ioci i iuiz b uoioh oi quiicio b uoioh/io hohoii b coii iob oi xo o ö i (uoioh). h i c h ii o b o i quii (io). i, h iocuo b xo o hohoii h ii o h b i ih h hohoi (uji B 1500). 38

39 ocio hic ou o iochoi cuo oi icub i bu (50 Oc, 20 i/, 0.1% iioi, 1, 2 2, 7.4), o o i h c o ih uii O cox o B, o 30 i iou u. h cobi icubio coiu o 8 i 25º. zic cii ihibi b i 4. h oi coi i h cio ixu cii ih z b uoboi oi b iobiiz o h iocuo o b cou b iuiz i coio ih ciic iboi. h o-ciic oi bii i boc ui b icubio ih 5% (/) i i i B bu o 1 h. h iuocoio o o 1 h o o 4, ih ciic iu (1:200 o 1:1000 iuio i i/b). hi h b 3 i (ch 5-10 i), oc ih B, h B ih 0.05% (/) io X-100 i ih B, i icub o 1 h ih oxi cou o o i-bbi- o iou- (iu 1: i i/b). h b h i i cib bo ih uio : 2.5 iohhzi 0.4 -cuic ci i 0.1 i/ 8.5, iuio 1:1 ih 0.018% (/) 2 O 2 i 0.1 i/, 8.5. h uicc cio c ih ö i (uji X). 39

40 3. U 3.1. coiio o oi b h io O cox o iochoi h O cox, h oi oc o h iochoi ou b, i i b ocio o h uc-co oi. o b u ho cuo oi coiz b iochoi oc co h ou b, h icio o iochoi cuo oi ih h O cox z. o o o O cox io. h c o iioi, i, h hoo cox coii o40, o22, o5, o6, o7 h oi co coo o20 o70 cou b io (ü., 1998). h h ioio o i h c o o, oc oi () h o20 o70 ioci o h cox, ui i ioio o h co cox (hi., 1999). hic ou o cobi iochoi cuo uii u i h xi o ii h io o cho quc bii co uu i icuoc o O cox i b o bi i oc h oi o u bii o oi o io O hoo cox, h iio bhio o uco i o h uii O hoo cox, h cuo oi u9(1-69)- (uio oi coii o h quc o ubui 9 o h o- (io ci iu 1-69) u o ou ihoo uc ()), h uc b h z. cuo h o o h i hi h O cox ou o h boo o h i (i. 4, u ). cubio o h cuo oi ih h O cox io o ciuio u i h co-iio o h coo (i. 4, o ). h ciici o bii o i h ooi xi: i) uo icubio o xc cuo ih h O hoo cox jo o i i ubou (i. 4); hu, h bii i o h O cox cou b u, ii) (ihou quc) i o bi o h O cox ( o ho), iii) u oi, hh o i ob i ihibio o uo i uc cboxh cbui (), i o bi o h O cox ( o ho). hu, h bii ob o h iochoi i i i o occu o u uo oi. c, oub O hoo cox c bi cuo oi i ciic. houh o ii ocu ch o h uii 40

41 O hoo cox, ic bi ucu o o b c o ici bii o oi o h O cox. o70 u9- B O cox o40 u9- o22 o70 O cox+ 5 µ u9- O cox+ 15 µ u9- o40 u9- o22 uco coc. i. 4. i o bii o iochoi cuo oi o io oub O hoo cox b uco i ciuio. O hoo cox u9(1-69)- icub ih (, B) o oh (, ). ch c, o 20 i 4. h ou o O hoo cox 24 µ i ch, h ou o u9(1-69)- 10 µ i, 5 µ i 15 µ i. 16 h ciuio, 140,000x o 0% o 35% uco i, cio (100 µ) coc,, cii oi z b - ooi ii. h quc o o b bou o h io cox bu o b io h io ch? o hi quio o o i hh bii o h O cox c oc cuo i c b iochoi oci i (). h oi u9(1-69)- u9(1-45)- (io ci iu 1-45 o 1-69 o u9 u o ou ). cubio o cuo oi ih i h bc o O cox o i h c o B coo u i co o co o o h quc o h oi. co, uo icubio o h oi ih h O hoo cox, jo, i o, o h cuo ocu o c b (i. 5). 41

42 u9(1-69) u9(1-69) -B - i. 5. h O cox i ocio o h quc o i iccib o ; h ocio qui uoi o u oi. () h io O hoo cox c oc h quc o oi o i iccib o. u9(1-69) - cuo oi, u9(1-69)- u9(1-45)- (3 µ, ch), icub ih 15 µ O hoo u9(1-45) - cox (o 15 µ B coo) o 30 i (2 µ) o 8 i 25, oo b iio o 4 o o cii. oi z b -, bo B iuoco ih iboi i ou. O hoo X (B) biizio o h u iuc h ocio i. u9(1-69)- (3 µ) icub ih o ihou O cox (60 µ) o 30 i 25. X + +i (1 µ) i hi icubio ixu (b.) o icubio o 10 i 0 (.). coii O cox h i o o h O hoo (15 µ/) o 8 i 25 hi o h oh i (20 µ/) o 15 i 0. u9(1-69) - i ihibi ih 1. uh bo. () Uoi o h u i qui + +i o chi o ocio i. u9(1-69)- (3 O hoo µ) (u ) icub i h bc o c u9(1-69) o O cox (60 µ) o 30 i 4 o 10 i -B 25. i bo. u9(1-69)- b (3 µ) (o ) icub i h bc + +i o c o O cox (30 µ) o 30 i 25. i bo. oi +O hoo cox (µ) z bo iuoco ih iboi i b. () Uoi o oi bo hi icio ih h O cox ic hi x o ocio i. oi (u9(1-69)- u u9(1-69)-b o, ch 3 µ) icub i h bc o c o h iic + +i ou o O hoo cox o 30 i 25. h iic (+U) h oi icub i i 8 u o 30 i 25 h iu io h bii cio. uh bo., cuo u o o oi. - +B -. b. +U +B +O hoo +O hoo ox ox b.. +U 42

43 h i ocio o h cuo i o uoi/bii o h u o chc hh h ob ocio i o h uoi o h oi, bii oci o i h c o bc o hox (X), i h biiz h o cooio o h oi. X bo icubio o h cuoo ih h O cox o o biizio o h oi, h cuo o oc i (i. 5B). hu, h quc c h ch i hi o bco iccib o o h h oi i uo. hi uoi ii b i io o h oi. h X bii o h cuo o h O cox, ii iuio ob h o cio o h cuo oc i uo (i. 5B). o chc i O cox c uo oi o c o biiz hi uo cooio, h uoi cio ui iou u. i ocio uoi ob h h iii icubio 25, bu o 4. hu, h io O cox i i bii o biiz h uo cooio o h oi 25 i iu, i.. i ic iochoi ou b ic (., 1995c; o., 1998b), (i. 5, u ). o chc i h O cox c biiz h uo cooio o o b oi h, h bii ocio o u9(1-69)- u9(1-69)-b co. B i ibouc o 110 io ci iu; i o h h oou uoi o 30 i 30 o h h o b, (ouch., 1997). 25, cio o u9(1-69)-b ocu i oc io h ch uo, u b ocio i i, ci. ih i hih bii, h cuo coii h b oi oc ci h h -coii oi (i. 5, o ). hu, i c b cocu h h uoi oc i i h iii i h ocio oc. o i hi oi boh cuo oi i u i 8 u h icub ih h O cox. h uo cuo ( b i io) oc i o x h h i cuo; o oc oi ob uio (i. 5). h u coi h o h quc o i oc o o uoi. 43

44 h co o i o i ocio uoi o ii i h oi co i o i ocio uoi o h oi, h O hoo cox O uii o. c iochoi ih o cocio o oi, hich u i h c o o70 o22 o o o6 (i. 6 6B, ci). U h coiio h u-h o20 o c i h cox, hi iu ou o chciic ooic i ob (i. 6). o40 ic u h coiio. Boh cox O o b o oi ocio i (i. 6 6B, ci). o hi xi i cocu h o40 h c o i h cci o h oub cox o oc h quc io h ocio o. o70 o40 u9 - o B + O + O () B o70 o40 u9- +O + +O () +O +O () o20 o6 o22 i. 6. co oi o qui o ocio o i oc i. () u9(1-45)- (3 µ) icub o 30 i 4 ih 15 µ o ih O hoo cox o O hoo cox ih oi, o ih B coo. h o 8 i 25. oi z b -; boi iuocoio ih iboi i o o coo o. h b cooi o h oo () i () o o o70 o cuo u o o h cuo oi (, ci) iic. (B) u9(1-69)- (3 µ) icub o 30 i 4 ih 15 µ o ih O hoo cox o O hoo cox ih oi, o icub o 20 i 25 ih 200 µ o ih O o O ih oi. uh bo ii qui o h o ucio o h O cox B o h u i i. 6 i i xc h h O co cox i o b o uo i oc cuo oi. uii, icubio ih h O co cox, h cuo cou o b oc i (i. 7). 44

45 +O ox - +B +oo +o +o +ii +ii B + O hoo cox O co cox O co cox+i. O o40 0 (µ/) i. 7. iio o hohoii o h ocio cii o h O co cox; hohoii c h cooio o h O co cox. u9(1-69)- (3 µ) icub i h bc o c o O cox (30 µ) o 30 i 25. h iic hohoii (200 µ) icub ih O co cox o 1 h 4 bo iio o h oi. coo hohoii ihou O cox icub ih h oi. h o h iic o 8 i 25., cuo u o o oi. (B) hohoii c h cooio o h O co cox. O hoo cox (10 µ), O co cox (10 µ) ih o ihou hohoii (67 µ), o O (80 µ) ih h iic ou o oi () o 15 i 0. h ihibi b, oi z b -, boi iuocoio ih iboi i o40 o. h co cox uii oubiizio o h iochoi i bu coii i o iioi, hich u o h uiicio o h O hoo cox. ou h h hohoii co o h O co cox i uch o h h o h O hoo cox. h ou o hohoii 4 o/o O cox i h -oubiiz cox 168 o/o O cox i h iioi-oubiiz cox. h o cii o h O co cox ho u o h o o ucu ii ocu. hohoii h b ho o io o i oi ocio ( oo uij, 2000). uch ii ocu cou b qui o h o ucio o h cox, ii o h ii h o-bi ii iu h cii o h coiu bci oi oc ( o., 2000). ii o h iochoi ou b xc o h O co cox i 45

46 o o chc i hih ii co o h cii o hi cox., h cuo icub ih h O co cox ui ih ii i oc i (i. 7). Bi oio o h ocio cii, h hih co o ii o iuc ch i h o h ooic o o40. h o h O co cox ui ih ii b o co h o h i cox i h ou b ic. c, ii iuc o i-i cooio o h O cox hu cu h cox o uo ocio, hich u i ocio i (i. 7B). oh, uii cuo ou o bi ici o io O cox i h bc o cho ii i bi ucu. iio o coiio, h uii cox i b o h quc o h cuo o xo ocio h cox o ocio iccib o, o i io h ocio o coiio o B1 cuo b h O cox B1 oi i iochoi i b oi b o h hih co, h oi i (B, 1997; ich, 1998). h B1 oi i cho i h iochoi i b i i b oi. ho -i i i xo io h ib c, hi h bu o h oi i i h ix (i ou - i oiio). h b cho i oo b ho oii ch (i.8) (öch., 1996). O i. 8. ooo i i i 45 o B1. ou quc cou b iii i B1: (i) h -i iu 1-44, (ii) ix b oi io ci 45-68, (iii) quc-i hix (iu 69-83), (i) io uxii io iu oi oi 46

47 B1 ic ih h ou iochoi b i boh coic hohobic icio o u h icio o B1 cuo ih h ou iochoi b, hbi oi coo o h i 126 io ci iu o B1 u o (B1(1-126)-) hiz i io icub ih O io o. c iochoi. hi uio oi ho iou o b coc o o h i b io io iochoi ih icic ii o h o uhic B1 oi (öch., 1996). h bii oi o hi cuo oi co o ho o ix i cuo, u9-. h h bii o h ix-i cuo, u9- o u co -ii, iiic oio o B1(1-126)- ocu i bou o O ih 200 (i. 9). h b ho h u9-, h h ci i (0, +X), oo oci ih h O cox, h h icubio o i h c o o cocio (o., 1998b). ho, hohobic icio o o io o i ii bii o B1(1-126)- u h coiio. bou h o h -i B1(1-126)- ocu coi o oi (i. 9). c, h hohobic icio obb i b h B1 oi o h uio oi o b h o oi. h h bii o o occu 25, uoi o h oi ic o ih hih bu ob ih boh cuo ( o ho) h io O cox c bi h cuo o B1 o chc i h icio o B1 ih h ou b i i b h O cox, iuociiio xi o. h cuo o B1 B1(1-126)- icub ih O; h O cox io b iuociiio, z o bou oi. ubi cio o boh cuo co-iuocii ih h O cox oi bii 25 h ih hih bu (i. 9B). o ou o cuo oci ih h O cox h h bii z 0. h i b bii o B1 ( B1(1-126)-) o h O cox 0 ( o i. 9) i o h oo bii o h ix i cuo, u9- u ii coiio (o., 1998b). 47

48 %obii20 % o xiu B1(1-126)- u9(1-69)- 100 bou 80 o ih () B 0, 20 25, 200 B1(1-126) - B1 o (10%) iu i-o40 i-o22 iu i-o40 i-o22 o (10%) iu i-o40 o- o- o (10%) +O -O B1 i-o40 i-o22 oio u9- () i +i i-o22 i. 9. cio o h i i o B1 ih h O cox () B1(1-126)- u9(1-69)- icub ih. c O o 20 i 0 i h c o X/. O h ih bu coii ih 20 o 200. h O io, u i bu, h uio h. O h ih i 0 ( o i), hi h co h 0 ( bou ). oi h z b - hohoii. h ou o oi bou 20 o 100%. (B) oi bou o O c b co-iuocii ih coo o h O cox. iob B1 B1(1-126)- icub ih O 0 i h c o X/ 20, o 25 i h c o 200 bc o X/. h bii cio O io u i bu. uociiio o ih iboi i i o22, o40 o ih iu u. o coo h bii, iquo o bo h co-iuociiio cii ih (o). () cuo o B1 ic ih uii O cox. iob cuo o B1 icub o 20 i 25 ih uii O co cox. h cio ixu i cib i (B) iuociiio o. o xcu uciic icio, iuociiio o o i h bc o h O cox ( -O ). () ix-i cuo c co ou h cuo o B1(1-126)-. iob cuo o B1(1-126)- icub o 20 i 25 ih ih iochoi ( - ) o ih iochoi icub ih h iic ou o oi o 2 i o ic. h iochoi ih ic (u ) o ih i bo icubio ih oi (o ). h o h io cio iochoi ih oi, h, io, z b -. 48

49 h i o o ob h icio ih bi ucu i o quii o icio o ix-i-i oi ih h O hoo cox (i. 4 5). o chc i hi i i o o oi ih i i i, i B1, iob B1 icub ih h uii O co cox h bii o iboi i o coo o cii i, (i. 9). B1 cou b cii ih iboi i o40 o22, ui h h B1 cuo i ici ih h O cox ui i io io iochoi., ih ii i bi o o oh oi i h ou b qui o h coiio o h B1 cuo b h O cox h io h o h B1 cuo o h B1 cuo u h io h? o hi quio, h cci o oi i o h ix, u9-, o co ou h io o h B1 cuo. hi och u bo o o h ou b oi u h O cox o hi iio io h ou b (o u, 1999; boi., 2001; i., 2001). h iio o chic ou o u9- ui io o iob B1(1-126)- o iochoi u i o ucio o io o h iob cuo (i. 9, u ). co, iio o u oi i o (ihou quc) o h o io c o h io o B1(1-126)-. h ih ihibio c o o u o h cic iochoi i i ihi hi oi (u., 1987), o o hohobic icio o h O cox ih uo ocu. c, B1 cuo h u h io h h o coo i hi ocio h. o i ou i h ihibio c i u o o coiio o bii i o h co o h ou b, o o o h io o, iochoi ih i o o h uc co icub ih iob B1(1-126)-. U h coiio cuo h o co o io h b ho o iochoi o u o "b io" hich occu b hi ic icio ih h io o (., 1989). hi o u o B1(1-126)- (i. 9, co i i u o ). h c o xc ub u9- h o B1(1-126)- io o uc (i. 9, o ). hu, h io o B1 i o io co o coo o h ocio o. 49

50 h co oi o70 o20 io i h coiio o h B1 cuo o ii h o co ubui h coibu o h coiio o B1, h cooic oi o o20 o70 boc b icubio o iochoi ih ciic. h io o boh B1(1-126)- h coo cuo, u9(1-69)-, o iochoi o uc uo iio o i ih o20 o o70, bu o b uii o iu u (i. 10). B1(1-126) - ibo α -o20 o20 α - o70 u9- i. 10. cuo o B1 ic ih co coo o h O cox. iboi i io co c ihibi io o B1. iochoi io o. c icub ih io o iu u (), iu i o 20, o iu i o 70. ch h iquo uh icub o 20 i 25 ih ih B1(1-126)- o ih u9(1-69)- o coo. h io cio ih oi, io z b -. h ihibio c o iboi i o70 o h io o u9(1-69)- uxc. b h hi c i u o ic hic h O cox. h io o o70 i h bii o B1 o iochoi i ih i obio h o70 oo ouci bii io o cocho c 1, oh i b oi. o70 i o o oo ouci bii io o cuo o i b oi ih i io i (i., 1993; cho., 1994). ho i h ici io o B1 qui boh co, o20 o70. o obi o ioio o h icio o h B1 cuo ih ciic o coo chic co-ii xi o. iob B1 o B1(1-126)- cuo ccuu io ii i O h hoobiucio co-ii 1,5-iuoo-2,4-iiobz (B) o iucciii ub (), ci. Uo iio o B co-ii uc o B1 o o20, o22, o40 ob (i. 11). 50

51 o (% o x.) B - + B α-o20 * * * uociiio α-o22 α-o o i (i) i (i) Bou oi (% o iu) uociiio B1 u o70 +o B1 * α-o70 α-o70 (5x x.) i. 11. cuo o B1 ic ih co coo o h O cox. () B1 i i h icii o o20, o22, o40 o i iio h. iob B1(1-126)- cuo icub ih io O o 30 i 0. O io u i bu. O iquo o ic ("-B") hi h chic co-i B o h oh o 40 i o ic. iquo ubjc o iuociiio ih iboi i o20, o22, o40 o ih iu u (). o-i uc o B1 o o oi b b i. (B) B1 i i h icii o o70 o i iio h. iob B1(1-126)- cuo icub ih io O o 2 i 0. O i o iquo o ic ("-") hi h chic co-i o h oh o 40 i o ic. iquo ubjc o iuociiio ih iboi i o70 o ih iu u (). o-i uc o B1 o o70 i b b i. o xou o h iuociiio ih o70 i o ci. () h o70 u uio c io o B1. iob cuo o B1 u9- icub 15 o h iic i io ih iochoi o ih o70 u u (o70) o i i (). h o h io cio oi, iochoi io, z b -. h o oc b o B1 u u9- quii. Bc qu: i- iochoi; bc i; iochoi o h o70 u u. () Bii o iochoi oi o uii o70 cooic oi. h uii cooic oi o o70 bou o i- cou. h iob oi icub ih h bou oi o 30 i 4. hi, h bou oi u ih bu z b -. h o ou o ch oi o 100%. 51

52 h o20-coii uc oi obb bcu u h coiio o h bii (0 ) ociio o B1 ih h co h h ih o coo i o. Ui co-ii uc o B1(1-126)- ih o70 c (i. 11B). c, hi xi uo h i h boh co, o20 o70, i h icii o h B1 cuo i i. o o ucio o o o70 i h io o B1, iob B1 (o u9- coo) io io iochoi io o ih i i o o i ci o70. h h coo cuo (u9- ) io io h o70 o h i iochoi ih ii icic, h x o io o B1 io h i o uc o bou h (i. 11). hi ucio i ii o h o o -o ub o o70,, (i., 1993). h cci o o70 o bi h cuo o B1 uh. h i io o h cooic oi o o70 co io o-xi co i. coi (ou., 2003). h oub oi uii bou o i- b. h cobi oi cou bi ciic iob B1 cuo. coo, o70 ic ih h o ub, hi h cooic oi,, bou o bcou (i. 11). Boh B1 cuo coi hohobic ch hc h o uciic bii o h i- b (i. 11). h io o o70 i h coiio o h B1 cuo i uo b xi ih couc coo o io ci iu o B1 u o. bo, hi couc c b ici coi o o70 iuocii b iboi i h oi (i ). oh, h u c o h o i io h B1 i coiz b h io co o h io i o B1 h io o io ci iu o B1 coi o ui ucu ; hohobic ch ( ) h o i o h i b o h oi, hihiic α-hix ( ) h b quc. iou o h ho h boh i o h o io oi o h oi (öch., 1996). o i h i B1 hich bi o h co coo o h O cox i c o (i. 12). 52